Produzione di siero autologo condizionato modificato e valutazione ex vivo del suo potenziale cicatrizzante nell'epitelio corneale murino
Summary
Questo articolo descrive un protocollo per semplificare il processo e rendere meno costosa la preparazione del siero autologo condizionato (ACS). Non sono necessarie siringhe speciali o perle di vetro rivestite in superficie. Inoltre, l’ACS modificato (mACS) ha vantaggi competitivi rispetto al siero autologo convenzionale nella guarigione della ferita corneale degli occhi murini ex vivo.
Abstract
Le terapie topiche derivate dal sangue umano sono state un vantaggio per i medici negli ultimi decenni. Il siero autologo (AS) e il plasma ricco di piastrine (PRP) sono arricchiti in fattori di crescita epiteliotropici essenziali nella guarigione delle ferite corneali. A differenza dell’AS, il PRP si basa su un sistema di centrifugazione differenziale, producendo più fattori di crescita derivati dalle piastrine. Il siero autologo condizionato (ACS) non solo preserva la preparazione di AS e PRP, ma si concentra anche sulle proprietà immunomodulanti, che sono importanti nelle malattie infiammatorie.
La mancanza di protocolli standardizzati e gli elevati costi di preparazione sono limitazioni per l’applicazione clinica di ACS. Questo esperimento video dimostra una procedura operativa standard per la preparazione di colliri a siero autologo condizionato modificato (mACS). In primo luogo, il glicerolo è stato aggiunto nelle siringhe di eparina come stabilizzatore delle cellule del sangue durante l’incubazione ipossica. Per attivare le cellule del sangue, è stata avviata un’incubazione di 4 ore a 37 °C. Quindi, i campioni di sangue sono stati centrifugati a 3.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la filtrazione del surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm, i colliri mACS sono stati completamente preparati.
Un tentativo di prova dell’effetto terapeutico del mACS ha dimostrato che può avere vantaggi competitivi rispetto alla SA convenzionale nella guarigione della ferita corneale negli occhi di topo ex vivo . L’AS utilizzato in questo studio è stato preparato in base agli studi pubblicati e alla pratica clinica nel nostro ospedale. Pertanto, l’efficacia del mACS sulle malattie della superficie oculare potrebbe essere valutata nella ricerca futura attraverso studi in vivo sugli animali e studi clinici.
Introduction
Gli effetti terapeutici del siero autologo (AS) nelle malattie dell’occhio secco sono stati segnalati per la prima volta nel 1980 da Fox et al.1. Si ritiene che sia la proprietà lubrificante che i componenti biochimici epiteliotropici essenziali nell’AS, imitando le lacrime naturali, favoriscano la proliferazione delle cellule epiteliali corneali. Negli ultimi decenni, diversi studi sono stati eseguiti su questa base. I componenti trofici includono il fattore di crescita epidermico (EGF), la vitamina A, il fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e altre citochine. È interessante notare che il siero è ricco di TGF- β e vitamina A, che si ritiene svolgano un ruolo fondamentale nella proliferazione epidermica 2,3,4,5. Inoltre, nel trattamento di pazienti con malattie della superficie oculare, diversi studi hanno mostrato alcuni vantaggi del collirio AS negli esiti riferiti dai pazienti, altri parametri oggettivi dell’occhio secco 6,7 e risultati microscopici come la densità cellulare8. Gli studi di meta-analisi hanno rivelato che potrebbero esserci alcuni benefici nel migliorare le sindromi del paziente con il trattamento con collirio AS, ma mancano ancora risultati e osservazioni a lungo termine 9,10.
A differenza dell’AS, il plasma ricco di piastrine (PRP) deriva dall’aggiunta di un anticoagulante durante la preparazione, con ulteriore centrifugazione differenziale e attivazione chimica delle piastrine. Rispetto all’AS, numerose sostanze chimiche e fattori di crescita, come TGF-β, fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) ed EGF, sono presenti nel PRP. È stato anche applicato alle malattie della superficie oculare con benefici clinici nel sollievo dai sintomi11.
Il legame incrociato tra difetti epiteliali e infiammazione è complesso. In particolare, l’immunofisiopatologia è un altro problema importante nelle malattie della superficie oculare. Si ritiene che le citochine pro-infiammatorie, come IL-1β e IFN-γ, siano mediatori cardine nelle cascate infiammatorie12. Si aprono così nuove vie di trattamento basate sulla comprensione del meccanismo immunitario. Le strategie per fermare questo processo infiammatorio, compresa la produzione di antagonisti del recettore dell’interleuchina-1 (IL-1Ra) e altre citochine antinfiammatorie, possono anche svolgere un ruolo importante nelle malattie della superficie oculare13,14,15.
Dal 1998, Orthokine, un siero autologo condizionato commercializzato (ACS), è stato utilizzato clinicamente in pazienti ortopedici affetti da osteoartrite (OA), artrite reumatoide (RA) e disturbi spinali13. Rispetto a AS e PRP, il trattamento con perle di vetro rivestite chimicamente e l’incubazione ipossica per attivare i monociti sono le caratteristiche specifiche di ACS16. Teoricamente, più fattori anti-infiammatori possono essere secreti aggiungendo stress di sopravvivenza alle cellule, con conseguente maggiore concentrazione di componenti immunomodulanti essenziali, tra cui IL-1Ra. Sono stati riportati anche i migliori benefici terapeutici dell’ACS nell’OA, rispetto all’AS,17. Le malattie della superficie oculare condividono sfondi immunitari simili con le malattie infiammatorie ortopediche per alcuni aspetti. Pertanto, sulla base dei risultati positivi della terapia derivata dal sangue umano in campo ortopedico, l’ACS potrebbe avere vantaggi rispetto ai trattamenti convenzionali nella pratica clinica dalle proprietà epiteliotropiche e immunomodulanti. Sebbene l’ACS sia stato ampiamente utilizzato nelle malattie infiammatorie ortopediche, le sue applicazioni cliniche in oftalmologia devono ancora essere esplorate, il che può essere ostacolato dal suo costo elevato, dalla mancanza di supporto della letteratura e dalla mancanza di standardizzazione del processo di preparazione, con conseguente prestazioni diverse.
In questo articolo video, è stato dimostrato un metodo nuovo, economico e conveniente per generare l’ACS modificato (mACS), o plasma ricco di fattori di crescita (PRGF), producendo una soluzione colliria con un valore pratico comparabile agli ACS commercializzati. Le idee chiave di aggiungere anticoagulanti e innescare le cellule del sangue per secernere citochine antinfiammatorie mediante incubazione stressata sono state mantenute, ma a differenza dei metodi indotti chimicamente, come quelli basati su perle di vetro rivestite di CrSO4 e kit commerciali, lo stato di stress critico è fisicamente indotto dall’incubazione ipossica in questo metodo. Inoltre, il glicerolo è stato aggiunto per fornire ulteriori benefici, tra cui un aumento della stabilità della membrana delle cellule del sangue, il mantenimento di una corretta pressione del fluido extracellulare osmotico18 e un’appropriata fonte di nutrienti in condizioni ipossiche che evitano di sovraccaricare le cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, viene descritto un protocollo per la preparazione di mACS e viene ulteriormente dimostrato il beneficio del collirio mACS nella guarigione delle ferite dei modelli animali. La modifica cruciale di questo protocollo mACS è l’aggiunta di circa 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% in ciascuna provetta, che crea condizioni ipossiche adeguate durante l’incubazione di 4 ore a 37 °C. Questa impostazione fornisce all’AS uno stress adeguato e sollecita le cellule a secernere i fattori di crescita necessari…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Ya-Lan Chien e Chia-Ying Lee per l’eccellente assistenza tecnica, e OnLine English company per l’edizione linguistica. Questo studio è stato finanziato in parte dal Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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