Summary
Este artículo describe un protocolo para simplificar el proceso y hacer que la preparación de suero condicionado autólogo (SCA) sea menos costosa. No se necesitan jeringas especiales ni perlas de vidrio recubiertas superficialmente. Además, el SCA modificado (mACS) tiene ventajas competitivas sobre el suero autólogo convencional en la cicatrización de heridas corneales de ojos murinos ex vivo.
Abstract
Las terapias tópicas derivadas de la sangre humana han sido una bendición para los médicos en las últimas décadas. El suero autólogo (EA) y el plasma rico en plaquetas (PRP) están enriquecidos en factores de crecimiento epiteliotrópicos que son esenciales en la cicatrización de heridas corneales. A diferencia de AS, PRP se basa en un sistema de centrifugación diferencial, produciendo más factores de crecimiento derivados de plaquetas. El suero autólogo condicionado (SCA) no solo preserva la preparación de AS y PRP, sino que también se centra en las propiedades inmunomoduladoras, que son importantes en las enfermedades inflamatorias.
La falta de protocolos estandarizados y los altos costos de preparación son limitaciones para la aplicación clínica de SCA. Este experimento en video demuestra un procedimiento operativo estándar para preparar gotas oftálmicas modificadas de suero autólogo condicionado (mACS). Primero, se agregó glicerol en jeringas de heparina como estabilizador de células sanguíneas durante la incubación hipóxica. Para activar las células sanguíneas, se inició una incubación de 4 h a 37 °C. Luego, las muestras de sangre se centrifugaron a 3.500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm, las gotas oftálmicas mACS se prepararon completamente.
Una prueba tentativa del efecto terapéutico de mACS mostró que puede tener ventajas competitivas sobre la EA convencional en la cicatrización de heridas corneales en ojos de ratón ex vivo . La EA utilizada en este estudio fue preparada de acuerdo con los estudios publicados y la práctica clínica en nuestro hospital. Por lo tanto, la eficacia de mACS en enfermedades de la superficie ocular podría evaluarse en futuras investigaciones a través de estudios in vivo en animales y ensayos clínicos.
Introduction
Los efectos terapéuticos del suero autólogo (EA) en las enfermedades del ojo seco fueron reportados por primera vez en la década de 1980 por Fox et al.1. Se cree que tanto la propiedad lubricante como los componentes bioquímicos epiteliotrópicos esenciales en la EA, imitando las lágrimas naturales, benefician la proliferación de células epiteliales corneales. En las últimas décadas, se han realizado varios estudios sobre esta base. Los componentes tróficos incluyen factor de crecimiento epidérmico (EGF), vitamina A, factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y otras citocinas. Curiosamente, el suero es rico en TGF-β y vitamina A, que se cree que desempeñan un papel fundamental en la proliferación epidérmica 2,3,4,5. Además, al tratar a pacientes con enfermedades de la superficie ocular, varios estudios han demostrado algunas ventajas de las gotas oftálmicas AS en los resultados informados por los pacientes, otros parámetros objetivos del ojo seco 6,7 y hallazgos microscópicos como la densidad celular8. Los estudios de metanálisis revelaron que podría haber algunos beneficios en la mejora de los síndromes del paciente con el tratamiento con gotas oftálmicas para la EA, pero aún faltan resultados y observaciones a largo plazo 9,10.
A diferencia de la EA, el plasma rico en plaquetas (PRP) se deriva de la adición de un anticoagulante durante la preparación, con una centrifugación diferencial adicional y la activación química de las plaquetas. En comparación con la EA, numerosos productos químicos y factores de crecimiento, como TGF-β, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y EGF, están presentes en PRP. También se ha aplicado a las enfermedades de la superficie ocular con beneficios clínicos en el alivio de los síntomas11.
El vínculo cruzado entre los defectos epiteliales y la inflamación es complejo. En particular, la inmunofisiopatología es otro tema importante en las enfermedades de la superficie ocular. Se cree que las citoquinas proinflamatorias, como IL-1β e IFN-γ, son mediadores fundamentales en cascadas inflamatorias12. Se abren así nuevas vías de tratamiento basadas en la comprensión del mecanismo inmune. Las estrategias para detener este proceso inflamatorio, incluyendo la producción de antagonistas del receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) y otras citoquinas antiinflamatorias, también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades de la superficie ocular13,14,15.
Desde 1998, Orthokine, un suero condicionado autólogo (SCA) comercializado, ha sido utilizado clínicamente en pacientes ortopédicos que sufren de osteoartritis (OA), artritis reumatoide (AR) y trastornos de la columna vertebral13. En comparación con AS y PRP, el tratamiento con perlas de vidrio recubiertas químicamente y la incubación hipóxica para activar monocitos son las características específicas de ACS16. Teóricamente, se pueden secretar más factores antiinflamatorios al agregar estrés de supervivencia a las células, lo que resulta en una mayor concentración de componentes inmunomoduladores esenciales, incluida la IL-1Ra. Los beneficios terapéuticos mejorados del SCA en la OA, en comparación con la EA, también han sido reportados17. Las enfermedades de la superficie ocular comparten antecedentes inmunes similares con las enfermedades inflamatorias ortopédicas en algunos aspectos. Por lo tanto, sobre la base de los resultados exitosos de la terapia derivada de la sangre humana en el campo ortopédico, el SCA podría tener ventajas sobre los tratamientos convencionales en la práctica clínica por sus propiedades epiteliotrópicas e inmunomoduladoras. Aunque el SCA ha sido ampliamente utilizado en enfermedades inflamatorias ortopédicas, sus aplicaciones clínicas en oftalmología aún necesitan ser exploradas, lo que puede verse obstaculizado por su alto costo, falta de apoyo de la literatura y falta de estandarización del proceso de preparación, lo que resulta en un rendimiento diverso.
En este artículo de video, se demostró un método novedoso, rentable y conveniente para generar el ACS modificado (mACS), o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), produciendo una solución de gotas para los ojos con un valor práctico comparable al ACS comercializado. Se mantuvieron las ideas clave de agregar anticoagulantes y activar las células sanguíneas para secretar citoquinas antiinflamatorias mediante incubación estresada, pero a diferencia de los métodos inducidos químicamente, como los basados en perlas de vidrio recubiertas de CrSO4 y kits comerciales, el estado de estrés crítico es inducido físicamente por la incubación hipóxica en este método. Además, se agregó glicerol para proporcionar beneficios adicionales, incluido un aumento en la estabilidad de la membrana de las células sanguíneas, el mantenimiento de una presión adecuada del líquido extracelular osmótico18 y una fuente adecuada de nutrientes en condiciones hipóxicas que evitan el estrés excesivo de las células.
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Protocol
La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales al inicio de la sección de protocolo. Todos los protocolos y procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Fundación Médica Chang Gung. Todos los voluntarios fueron informados de la naturaleza de este estudio y firmaron un formulario de consentimiento informado antes de su inclusión. Los consumibles necesarios para todo el procedimiento experimental se presentan en la Figura 1 y la Figura 2, así como en la Tabla de materiales.
1. Preparación de los materiales necesarios para producir gotas oftálmicas mACS
- Prepare 250 ml de solución de glicerol al 10% y mantenga listo un equipo de infusión de alas de mariposa de 21 G, una jeringa de 3 ml sin la aguja y seis tubos de vacutainer de 10 ml que contengan heparina 158 unidades USP listas (Figura 1).
- Conecte la aguja de recolección de sangre de 21 G a la jeringa de 3 ml y extraiga 3 ml de solución de glicerol al 10% en la jeringa preparada.
NOTA: Todos los materiales deben esterilizarse antes de insertar la aguja. - Distribuir la solución de glicerol al 10% en los tubos de vacutainer en secuencia, con aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada uno (Figura 3A).
NOTA: Debido a la presión negativa en el tubo de ensayo, la aguja debe salir inmediatamente después de entrar para distribuir uniformemente 3 ml de solución de glicerol a los seis tubos de ensayo. - Esterilice la piel del paciente con hisopos de algodón estériles con alcohol al 75%. Perforar la vena superficial de las extremidades superiores del paciente con la aguja de recolección de sangre de 18 G. Extraiga 60-70 ml de sangre venosa de la vena superficial en total.
2. Preparación para las gotas oftálmicas mACS
- Inyectar secuencialmente 10 ml de la sangre venosa extraída en cada uno de los seis tubos vacutainer (Figura 3B).
NOTA: Este paso se basa en la presión negativa del vacío para llenar los tubos. Para evitar la alteración de las células sanguíneas y la hemólisis, no aplique ninguna presión positiva. - Colocar los seis tubos vacutainer en la incubadora con una temperatura constante de 37 °C durante 4 h (Figura 3C).
NOTA: El estado hipóxico se mantiene y estabiliza por la presión negativa restante en un tubo sellado que recibió glicerol. - Retirar los tubos de la incubadora después de 4 h y centrifugarlos a 3.500 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
- En este punto, prepare los materiales para la extracción de mACS, incluidos los frascos de gotas oculares esterilizados, una jeringa de 3 ml con la aguja, un filtro de 0,22 μm, una aguja de 18 G y un par de guantes estériles (Figura 2).
NOTA: La mesa de operaciones debe limpiarse con alcohol al 75% para garantizar un ambiente aséptico. El sobrenadante, después de la centrifugación, ya es un producto semiacabado de mACS. - Coloque los seis tubos en el bastidor de tubos y abra las tapas después de completar la centrifugación (Figura 3D).
NOTA: No se requiere esterilidad en este paso. - Póngase guantes estériles y extraiga el mACS uno por uno usando una jeringa de 3 ml con una aguja de 18 G.
NOTA: Tenga cuidado de no extraer la capa inferior de células sanguíneas durante este paso (Figura 3E). - Extraiga la aguja, conéctela al filtro de 0,22 μm y conecte la aguja de recolección de sangre de 23 G, 1,5 pulgadas con la jeringa original de 3 ml a la salida a continuación (Figura 3F).
- Empuje suavemente la aguja a través del filtro de 0,22 μm en los frascos estériles preparados para gotas para los ojos (Figura 3G).
- Repita los pasos anteriores hasta que todos los mACS se hayan filtrado y almacenado en frascos de gotas para los ojos (Figura 3H).
- Conservar las colirios mACS a 4 °C para su uso inmediato; conservar a -20 °C para su conservación a largo plazo.
NOTA: No los conserve durante más de 2 semanas a 4 °C o durante más de 3 meses a -20 °C 9,19.
3. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal murino
NOTA: El siguiente modelo animal ex vivo se basó en la experiencia previa de Hung et al. sobre lesiones mecánicas del epitelio corneal20. Los siguientes pasos deben realizarse bajo el microscopio para crear una herida epitelial corneal bien circunscrita y consistente.
- Anestesiar a los ratones C57BL/6 con 3% -4% de isoflurano. Aplique el punzón de biopsia de piel sobre la córnea central murina, dejando un círculo poco profundo en el epitelio como un margen uniforme de la herida.
NOTA: Sea suave para evitar la ruptura del globo ocular. - Debridar el epitelio corneal dentro del área confirmada hasta la capa de Bowman, con un removedor de anillo de óxido corneal equipado con una rebaba de 0,5 mm.
- Para establecer el modelo animal ex vivo de la herida corneal mecánica, cosechar el globo ocular y preparar bien el cultivo.
- Eutanasia a los ratones primero; Luego, presione suavemente los bordes orbitales superior e inferior de los ratones, introduzca la punta de los fórceps sobre el espacio retrobulbar y saque el globo ocular y sosténgalo por los fórceps.
- Cortar el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar perfectamente el globo ocular.
- Prepare un plato de 96 pocillos con cera derretida en su interior. Cree rápidamente un orificio redondo usando las puntas de las pinzas y luego espere la solidificación.
- Prepare los medios a probar: 0.5% mACS, 0.5% AS para comparación, solución salina normal como control negativo y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
NOTA: mACS se obtiene utilizando el protocolo mencionado anteriormente. - Para el cultivo ex vivo , coloque el globo ocular cosechado en la placa preparada de 96 pocillos. Agregue 200 μL de cada medio en la placa de 96 pocillos.
- Colocar la placa de cultivo de 96 pocillos en la incubadora a 37 °C con un 5% deCO2. Asegúrese de que los medios de cultivo se cambien cada 24 h.
- Para confirmar el efecto secuencial de cicatrización de heridas, controle el área de la herida epitelial bajo el microscopio cada 8 h mediante tinción con fluoresceína.
- Disuelva la fluoresceína en el papel fluoresceína con solución salina normal.
- Deje caer el tinte fluoresceína sobre la córnea central murina, luego obsérvelo y documéntelo bajo un microscopio. Un resultado típico se muestra en la Figura 4.
NOTA: Una gota (aproximadamente 0,05 ml) de colorante fluoresceína es suficiente para la observación.
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Representative Results
La Figura 1 y la Figura 2 muestran los materiales necesarios para el experimento, y la Figura 3 muestra los pasos secuenciales y los productos intermedios exitosos durante la preparación de mACS. Primero, se agregaron 0.5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo estéril de 10 ml (Figura 3A). Luego, se obtuvieron 60-70 mL de sangre venosa del paciente, y se inyectaron 10 mL de sangre en cada tubo (Figura 3B). La sangre del paciente debe someterse a exámenes de laboratorio exhaustivos y regulares antes de la preparación para garantizar que la calidad de la sangre esté a la altura. El producto sanguíneo de baja calidad más común se debe a la dislipidemia, que resulta en una capa superior turbia de suero después de la centrifugación que es difícil de eliminar; no se puede continuar con la preparación adicional de gotas para los ojos (Figura 5A).
A continuación, el tubo de ensayo sellado se coloca en una incubadora a 37 °C durante 4 h (Figura 3C). Después de la incubación y centrifugación, la muestra podría separarse en una capa superior que contiene el producto preliminar de mACS y una capa inferior de células sanguíneas (Figura 3D). Luego se recolectó el fluido de la capa superior. Las técnicas asépticas son esenciales en lo sucesivo. Debido a que el suero es un entorno de reproducción muy nutritivo para los microorganismos, cualquier superficie que entre en contacto con la aguja debe desinfectarse primero con alcohol al 75%, y se deben usar guantes estériles durante el proceso. Es importante destacar que se debe evitar la alteración de las células sanguíneas de la capa inferior al retirar el sobrenadante (Figura 3E).
En este paso, se espera que el sobrenadante sea transparente o amarillo pálido. Sin embargo, si se observa un ligero color rojo, puede haber ocurrido hemólisis y la preparación puede no ser adecuada para los pasos posteriores (Figura 5B). El suero recolectado podría centrifugarse nuevamente para garantizar que el sobrenadante esté libre de glóbulos rojos. El suero se filtró a través de un filtro de 0,22 μm en un frasco estéril de gotas para los ojos (Figuras 3F, G). El producto final, gotas oftálmicas mACS, se refrigeró o congeló lo antes posible, dependiendo del propósito (Figura 3H). Las gotas para los ojos no podían almacenarse durante demasiado tiempo debido a su riqueza en nutrientes lábiles y la falta de conservantes.
En el modelo de curación de superficie ex vivo , la gota ocular mACS mostró un resultado superior en la cicatrización de heridas corneales en comparación con la gota ocular AS. La recolección de los globos oculares de ratones C57BL / 6 se realizó después de crear una herida corneal concéntrica por abrasión física bajo el microscopio. Luego, los ojos de los ratones sacrificados se cultivaron en cuatro medios diferentes, incluyendo solución salina normal pura, DMEM, 0.5% AS y 0.5% mACS.
El medio AS utilizado aquí fue preparado con base en la literatura21 y la práctica clínica en Chang Gung Memorial Hospital Linkou. La sangre venosa, 40 ml en total, se extrajo en tubos de vacutainer de voluntarios después de la esterilización de la piel. No se añadió anticoagulante a los tubos. La sangre se almacenó durante 30 minutos a temperatura ambiente para garantizar una coagulación completa seguida de centrifugación a 3.500 × g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, el AS puro ocupó la capa superior de los tubos, que se diluyó por BSS (solución de irrigación estéril) al 0,5% en este modelo animal ex vivo .
Las heridas corneales se observaron secuencialmente en seis puntos de tiempo diferentes, a saber, 0, 8, 16, 24, 32 y 48 h. Los resultados preliminares mostraron que, a las 16 h, las heridas corneales cicatrizaron más rápido bajo el colirio mACS al 0,5% que los otros grupos. A las 24 h, los grupos de AS al 0,5% y DMEM tuvieron efectos terapéuticos comparables con el colirio mACS al 0,5%. La cicatrización de las heridas corneales, cerca de la recuperación completa, se observó a las 32 h, excepto para el grupo salino normal (Figura 4).
Figura 1: Materiales necesarios para agregar solución de glicerol al 10% en los tubos . (A) Equipo de infusión de alas de mariposa de 21 G. (B) 250 ml de solución de glicerol al 10%. (C) Seis tubos vacutainer de 10 ml que contienen heparina 158 unidades USP. (D) Jeringa de 3,0 ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Materiales para la extracción y filtración del sobrenadante de la muestra de sangre . (A) Un filtro de 0,22 μm. (B) Un frasco de gotas para los ojos esterilizado de 5 ml. (C) Un par de guantes estériles. (D) Una jeringa de 3 ml con la aguja de 23 G. (E) Una jeringa de 20 ml. (F) agujas de 18 G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimientos para la centrifugación sanguínea y preparación para la producción de gotas oftálmicas de suero autólogo condicionado modificado. (A) Se agregaron 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo. (B) La muestra de sangre recogida del paciente se dividió equitativamente en seis tubos de ensayo (sólo uno se muestra en la imagen). (C) Aspecto del tubo de ensayo después de ser colocado en una incubadora a 37 °C durante 4 h. (D) Las capas sérica y de células sanguíneas después de la centrifugación. E) El residuo después de aspirar el sobrenadante. Uno debe tener cuidado de no aspirar la capa inferior de células sanguíneas. (F) El sobrenadante se recoge en la jeringa de 3 ml y se insertan un filtro de 0,22 μm y una aguja de 23 g debajo de ella. (G) La aguja se introduce suavemente en el frasco estéril de gotas para los ojos. (H) Producto final de las gotas oftálmicas ACS modificadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios secuenciales de heridas corneales (áreas verdes en las figuras después de la tinción con fluoresceína) en ojos murinos en cuatro medios de cultivo diferentes a lo largo del tiempo. No se observaron diferencias significativas en el grupo de solución salina, mientras que la cicatrización de heridas (flechas) a lo largo del tiempo se observó en los grupos de DMEM, 0,5% de EA y 0,5% de mACS. En el grupo de mACS al 0,5%, la cicatrización de heridas (flechas) fue significativamente más completa a las 16 h que los tratados con EA y DMEM. A las 24 h, los grupos DMEM, 0,5% mACS y 0,5% AS mostraron efectos curativos adicionales (flechas), especialmente en el grupo mACS. Se observó una recuperación casi total a las 32 h para todos los grupos, excepto para el grupo salino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de productos sanguíneos deficientes después de la centrifugación . (A) Dislipidemia. Los productos defectuosos más comunes se deben a la obesidad o diabetes mellitus, ya que el suero superior contiene grasa alta y colesterol. b) Hemólisis. Este es también un producto subóptimo común. La razón principal puede atribuirse al uso de agujas de pequeño calibre para extraer sangre o al uso de fuerza externa inapropiada para inyectar productos sanguíneos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, se describe un protocolo para la preparación de mACS y se muestra además el beneficio de las gotas oftálmicas mACS en la cicatrización de heridas de modelos animales. La modificación crucial de este protocolo mACS es la adición de aproximadamente 0,5 ml de solución de glicerol al 10% en cada tubo de ensayo, lo que crea condiciones hipóxicas adecuadas durante la incubación de 4 h a 37 °C. Esta configuración proporciona al AS el estrés adecuado y hace que las células secreten los factores de crecimiento necesarios que ayudan a la cicatrización de heridas. El filtro de 0,22 μm puede ayudar a eliminar las proteínas macromoleculares, las células sanguíneas y las impurezas, lo que hace que el producto final sea puro y menos adhesivo.
La sangre se incuba durante 4 h a 37 °C, y se realiza una centrifugación y filtración adicionales. La atención estricta a la esterilidad durante la preparación y el almacenamiento de los productos finales a una temperatura adecuada también es crucial. El alto contenido de nutrientes en los productos de suero final es un excelente medio de cultivo para las bacterias. Por lo tanto, el almacenamiento inadecuado o la contaminación durante la preparación pueden estropear las gotas para los ojos. El mACS contaminado puede causar enfermedades como conjuntivitis o queratitis infecciosa.
La calidad de la sangre del paciente también es importante; por lo tanto, se necesitan pruebas de laboratorio antes de la preparación de mACS para garantizar la seguridad de los productos sanguíneos. Durante la extracción y al operar las muestras de sangre del paciente, los operadores deben ser conscientes de la hemólisis. Cualquier presión durante la preparación puede causar fácilmente hemólisis; Por lo tanto, la jeringa debe tirar y empujarse lentamente durante la recolección de sangre. La hipoxia también debe controlarse para obtener altas concentraciones de factores de crecimiento y citoquinas antiinflamatorias. Con base en la experiencia y estudios publicados previamente22,23, la aplicación de una incubación hipóxica de 4 h es el escenario final. El glicerol podría proporcionar un estrés hipóxico más adecuado a la célula, debido al efecto de estabilización y la presión adecuada del líquido extracelular osmótico que puede proporcionar18. Sin embargo, la concentración óptima de glicerol y cómo se correlaciona con la concentración de citoquinas aún debe verificarse. En el futuro, se justificarán estudios in vivo en animales de cicatrización de heridas y un ensayo de control aleatorio a mayor escala para confirmar su eficacia.
Hasta ahora, la investigación se ha centrado principalmente en la aplicación de productos séricos a las enfermedades de la superficie ocular utilizando AS tradicional y las gotas oftálmicas PRP emergentes24,25,26,27. La EA tradicional sin ningún anticoagulante y sin filtro durante la preparación es ámbar en su forma pura, pero a menudo hace que los pacientes se sientan incómodos debido a su adhesividad. Como resultado, generalmente se usa AS diluido (20% -50%), lo que reduce las concentraciones de los nutrientes. El PRP, sin embargo, es menos adhesivo y generalmente se usa en su forma pura (100%). Informes recientes de la literatura señalan principalmente que el PRP proporciona mejores efectos antiinflamatorios y de cicatrización de heridas que la EA, principalmente debido a su rico contenido en citoquinas antiinflamatorias, factores de crecimiento y su capacidad para atenuar la inflamación inducida por IL-1β16,26. Un ensayo controlado aleatorio realizado por García-Conca et al. ya encontró que la aplicación de PRP en enfermedades hiposecretoras graves o moderadas del ojo seco muestra resultados satisfactorios28. A pesar de que el SCA, como una mejora sobre la EA, rara vez ha sido reportado en enfermedades inflamatorias y degenerativas de la superficie ocular, ha sido ampliamente utilizado en el tratamiento de la artritis degenerativa y la cicatrización de heridas en ortopedia 29,30,31. El ACS más común ha sido fabricado y patentado como un kit comercial 13,32. mACS fue diseñado después de ajustar el proceso de preparación de ACS para combinar las fortalezas de ACS y PRP. mACS se puede producir a un costo más económico porque no se necesitan reactivos especiales, como perlas de vidrio recubiertas deCrSO 4 o cualquier kit patentado, que se necesitan en la preparación de ACS y PRP.
Además de la preocupación económica, las gotas oftálmicas mACS también proporcionaron resultados preliminares satisfactorios en un experimento ex vivo , y pueden ser una alternativa revolucionaria a las gotas oftálmicas PRP actuales y emergentes. Cabe destacar que el SCA ha demostrado mejores resultados que la mayoría de los tratamientos establecidos en enfermedades inflamatorias articulares, tanto cualitativa como cuantitativamente, debido a su capacidad antiinflamatoria y a la mejora de los mecanismos de reparación endógena17. A pesar de que no existe evidencia bibliográfica de efectos terapéuticos del SCA en oftalmología hasta la fecha, es razonable asumir el potencial en su aplicación a pacientes con defectos epiteliales corneales debido a su mecanismo antiinflamatorio y al éxito en ortopedia33. Sólo la EA se comparó con el mACS en nuestro estudio ex vivo ; sin embargo, también se pueden comparar PRP y ACS producidos a través de kits comerciales. La investigación futura en el análisis de los niveles séricos de citoquinas antiinflamatorias y factores de crecimiento en mACS sería útil para confirmar su similitud con ACS o PRP, y la posible superioridad a AS.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Ya-Lan Chien y Chia-Ying Lee por su excelente asistencia técnica, y a la empresa OnLine English por la edición lingüística. Este estudio fue financiado en parte por el Proyecto de Investigación Médica Chang Gung (Subvención No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
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