Denne artikkelen beskriver en protokoll for å forenkle prosessen og gjøre fremstillingen av autologt betinget serum (ACS) billigere. Ingen spesielle sprøyter eller overflatebelagte glassperler er nødvendig. Videre har den modifiserte ACS (mACS) konkurransefortrinn i forhold til konvensjonelt autologt serum i hornhinnen sårheling av murine øyne ex vivo.
Humane blodavledede topiske terapier har vært en velsignelse for klinikere de siste tiårene. Autologt serum (AS) og blodplaterikt plasma (PRP) er beriket i epiteliotrope vekstfaktorer som er essensielle i sårtilheling av hornhinnen. I motsetning til AS er PRP basert på et differensialsentrifugeringssystem, noe som gir flere blodplateavledede vekstfaktorer. Autologt betinget serum (ACS) bevarer ikke bare preparatet av AS og PRP, men fokuserer også på immunmodulerende egenskaper, som er viktige i inflammatoriske sykdommer.
Mangelen på standardiserte protokoller og høye forberedelseskostnader er begrensninger for den kliniske anvendelsen av ACS. Dette videoeksperimentet demonstrerer en standard operasjonsprosedyre for fremstilling av modifiserte autologe betingede serum (mACS) øyedråper. Først ble glyserol tilsatt heparinsprøyter som blodcellestabilisator under hypoksisk inkubasjon. For å aktivere blodcellene ble det startet en 4 timers inkubasjon ved 37 °C. Deretter ble blodprøvene sentrifugert ved 3 500 × g i 10 min ved romtemperatur. Etter filtrering av supernatanten gjennom et 0,22 μm filter ble mACS øyedråper fullstendig forberedt.
En tentativ utprøving av den terapeutiske effekten av mACS viste at det kan ha konkurransefortrinn i forhold til konvensjonell AS i hornhinnen sårheling i ex vivo museøyne. AS brukt i denne studien er utarbeidet i henhold til publiserte studier og klinisk praksis ved vårt sykehus. Derfor kan effekten av mACS på øyeoverflatesykdommer evalueres i fremtidig forskning gjennom in vivo dyreforsøk og kliniske studier.
De terapeutiske effektene av autologt serum (AS) i tørre øyesykdommer ble først rapportert på 1980-tallet av Fox et al.1. Det antas at både smøreegenskapen og de essensielle epiteliotrope biokjemiske komponentene i AS, som etterligner naturlige tårer, fordeler spredning av hornhinneepitelceller. I løpet av de siste tiårene har flere studier blitt utført på dette grunnlaget. Trofiske komponenter inkluderer epidermal vekstfaktor (EGF), vitamin A, transformerende vekstfaktor β (TGF-β) og andre cytokiner. Interessant nok er serumet rikt på TGF-β og vitamin A, som antas å spille en sentral rolle i epidermal proliferasjon 2,3,4,5. I tillegg, ved behandling av pasienter med okulære overflatesykdommer, har flere studier vist noen fordeler med AS øyedråper i pasientrapporterte utfall, andre objektive tørre øyeparametere 6,7 og mikroskopiske funn som celletetthet8. Meta-analysestudier viste at det kan være noen fordeler ved å forbedre pasientens syndromer med AS øyedråper behandling, men langsiktige resultater og observasjoner mangler fortsatt 9,10.
I motsetning til AS er blodplaterikt plasma (PRP) avledet fra tilsetning av et antikoagulant under preparatet, med ytterligere differensialsentrifugering og kjemisk aktivering av blodplatene. Sammenlignet med AS er mange kjemikalier og vekstfaktorer, som TGF- β, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) og EGF, tilstede i PRP. Det har også blitt brukt på okulære overflatesykdommer med kliniske fordeler i symptomlindring11.
Tverrbindingen mellom epiteldefekter og inflammasjon er kompleks. Spesielt er immunpatofysiologi et annet viktig problem i okulære overflatesykdommer. Proinflammatoriske cytokiner, som IL-1β og IFN-γ, antas å være sentrale mediatorer i inflammatoriske kaskader12. Nye behandlingsveier åpnes dermed basert på forståelse av immunmekanismen. Strategier for å stoppe denne inflammatoriske prosessen, inkludert produksjon av interleukin-1-reseptorantagonist (IL-1Ra) og andre antiinflammatoriske cytokiner, kan også spille en viktig rolle i okulære overflatesykdommer13,14,15.
Siden 1998 har Orthokine, et kommersialisert autologt betinget serum (ACS), blitt brukt klinisk hos ortopediske pasienter som lider av slitasjegikt (OA), revmatoid artritt (RA) og rygglidelser13. Sammenlignet med AS og PRP er behandling med kjemisk belagte glassperler og hypoksisk inkubasjon for å aktivere monocytter de spesifikke egenskapene til ACS16. Teoretisk sett kan flere antiinflammatoriske faktorer utskilles ved å legge overlevelsesstress til cellene, noe som resulterer i en høyere konsentrasjon av essensielle immunmodulerende komponenter, inkludert IL-1Ra. De forbedrede terapeutiske fordelene med ACS i OA, sammenlignet med AS, har også blitt rapportert17. Okulære overflatesykdommer deler lignende immunbakgrunn med ortopediske inflammatoriske sykdommer i noen henseender. Derfor, basert på de vellykkede resultatene av human blodavledet terapi i det ortopediske feltet, kan ACS ha fordeler i forhold til konvensjonelle behandlinger i klinisk praksis ved epiteliotrope og immunmodulerende egenskaper. Selv om ACS har blitt mye brukt i ortopediske inflammatoriske sykdommer, må dets kliniske anvendelser i oftalmologi fortsatt utforskes, noe som kan hindres av høye kostnader, mangel på litteraturstøtte og mangel på standardisering av preparatprosessen, noe som resulterer i mangfoldig ytelse.
I denne videoartikkelen ble det vist en ny, kostnadseffektiv og praktisk metode for å generere modifisert ACS (mACS), eller plasma rik på vekstfaktorer (PRGF), som produserer en øyedråpeløsning med en sammenlignbar praktisk verdi for kommersialiserte ACS. Nøkkelideene om å tilsette antikoagulantia og utløse blodcellene til å utskille antiinflammatoriske cytokiner ved stresset inkubasjon ble beholdt, men i motsetning til de kjemisk induserte metodene, som de som er basert på CrSO 4-belagte glassperler og kommersielle sett, blir den kritiske stressstatusen fysisk indusert av hypoksisk inkubasjon i denne metoden. Videre ble glyserol tilsatt for å gi ekstra fordeler, inkludert en økning i stabiliteten til membranen i blodceller, vedlikehold av et riktig osmotisk ekstracellulært væsketrykk18 og en passende kilde til næringsstoffer under hypoksiske forhold som unngår overbelastning av cellene.
I denne studien er en protokoll for fremstilling av mACS beskrevet og fordelen med mACS øyedråper i sårheling av dyremodeller er videre vist. Den avgjørende modifikasjonen av denne mACS-protokollen er tilsetningen av ca. 0,5 ml 10% glyseroloppløsning i hvert reagensrør, noe som skaper passende hypoksiske forhold under 4-timers inkubasjonen ved 37 °C. Denne innstillingen gir AS-et riktig stress og ber cellene om å utskille de nødvendige vekstfaktorene som hjelper sårheling. 0,22 μm filteret kan bidra til å el…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Ya-Lan Chien og Chia-Ying Lee for utmerket teknisk assistanse, og OnLine engelsk selskap for den språklige utgaven. Denne studien ble delvis finansiert av Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |