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Neuroscience

시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다.

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

여기에서 우리는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 세포의 주요 조절자인 키스펩틴 뉴런을 포함하는 뇌 조각에 전체 세포 패치 클램프를 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 키스펩틴 뉴런 활동에 대한 지식을 추가함으로써 이 전기생리학적 도구는 지난 20년 동안 신경내분비학 분야에서 상당한 발전의 기초가 되었습니다.

Abstract

키스펩틴은 시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축의 성숙과 생식력에 필수적입니다. 시상 하부의 아치형 핵뿐만 아니라 전복부 뇌실 주위 핵과 뇌실 주위 핵에 위치한 시상 하부 키스 펩틴 뉴런은 다른 세포 중에서도 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH) 뉴런에 투영됩니다. 이전 연구에서는 키스펩틴 신호 전달이 Kiss1 수용체(Kiss1r)를 통해 발생하여 궁극적으로 GnRH 뉴런 활동을 흥분시키는 것으로 나타났습니다. 인간 및 실험 동물 모델에서 키스펩틴은 GnRH 분비를 유도하고 결과적으로 황체 형성 호르몬(LH) 및 난포 자극 호르몬(FSH) 방출에 충분합니다. 키스펩틴은 생식 기능에 필수적인 역할을 하기 때문에 연구자들은 시상하부 키스펩틴 뉴런의 내재적 활동이 생식 관련 작용에 어떻게 기여하는지 평가하고 이러한 특성을 변화시킬 수 있는 주요 신경 전달 물질/신경 조절제를 식별하기 위해 노력하고 있습니다. 전체 세포 패치 클램프 기술은 설치류 세포에서 키스펩틴 뉴런 활동을 조사하는 데 유용한 도구가 되었습니다. 이 실험 기술을 통해 연구자들은 자발적 흥분성 및 억제성 이온 전류, 휴지 막 전위, 활동 전위 발사 및 세포막의 기타 전기생리학적 특성을 기록하고 측정할 수 있습니다. 본 연구에서는 시상하부 키스펩틴 뉴런을 정의하는 전기생리학적 측정으로 알려진 전체 세포 패치 클램프 기술의 중요한 측면과 이 기술에 대한 관련 문제에 대한 논의를 검토합니다.

Introduction

호지킨(Hodgkin)과 헉슬리(Huxley)는 여러 과학 연구에서 기술된 활동 전위에 대한 최초의 세포 내 기록을 만들었습니다. 이 기록은 직경이 큰 오징어 축삭(~500μm)에서 수행되어 미세 전극을 축삭 내부에 배치할 수 있습니다. 이 연구는 과학 연구에 큰 가능성을 제공했으며, 나중에 활동 전위 생성 1,2,3,4,5,6,7,8의 이온 기초를 연구하는 데 사용 된 전압 클램프 모드의 생성으로 절정에 달했습니다. 수년에 걸쳐이 기술은 개선되었으며 과학 연구 6,9에 널리 적용되었습니다. 1970년대 후반 Erwin Neher와 Bert Sakmann이 시작한 연구를 통해 이루어진 패치 클램프 기술의 발명으로 연구자들은 단일 전극만을 사용하여 거의 모든 유형의 세포에서 단일 이온 채널과 세포막 전위 또는 전류를 기록할 수 있었습니다 9,10,11,12. 패치 클램프 기록은 배양된 세포 또는 조직 절편과 같은 다양한 조직 제제에서 전압 클램프 모드(예: 전압 의존 전류 및 시냅스 전류를 기록할 수 있는 설정 전압에서 세포막을 유지) 또는 전류 클램프 모드(예를 들어 이온 전류에 의해 유도된 휴지막 전위의 변화를 기록할 수 있음)에서 수행할 수 있습니다. 활동 전위 및 시냅스 후 전위 주파수).

패치 클램프 기술을 사용하여 몇 가지 주목할만한 발견이 가능했습니다. 실제로, 제3뇌실의 심실 주위 영역(RP3V) 및 시상하부의 아치형 핵(ARHkisspeptin)13,14,15 특히 관심이 있습니다. 2010년 Ducret et al. 또 다른 전기생리학적 도구인 느슨한 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 생쥐에서 AVPV/PeNKisspeptin뉴런의 첫 번째 기록을 수행했습니다. 이 연구는 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런에 대한 전기적 설명을 제공했으며 이들의 발화 패턴이 발정 주기에 의존한다는 것을 입증했습니다16. 2011년 Qiu et al.은 ARH키스펩틴 뉴런이 내인성 심박조율기 전류를 발현한다는 것을 입증하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용했다17. 그 후, Gottsch et al. 키스펩틴 뉴런이 자발적인 활동을 나타내고 h형(심박조율기)과 T형 칼슘 전류를 모두 발현한다는 것을 보여주었으며, 이는 ARH키스펩틴 뉴런이 다른 중추신경계 심박조율기 뉴런과 전기생리학적 특성을 공유함을 시사한다18. 또한, ARH 키스펩틴 뉴런은 유성 이형성 발화 속도를 나타내고 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런은 ATP 민감성 칼륨 채널(K ATP)에 의해 영향을 받는 바이모달 휴지막 전위(RMP)를 나타낸다는 것이 입증되었습니다19,20. 또한, 생식선 스테로이드가 생쥐 19,20,21에서 키스펩틴 뉴런의 자발적인 전기적 활동에 긍정적인 영향을 미친다는 것이 확인되었습니다. 키스펩틴 뉴런의 전기생리학적 특성을 연구한 첫 번째 연구는 16,17,18,19,20에 언급되어 있습니다. 그 이후로 많은 연구에서 키스펩틴 뉴런의 전기적 활성을 조절하기에 충분한 인자/신경 조절제를 입증하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용했습니다(그림 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

여기에서 다루지 않은 다른 세포 유형 중에서 번식에 필요한 뉴런 연구에 대한 이 기술의 중요성을 감안할 때 이 기사에서는 용액 준비, 뇌 해부 및 절단, 기록을 위한 세포막 밀봉 수행과 같은 전체 세포 패치 클램프 기술 개발을 위한 기본 단계를 설명합니다. 또한 최적의 실험 성능을 위해 제어해야 하는 장점, 기술적 한계 및 중요한 변수와 같은 기술에 대한 관련 문제에 대해 논의합니다.

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Protocol

모든 동물 시술은 상파울루 대학의 생물 의학 연구소 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 브라질 동물 실험 대학에서 채택한 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 용액 준비

  1. 내부 용액 준비
    참고: 내부 용액은 패치 클램프 마이크로피펫을 채우고 셀 내부와 접촉합니다( 그림 2의 파일 참조). 내부 용액은 측정할 활동의 종류에 따라 달라질 수 있다33.
    1. 실험 목적과 적절한 레코드 유형을 고려하여 내부 솔루션을 선택합니다. 전류 클램프 모드에서 막 전위를 기록하려면 120mM K-글루코네이트, 1mM NaCl, 5mM EGTA, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 1mMCaCl2, 3mM KOH, 10mM KCl 및 4mM(Mg)-ATP로 구성된 내부 용액을 사용합니다. 표 1에 주어진 바와 같이 원하는 최종 부피에 따라 모든 염의 무게를 측정한다.
    2. 용액의 최종 부피의 90%에 도달하기에 충분한 탈이온수를 사용하십시오. 이 부피는 pH와 삼투압을 조정하기에 충분한 공간을 보장합니다.
    3. 모든 성분을 첨가하고 완전히 혼합한 후 pH 측정기를 사용하여 5M KOH로 pH를 7.2-7.3으로 조정합니다. 삼투압계를 사용하여 약 275-280mOsm이어야 하는 삼투압을 확인합니다(필요한 경우 아래로만 조정).
    4. 내부 용액을 미리 준비하고 8°C에서 보관한다. 실험 당일에 ATP를 추가합니다. ATP 함유 내부 용액을 -20°C(1mL 분취량)에서 3-4개월 동안 보관합니다.
  2. 슬라이싱 용액의 제조
    1. 238 mM 수크로오스, 2.5 mM KCl, 26 mMNaHCO3, 1.0 mM NaH2PO4, 10 mM 글루코스, 1.0 mM CaCl2, 및 5.0 mM MgCl2를 포함하는 슬라이싱 용액을 준비한다. 표 2에 나타낸 바와 같이 원하는 최종 부피에 따라 모든 염의 무게를 측정한다. 준비할 이 용액의 정확한 부피는 절단 챔버의 크기에 따라 다릅니다.
    2. 모든 염을 탈이온수에 혼합하면서 카보겐(95% O2 및 5%CO2)으로 일정하게 포화시킨다. 폴리에틸렌 튜브(외경 1.57mm [OD] x 내경 [ID] 1.14mm)를 카보겐 실린더에 부착하여 슬라이싱 용액에 카보겐을 공급합니다. 슬라이싱 용액이 들어 있는 비커 내부에서 튜브의 열린 끝을 잡습니다.
    3. 모든 성분을 잘 섞은 후 pH 측정기를 이용하여 10% 질산으로 pH를 7.3으로 조절한다. 삼투압을 사용하여 290-295mOsm이어야 하는 삼투압을 확인합니다(필요한 경우 아래로만 조정). 그 후, 용액을 0-2°C로 냉각시킨다.
  3. 녹음을 위한 aCSF 솔루션 준비
    1. 124 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 26 mMNaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 1.2 mMMgSO4, 5 mM 포도당 및 2.5mM CaCl2를 함유하는 기록을 위한 인공 뇌척수액(aCSF) 용액을 준비한다. 표 3에 제시된 원하는 최종 부피에 따라 모든 염의 무게를 측정한다.
    2. 모든 염을 탈이온수에서 혼합하면서, 단계 1.2.2에 기재된 바와 같이, 카르보겐(95% O2 및 5%CO2)으로 일정하게 포화시킨다.
    3. 모든 성분을 첨가하고 혼합한 후 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.3(10% 질산 사용 가능)으로 조정합니다. 삼투압을 사용하여 290-300mOsm이어야 하는 삼투압을 확인합니다. 그 후, aCSF를 비커에 붓고 30°C의 수조에서 유지한다.

2. 뇌 해부 및 슬라이싱

참고: 다른 뇌 구조는 다른 평면(관상, 시상 또는 수평 슬라이스)에서 절단해야 할 수 있으므로 슬라이스를 얻기 위한 정확한 접근 방식은 관심 있는 뇌 영역에 따라 다릅니다. 전형적으로, AVPV/PeN 및 ARH에서 Kiss1 발현 세포를 연구하기 위해(여기서는 AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런 및 ARH키스펩틴 뉴런으로 표시됨; 그림 2A, B), 관상 뇌 절편 (200-300 μm)은 일반적으로 17,19,20,21,34로 만들어집니다. AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런은 브레그마에서 약 0.5 내지 -0.22 mm에 위치하는 반면, ARH키스펩틴 뉴런은 -1.22 내지 -2.70 mm에 위치한다. 핵 위치는 입체 마우스 뇌 아틀라스(35) 또는 앨런 마우스 뇌 참조 아틀라스(http://mouse.brain-map.org/)를 사용하여 결정될 수 있다. 성인 Kiss1-Cre/GFP 암컷(diestrus-stage) 및 수컷 마우스36마리가 이 연구에 사용되었습니다.

  1. 뇌 제거
    1. 해부 부위와 뇌를 추출하는 데 필요한 도구(참수 가위, 홍채 가위, 카스트로비에호 곡선 가위, 절골술, 핀셋, 주걱, 여과지, 페트리 접시, 면도날, 시아노아크릴레이트 접착제)를 준비합니다.
    2. 슬라이스를 만들기 전에 모든 후속 절차를 신속하게 수행해야하므로 해부가 수행 될 벤치를 준비하십시오. 비브라톰과 같은 슬라이싱 장치에 접근할 수 있는지 확인하십시오.
    3. 조직을 절단하기 전에 뇌 조각을 유지하기 위해 기록 챔버를 준비하십시오. 상업용 브랜드(재료 표)에서 24mm x 15mm x 2mm(L x W x H)의 수조 치수인 녹음 챔버를 구입하거나 사내에서 만드십시오.
      참고: 사내 회수 챔버는 다음과 같이 제작할 수 있습니다: 9개의 웰을 사용할 수 있도록 24웰 플레이트를 절단합니다. 나일론 스크린을 아홉 개의 우물 바닥에 붙입니다. 우물 판의 나머지 부분과 함께 나일론의 하부가 자유로워지도록 받침대를 만드십시오. 이 적응된 염기는 aCSF가 들어 있는 500mL 비커 안에 넣을 수 있습니다(보충 그림 1).
    4. 모든 것을 준비한 후 4 % -5 % 이소 플루 란을 사용하여 흡입 마취제로 동물을 마취시킵니다. 마취는 윤리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라야합니다. 동물이 움직이지 않은 직후, 꼬리와 발의 꼬집음 테스트를 수행하여 동물이 심하게 마취되었는지 확인하십시오.
    5. 세포 생존력을 높이기 위해 심장이 여전히 활동하는 동안 생쥐를 빠르게 참수하십시오. 참수 후 신속하게 뇌를 채취하십시오.
    6. 수술 용 가위로 동물의 두개골 상단에있는 꼬리에서 주둥이까지 피부를 절개하고 동물의 머리에서 두피를 제거합니다. 다음으로, 홍채 가위로 시상 봉합사를 따라 정수리 판을 자르고 후두골을 제거하십시오. 절골술을 정수리 뼈 아래로 밀어 넣고 뇌가 노출 될 때까지 부드럽게 잡아 당깁니다.
    7. 뇌를 노출시킨 후 머리를 거꾸로 뒤집어 뇌를 부드럽게 내려 양쪽의 삼차 신경을 시각화 한 다음 카스트로 비에 호 곡선 가위를 사용하여 삼차 신경을 자릅니다. 시상 하부를 시각화 한 후 시신경을 확인하고 부드럽게 자릅니다.
      알림: 시신경을 절단할 때 당기면 AVPV/PeN 핵이 포함된 인접한 시상하부 영역이 찢어지므로 주의하십시오.
    8. 전두엽의 가장 앞부분을 잘라내고 뇌를 완전히 제거합니다. 슬라이스를 획득 할 때까지 슬라이싱 용액에 즉시 뇌를 담그십시오.
  2. 뇌 샘플 슬라이싱
    1. 뇌를 여과지 (페트리 접시에지지)에 올려 놓고 초과 용액을 건조시킵니다. 그런 다음 날카로운 절단 면도날로 뇌간과 소뇌를 나머지 조직과 분리하는 관상 절단을 수행합니다.
    2. 다음으로, 뇌의 꼬리 부분을 비브라톰의 바닥에 붙이고 슬라이싱 장치의 챔버를 0-2 °C로 냉각된 슬라이싱/aCSF 용액으로 채웁니다. 시술 중에 비브라톰 챔버 주변에 드라이아이스를 포장하여 슬라이싱 용액을 차갑게 유지합니다.
    3. 면도날을 진동자에 삽입하고 장치의 적절한 절단 매개변수(속도 = 3, 주파수 = 9, 이송 = 250μm)를 설정합니다. 아크릴 이송 피펫(실리콘 젖꼭지에 부착된 거꾸로 된 파스퇴르 유리 피펫)을 사용하여 조직 슬라이싱 절차 중에 슬라이스를 회수 챔버(2.1.3단계에서 설명)로 옮깁니다. 슬라이스 획득 후 조직 회복을 위해 60분 동안 기다립니다.

3. 기록을 위한 세포 밀봉

  1. 녹음을 시작하기 전에 모든 장비(현미경, 증폭기, 디지타이저, 마이크로 매니퓰레이터 등)가 켜져 있는지 확인하십시오.
  2. 상용 브랜드(Table of Materials)의 기록 챔버를 기록용 aCSF 용액으로 현미경에 부착합니다. 관류 펌프를 사용하여 2mL/min의 속도로 aCSF를 지속적으로 관류합니다.
  3. 관심 있는 뇌 조각(한 번에 하나씩)을 녹음실로 옮깁니다. 아크릴 이송 피펫(실리콘 젖꼭지에 부착된 거꾸로 된 파스퇴르 유리 피펫)을 사용하여 시상하부 슬라이스를 챔버로 옮깁니다. 슬라이스 앵커(재료 표)를 사용하여 슬라이스가 aCSF 관류 중에 움직이지 않도록 고정합니다.
  4. 현미경에 부착된 기록 챔버의 중앙에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스 위치는 현미경으로 원하는 영역을 잘 볼 수 있고 기록 마이크로피펫에 완벽하게 도달할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다.
  5. 침수 현미경의 저전력 대물 렌즈(10x 또는 20x)를 사용하여 슬라이스의 위치를 지정하고 관심 영역을 찾는 데 도움을 줍니다.
  6. 관심 영역을 찾은 후, 대물 렌즈를 고배율 렌즈(63x)로 전환하고 조직 수준에 초점을 맞추고, 내인성 형광 단백질과 표적 영역의 세포 모양을 관찰하여 뇌 절편(20)의 표면에서 키스펩틴 세포를 찾습니다.
  7. 가능한 대상 셀을 찾으면 마우스 커서로 컴퓨터 화면에 표시하거나 관심 영역 위에 정사각형과 같은 형식을 그려 표시합니다. 컴퓨터 화면 표시는 기록 마이크로피펫의 위치를 셀로 안내하는 데 도움이 됩니다.
  8. 표적 세포의 정확한 위치를 결정한 후 대물렌즈를 들어 올리고 내부 용액으로 채워진 기록 마이크로피펫을 도입합니다. 마이크로피펫을 전극 홀더에 놓을 때 내부 용액이 은 전극과 접촉하는지 확인하십시오.
    알림: 마이크로피펫 준비, 전극 홀더의 배치 및 위치 지정에 대해서는33을 참조하십시오.
  9. 마이크로피펫을 aCSF 용액에 담그기 전에 폴리에틸렌 튜브(≈130cm 더 긴)를 통해 마이크로피펫 홀더에 연결된 1-3mL 공기 충전 주사기를 사용하여 마이크로피펫에 파편이 들어가는 것을 방지하기 위해 양압을 가합니다. 거의 100-200 μL의 공기를 가하십시오.
  10. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 대물렌즈 중앙 아래로 안내합니다. 마이크로 매니퓰레이터의 버튼을 움직여 X-Y-Z 축의 마이크로피펫을 관심 있는 셀로 안내합니다.
  11. 마이크로피펫의 끝이 보이도록 초점을 조정하고 초점을 슬라이스에 너무 가까이 두지 말고 더 가까이 가져옵니다. 마이크로 매니퓰레이터의 속도를 줄이고 마이크로 피펫을 초점 평면으로 천천히 내립니다. 마이크로피펫 팁이 슬라이스를 갑자기 관통하지 않고 세포/표적 영역의 표면에 닿을 때까지 천천히 하강하는지 확인합니다.
  12. 마이크로피펫 홀더에 부착된 1-3mL 공기 충전 주사기를 사용하여 가벼운 양압(≈100μL)을 적용하여 접근 경로에서 이물질을 제거합니다.
  13. 표적 세포에 초점을 맞추고 X-Y-Z 축에서 미세 매니퓰레이터를 천천히 움직여 마이크로피펫을 표적 세포에 더 가깝게 만듭니다. 마이크로피펫을 셀에 접촉하면 마이크로피펫 팁을 통해 가해지는 압력으로 인한 딤플이 관찰됩니다(그림 2C).
  14. 딤플을 형성한 후 마이크로피펫이 셀에 근접하기 때문에 마이크로피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 입으로 약하고 짧은 흡입(1-2초)하여 마이크로피펫과 셀 사이의 밀봉을 생성합니다(기가옴 씰 또는 기가씰 >1GΩ; 그림 2D). 씰을 형성하려면 vol을 사용하십시오.tage-clamp 소프트웨어의 모드. 씰 형성에 대한 자세한 내용은33을 참조하십시오.
  15. 씰이 안정적으로 유지되면(기가옴 씰은 기계적으로 안정적이고 노이즈 간섭이 없어야 하며 약 1분 동안 관찰하여 결정됨) 유지 전압을 관심 있는 셀의 가장 가까운 생리학적 휴지 전위로 설정합니다. 키스펩틴 시상하부 뉴런의 경우 -50mV가 권장됩니다.
  16. 세포에 밀봉된 마이크로피펫으로 입으로 짧은 흡입(음압)을 적용하여 원형질막을 파괴합니다(그림 2E). 파열된 멤브레인이 마이크로피펫을 막히지 않고 멤브레인 또는 셀의 상당 부분을 끌어당기지 않도록 충분한 힘으로 흡입을 수행할 때 적절한 전체 셀 구성이 달성됩니다.
  17. 사용 된 시스템 설정 설명서를 확인하십시오. 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 직렬 저항(SR)과 전체 셀 커패시턴스(wcc)를 디지털 방식으로 확인하고 계산할 수 있습니다.
  18. 전압 클램프 모드에서 세포막을 파괴한 후 전체 셀 옵션을 활성화하고 전체 셀 탭을 참조하는 자동 명령을 클릭합니다. 셀의 SR 및 wcc가 자동으로 계산되어 소프트웨어에 의해 즉시 표시됩니다. 이러한 파라미터는 재료 표33에 언급된 증폭기로 멤브레인 테스트를 수행하여 확인할 수도 있습니다.
  19. 세포 생존율 매개변수를 확인하십시오. 키스펩틴 뉴런의 경우 전기생리학적 측정값이 SR < 25mΩ, 입력 저항 0.3GΩ, 전류 절대값 < 30pA> 유지되는지 확인합니다(개인 관찰 및 참조21). AVPV/PeN 키스펩틴 또는 ARH키스펩틴 뉴런의 wcc의 평균값은 생식선 온전한 마우스 20에서 ≈ 10-12pF입니다.
  20. 실험 동안 SR 및 셀 정상 상태 커패시턴스를 모니터링합니다. 녹음 중에 SR이 20% 이상 변경되지 않고 멤브레인 커패시턴스가 안정적인지 확인합니다.
  21. 소프트웨어 설정을 확인하십시오. 실험 유형에 따라 기록에 대한 특정 프로토콜을 만듭니다. 전류 클램프 모드에서 멤브레인 전위를 기록하기 위해 재료 표에 언급된 장비를 사용하여 2-4kHz에서 전기 생리학적 신호를 저역 통과 필터링하고 소프트웨어에서 오프라인으로 결과를 분석합니다(소프트웨어 정보는 재료 표 참조).
  22. 전체 셀 구성이 제대로 이루어지면 전압 클램프 모드에서 시냅스 전류를 측정합니다(그림 2G). 레시 멤브레인 전위(RMP)의 변화와 전류 클램프 모드에서 유도된 RMP 변동을 기록합니다(그림 2H). 세포막의 탈분극과 같은 RMP의 변화는 그림 3.2에 표시된 대로 알려진 약물/신경 전달 물질을 욕조에 투여하여 유도할 수 있습니다(1단계에 설명됨).
    알림: 전류 클램프 모드에서 양수 또는 음극 전류를 주입하여 멤브레인 전압을 원하는 전압으로 유지할 수 있습니다. 키스펩틴 뉴런의 경우 일반적으로 막 전위의 자발적인 변화를 기록하기 위해 제로 전류 주입(I = 0)을 설정합니다.

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Representative Results

시상하부 키스펩틴 뉴런의 활성에 대한 인간 재조합 성장 호르몬(hGH)의 가능한 효과를 연구하기 위해 뇌 조각에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하고 이 호르몬이 AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH키스펩틴 뉴런의 활성에 급성 변화를 일으키는지 여부를 평가했습니다. 성인 Kiss1-Cre/GFP 암컷(diestrus-stage) 및 수컷 마우스36마리가 이 연구에 사용되었습니다. 생식선-온전한 동물들이 실험을 위해 선택되었는데, 그 이유는 그들의 시상하부 키스펩틴 뉴런의 성질이 성 스테로이드 수치에 따라 달라질 수 있기 때문이다19,20. 남녀 간의 차이를 평가하는 것은 본 연구의 범위를 벗어났지만 독자는 Croft et al. 및 Frazão et al.19,20 자세한 내용은. 생쥐 및 쥐와 같은 유전자 변형 동물은 특정 유전자 또는 선택적 유도 절제를 발현하는 세포가 GFP와 같은 형광 단백질에 의해 식별 될 수 있기 때문에 이러한 유형의 실험을위한 흥미로운 도구를 나타냅니다23,26,36. 유전자 변형 마우스의 사용은 키스펩틴 뉴런 활동을 이해하는 데 돌파구를 나타냅니다.

기록된 뉴런(12마리 동물 중 26개 세포)은 신경해부학적 특징(35 ) 및 내인성 GFP20의 발현에 따라 결정되었습니다. 전류 클램프 모드에서 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 I = 0 하에서 기록되었습니다. AVPV/PeN키스펩틴 뉴런(9마리의 동물에서 얻은 12개 세포)은 -59.0 mV ± 3.0 mV(범위: -75 mV 내지 -46 mV)의 평균 RMP, 0.9 ± 0.1 GΩ의 입력 저항, 12.3 pF ± 1.6 pF의 wcc, 및 19.4 ± 1.9 mΩ의 SR을 나타냈다. 기록된 뉴런 중 12개의 AVPV/PeN키스펩틴 세포 중 3개는 정지 상태에서 활동 전위(AP)의 자발적인 방전을 보였다(0.1Hz ± 0.06Hz, 자발적 활성 세포의 평균 RMP는 -50.7mV± 2.7mV). ARH 키스펩틴 뉴런 (12마리 동물로부터의 14개 세포)의 평균 RMP는 -50.0 mV ± 1.5 mV (범위: -62 mV 내지 -39 mV)이고, 평균 입력 저항은 0.1 GΩ± 1.7 이고, wcc는 0.7 pF± 9.2 pF이고, SR은 16.9 ± 1.7 mΩ이었다. 대부분의 ARH키스펩틴 뉴런은 정지 상태인 반면, 14개 세포 중 4개는 정지 상태에서 자발적인 AP를 보였다(0.9Hz ± 0.5Hz, 자발적 활성 세포의 평균 RMP는 -52.7mV± 1.4mV).

수조에 hGH(20μg/g)를 투여하면 기록된 많은 뉴런의 RMP가 유의하게 과분극화되었으며, 12개의 AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런 중 5개(9개 마우스의 세포 ≈55%), 기록된 14개 중 9개의 ARH 키스펩틴 뉴런(12개 마우스의 세포 ≈65%, p = 0.0006, Fisher의 정확 테스트; 그림 3). AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH키스펩틴 과분극 뉴런은 반응이 없는 세포에 비해 RMP를 유의하게 변화시켰습니다(그림 3B,E; Mann-Whitney 테스트). RMP에 대한 영향(그림 3C,F; 반복 측정 ANOVA와 Tukey의 사후 테스트)에 이어 AVPV/PeN키스펩틴에 대한 전체 세포 입력 저항(IR)이 크게 감소했습니다(hGH 적용 중 0.1GΩ에서 0.7 ± 0.1GΩ± p = 0.02; 도 3D) 및 hGH 적용시 ARH 상에서키스펩틴(1.7 ± 0.1 GΩ 내지 1.0 ± 0.1 GΩ, p < 0.0001; 반복 측정 ANOVA와 Tukey's post-test; 그림 3G) 뉴런. 또한, hGH-과분극 뉴런의 자발적 AP(fAP)의 빈도는 두 세포 집단 모두에서 감소했습니다(0.1Hz ± 0.06Hz 내지 0.0Hz± AVPV/PeN 키스펩틴 및 1.0Hz ± 0.5Hz 내지 0.2Hz± ARH키스펩틴 뉴런). 그러나 이러한 감소의 정도는 통계적 유의성 수준에 도달하지 못했습니다(p > 0.05, Mann-Whitney 테스트). hGH 세척 후 RMP와 IR을 기준선으로 복원했습니다(그림 3A,C,D,F,G). 나머지 키스펩틴 뉴런은 hGH 투여에 반응하지 않았습니다.

우리는 이전에 pGH가 시상하부 키스펩틴 뉴런 활동에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다(Silveira et al.25; 그림 3H). 참고로, hGH는 GH 수용체37,38 이외에 프로락틴 (PRL) 수용체를 활성화 할 수있는 것으로 알려져있다. 게다가, PRL은 생쥐에서 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런의 ≈20%만 간접적으로 탈분극합니다24. 대조적으로, PRL은ARH 키스펩틴 세포의 빠른 시냅스 전달을 조절하지 않는다24. 따라서 여기에서 보고된 hGH 유도 과분극 효과는 비특이적인 것으로 보입니다. 관찰된 차이는 이전에 보고된 바와 같이 약물 농도, 종 차이(인간 대 마우스) 또는 사용된 약물의 조성에 염분이 존재하는지와 같은 변수에 따라 달라질 수 있다28.

Figure 1
그림 1: 키스펩틴 뉴런의 활동에 대한 지식에 대한 전체 세포 패치 클램프 기술의 기여도를 요약한 개략도. 키스펩틴 뉴런(녹색으로 표시)은 전복부 뇌실주위 및 뇌실주위 핵(AVPV/PeN)과 시상하부의 아치형 핵(ARH)에 있습니다. AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH키스펩틴 세포는 전광학 영역(POA)에 위치한 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 뉴런의 소마와 중앙 돌출부(ME)의 말단에 직접 연결하여 시상하부-뇌하수체 축(HPG)의 조절로 절정에 이릅니다. 호르몬과 같은 다양한 신경 조절제가 AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH키스펩틴 뉴런의 활성을 차등적으로 조절하는 것으로 나타났습니다. 휴지 막 전위에 대한 가능한 효과는 전체 세포 경로 클램프 기술 및 전류 클램프 기록을 사용하여 얻은 대표적인 추적에 의해 개략적으로 입증됩니다. 붉은 색은 특정 신경 전달 물질이 휴지막 전위 (RMP)의 탈분극을 유도한다는 것을 나타냅니다 17,22,24,26,28,29,30,31,32; 파란색은 RMP 24,25,26,27,30에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 점선은 RMP를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 전체 셀 패치 클램프 기법으로 관심 있는 셀을 밀봉하는 기본 단계. (ᄀ,ᄂ) 전복부 뇌실주위 핵(AVPV) 및 시상하부의 아치형 핵(ARH)에서 키스펩틴 세포를 포함하는 뇌 절편(250μm)의 대표적인 현미경 사진. 키스펩틴 뉴런은 녹색 형광 단백질(GFP) 발현에 의해 확인되었습니다. (C) 밀봉을 수행하기 위해 원형질막에 딤플을 만들 수 있을 만큼 세포에 가까운 마이크로피펫(전해질 용액[내부 용액] 포함)을 보여주는 현미경 사진. (D,E) 세포막을 마이크로피펫(D)에 밀봉하기 위해 가벼운 음압(헤드스테이지 및 마이크로피펫에 부착된 튜브에서 수행되는 구강 흡입)이 필요합니다. 원형질막 파열(E)을 유도하기 위해 두 번째 음압(경증 및 간결)의 적용이 필요합니다. (F) 세포 활성의 등록은 패치 클램프 실험에 사용되는 기계적 설정에 의해 수행됩니다. 원형질막을 파괴한 후, 패치된 셀의 이온 채널을 통해 흐르는 전류는 고감도 증폭기에 연결된 전극에 의해 기록될 수 있습니다. 피드백 저항은 전압 클램프(G) 또는 전류 클램프(H) 기록에 필요한 전류를 생성한다. 약어: 3V = 제3뇌실; ME = 중앙값 돌출부. 스케일 바: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 약물 특이성 테스트. (A) 인간 재조합 성장 호르몬(hGH)이 시상하부의 아치형 핵에 위치한 키스펩틴 뉴런의 휴지막 전위(RMP)의 과분극을 유도했음을 보여주는 대표적인 전류 클램프 기록(ARHkisspeptin). (비-지) 전복부 뇌실주위 및 뇌실주위 핵(AVPV/PeNKisspeptin)에 위치한 hGH 반응성 키스펩틴 뉴런의 휴지막 전위(RMP)(B,C,E,F) 및 평균 입력 저항(IR)(D,G)의 평균 변화를 보여주는 막대 그래프 (B-D) 또는 ARH(E-G). 돼지 성장 호르몬(pGH)이 ARH키스펩틴 뉴런의 RMP에 영향을 미치지 않음을 입증하는 대표적인 전류 클램프 기록은 이전에 보고된바와 같이 25(H). 사용된 유의성 검정은 (B)와 (E)에 대한 Mann-Whitney 검정과 반복 측정 ANOVA와 (C,D,F,G)에 대한 Tukey의 사후 검정입니다. 점선은 RMP를 나타냅니다. *p = 0.02; **p = 0.004,***p = 0.0003; p < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

내부 용액(100mL)
소금 FW (g / 몰) 농도 무게 (g)
K-글루코네이트 234.2 120 밀리엠 2.81
염화나트륨(NaCl) 58.4 1.0 밀리메터 0.006
케이씨엘 74.5 10 밀리엠 0.074
헤페스 238.3 10 밀리엠 0.24
증권 시세 표시기 380.3 5.0 밀리엠 0.19
CaCl2 147.0 1.0 밀리메터 0.015
마그네슘2 203.0 1.0 밀리메터 0.02
코 56.11 3.0 밀리엠 0.017
증권 시세 표시기 507.18 4.0 밀리엠 0.20
pH = 7.3 / 삼투압 = 275 - 280 mOsm

표 1: 내부 용액 준비를 위한 시약. 표에는 100mL의 용액을 제조하기 위한 분자량(FW), 원하는 농도 및 계산된 염의 중량이 포함되어 있습니다.

aCSF/슬라이싱 용액(250mL)
소금 FW (영어) 농도 무게 (g)
자당 342.3 238 밀리엠 18.5
(주)케이씨엘(주 74.5 2.5 밀리엠 0.046
나코3 84.0 26 밀리엠 0.546
NaH2포4 120.0 1.0 밀리메터 0.03
마그네슘2 203.0 5 밀리엠 0.254
D-글루코오스 180.2 10 밀리엠 0.450
CaCl2 147.0 1.0 밀리메터 0.037
pH = 7.3 / 삼투압 = 290 - 295 mOsm

표 2: 슬라이싱 용액을 준비하기 위한 시약. 표에는 250mL의 용액을 제조하기 위한 분자량(FW), 원하는 농도 및 계산된 염의 중량이 포함되어 있습니다. 뇌는 이 용액에 잠겨 슬라이스됩니다.

기록용 aCSF(1L)
소금 FW (영어) 농도 무게 (g)
염화나트륨(NaCl) 58.4 135 밀리엠 7.88
(주)케이씨엘(주 74.5 3.5 밀리엠 0.261
나코3 84.0 26 밀리엠 2,184
NaH2포4 120.0 1.25 밀리엠 0.150
마그네슘4 246.5 1.2 밀리엠 0.296
D-글루코오스 180.2 10 밀리엠 1,802
CaCl2 147.0 1.0 밀리메터 0.148
pH = 7.3 / 삼투압 = 290-300 mOsm

표 3: 기록을 위해 aCSF를 준비하기 위한 시약. 표에는 1L의 용액을 제조하기 위한 분자량(FW), 원하는 농도 및 계산된 염의 중량이 포함되어 있습니다.

보충 그림 1: 자체 제작 회수 챔버의 예. (ᄀ,ᄂ) 사내 회수 챔버는 다음과 같이 제작할 수 있습니다 : 9 개의 웰을 사용할 수 있도록 24 웰 플레이트를 절단하십시오. 나일론 스크린을 아홉 개의 우물 바닥에 붙입니다. 우물 판의 나머지 부분과 함께 나일론의 하부가 자유로워지도록 받침대를 만드십시오. (C) 이 적응된 베이스는 카보겐(95% O2 및 5% CO2)으로 지속적으로 포화된 인공 뇌척수액(aCSF)이 들어 있는 500mL 비커 안에 넣을 수 있습니다. (d) 회수 챔버를 담는 비커는 실험 동안 수조에 보관된다. (E,에프) 아크릴 이송 피펫은 뇌 절편을 회수실로 옮기는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

전체 세포 패치 클램프 기술의 개발은 과학계에 상당한 영향을 미쳤으며 과학 연구를 개발하고 여러 발견을 가능하게 하는 데 가장 중요한 것으로 간주되었습니다. 과학에 대한 그것의 영향은 1991년 노벨 의학상에서 절정에 달하기에 충분했으며, 이 발견은 생리학적 및 병리학적 조건에서 이온 채널이 어떻게 기능하는지에 대한 더 나은 이해와 치료제의 잠재적 표적 식별의 문을 열었기 때문입니다 11,39,40,41. 의학 분야에서 이 기술을 사용하여 이루어진 뛰어난 발견 중 하나는 임상적으로 사용되는 여러 물질이 이온 채널(예: 국소 마취제, 항부정맥제, 항당뇨병제 및 근육 이완제)과 직접 상호 작용한다는 것입니다42. 따라서 그 적용 가능성은 임상 연구소 및 기초 연구 부서에서 분명합니다. 이 기사에서는 시상하부 키스펩틴 뉴런을 포함하는 뇌 조각에 대한 전체 세포 패치 클램프 실험을 수행하기 위한 기본 준비에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 기본 단계를 간략하게 설명하고 조직을 얻고 패치 클램프 기술을 위한 솔루션을 준비하기 위해 제어해야 하는 주목할만한 매개변수를 강조합니다. 그러나 이 기사에서는 이 기술의 복잡성과 각 유형의 기록, 특히 분석과 관련된 메커니즘을 완전히 설명할 수 없습니다. 추가 이론 학습을 위해 패치 클램프 기술에 대한 일부 책과 리뷰가 권장됩니다 10,43,44,45,46.

패치 클램프 방법에 사용되는 각 솔루션에는 특정 목적이 있습니다. 따라서 특정 구성과 기준은 준비 과정에서 엄격하게 채택되어야합니다. 예를 들어, 내부 용액의 조성은 측정할 전류의 유형에 따라 달라지기 때문에 실험 목표에 따라 결정되어야 합니다. Cl-(15mM)이 세포 세포질47의 생리학적 농도를 모방하는 여기에 언급된 염화물 기반 용액은 능동 및 수동 신경 특성 또는 시냅스 입력에 대한 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 내부 용액 중의 염화물 함량은 세포 기록을 위한 최적 수준에서 염화물 평형 전위를 유지한다는 것을 강조하는 것이 중요하다(언급된 용액 ECL에서, 약 -59 mV이다). 세포 내 염화물 농도는 GABAA 수용체를 통한 모든 전류가 Cl-21,48에 의해 운반된다고 가정하여 GABA 유도 전류 (EGABA)에 대한 반전 전위를 평가함으로써 추정 할 수 있습니다. 시상하부 키스펩틴 뉴런에 대한 연구를 위해서는 ARH 키스펩틴의 세포내 Cl- 농도가 AVPV/PeN키스펩틴 세포보다 높다는 점을 고려해야 한다21. 실험을 계획할 때 이 특성을 고려해야 합니다. 내부 용액의 삼투압은 가능한 팽창 및/또는 세포 약화로 인한 밀봉 손실을 방지하기 위해 기록에 대해 aCSF의 삼투압보다 최소 5% 낮은 것이 좋습니다33,47. 바이오시티틴 또는 세포내 염료(예: Alexa Fluor 594)와 같은 세포 마커로 추가로 사용할 수 있는 세포 내 화합물을 내부 용액에 추가해야 하는 경우 K+ 수준을 감소시켜 삼투압이 지속적으로 유지될 수 있습니다(20,47,49,50).

신속한 뇌 해부를 수행하고 적절한 슬라이싱 용액으로 슬라이싱하는 동안 저온(0-2°C)을 유지하는 것이 중요합니다. 슬라이싱 용액은 평가되는 세포 및/또는 뇌 영역의 유형에 따라 다를 수 있다(33,47). 뇌 절편을 얻는 데 사용되는 aCSF 용액(즉, 슬라이싱 용액)은 일반적으로 기록을 위한 aCSF와 다른 조성을 갖습니다(비교를 위해 표 2 및 표 3 참조). 양이온(Ca2+ 및Mg2+) 농도는 뉴런의 흥분성을 수정하도록 조정될 수 있으며, 이는 또한 발화 역치 및 신경전달물질 방출에 영향을 미칠 수 있다(47). 낮은Ca2+ 및 높은 Mg2+ 배지는 가능한 흥분독성 과정을 최소화하기 위해 널리 사용됩니다(자세한 내용은51 참조). 또한, 낮은 Ca2+ 및 높은Mg2+ 매질은 시상하부 뉴런 활동을 자극할 수 있다52. 녹음을 위한 aCSF와 관련하여 몇 가지 특성은 유사합니다. 완충 시스템은NaHCO3, 높은 NaCl 농도 (일반적으로 >100 mM) 및 낮은 KCl 농도 (일반적으로 <5 mM)에 기초하며, Ca2+ 및Mg2+의 상대 농도 (2:1이 종종 사용됨)는 보통 약 2 mM이고, 글루코스 수준은 1 내지 10 mM의 범위일 수 있다(47). 용액의 삼투압, pH 또는 온도 변화(30-32°C 사이로 디지털 방식으로 제어됨)의 변화 외에도 실험 프로토콜 중에 실험을 실질적으로 방해하는 다른 문제가 발생할 수 있음을 강조하는 것이 중요합니다. 전기생리학적 측정은 기록 중에 안정적이어야 하며 모든 변형에는 중요한 판독값이 있어야 합니다. 예를 들어, SR 변경은 전체 셀 모드에서 셀룰러 액세스를 설명하며 측정된 전류 및 전위에 상당한 영향을 미칩니다. 또한, 고려해야 할 패치 클램프 방법론과 관련된 관련 한계는 형태학적 및 기능적 변화를 유도할 수 있는 과도한 흡입/압력 프로토콜에 의한 세포의 기계적 과잉 자극이라는 점을 강조하는 것이 중요합니다53. 이러한 편향은 적용된 흡입 강도를 정밀하게 제어할 수 있는 장치가 아닌 입으로 흡입을 수행하는 프로토콜에서 제어하기 어려운 경우가 많습니다. 또한 높은 비율의 세포 사망률로 절정에 달하는 조직 관련 문제는 부적절한 해부, 저산소증 또는 연구자가 관찰로 식별할 수 없는 마우스의 건강 상태로 인해 발생할 수 있습니다.

전체 세포 패치 클램프 기술의 주요 장점은 관심있는 특정 뇌 영역의 뉴런을 정확하게 기록 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 유전자 변형 동물의 생성으로 엄청난 이익을 얻었습니다. 우리 그룹은 일반적으로 Kiss1 유전자 프로모터 하에서 hrGFP를 발현하는 마우스 모델 또는 Kiss1 유전자 프로모터 하에서 Cre-재조합효소를 발현하고 Cre-조건부 발현 하 에서 GFP를 발현하는 다른 마우스 모델로 작업합니다. 그러나 오늘날23,26,36 개의 검증 된 동물 모델이 많이 있습니다. 또한, 혈액-뇌 장벽의 부재와 세포외 및 세포내 환경이 용이하게 제어되고 조작될 수 있다는 사실은 이 방법의 이점을 나타냅니다. 그러나 반드시 생리적 상태를 나타내는 것은 아닙니다. 생체 내 제제 또는 세포 내 또는 천공 패치 기록과 같은 세포 혈질 이온 농도를 보존하는 것을 목표로 하는 다른 기록 유형과 비교하여 이 기술의 한계 중 하나는 전체 세포 구성의 침습성이 세포질 함량의 투석을 유발한다는 점을 언급하는 것이 중요합니다(54). 투석은 일부 현상이 발생하거나 발현되는 데 필요한 분자 측면의 중단을 유발할 수 있습니다. 슬라이스에서 기록함으로써 대부분의 뉴런 투영이 절편화되어 있음을 기억해야 합니다. 따라서 이러한 중단이 관찰된 효과나 생리적 상태에 얼마나 영향을 미치는지 평가하는 것은 기술의 범위를 벗어납니다. 언급 한 바와 같이, 200-300 μm의 관상 동맥 뇌 절편은 일반적으로 시상 하부 키스 펩틴 뉴런 17,19,20,21,34의 활성을 연구하기 위해 수행됩니다. 키스펩틴 세포와 특정 AVPV/PeN 또는 ARH 연결성을 유지하는 다양한 슬라이스 각도를 연구하기 위해 더 두꺼운 뇌 절편을 사용하는 것의 한계55는 추가 조사가 필요합니다. 또한, 합성 여부에 관계없이 호르몬 / 약물이 뉴런의 RMP에 미치는 영향을 테스트함으로써 약물 EC50 (알려진 경우) 또는 특정 농도가 발화 속도를 활성화하거나 [Ca2+]i 수준을 변화시키는 데 효과적이라는 것을 입증하는 발표 된 데이터를 기반으로하는 여러 연구가 있습니다. 그러나, 정제된 합성 약물이 다른 유사 약물에 비해 길항 효과를 가질 수 있기 때문에 실험에 사용되는 약물의 구성/특이성을 알고 있어야 한다28. 앞서25에서 입증된 바와 같이, 정제된 pGH는 시상하부 키스펩틴 뉴런 활성에 영향을 미치지 않는 반면, hGH는 논란의 여지가 있는 데이터를 생성했습니다(그림 3 참조). ARH에 대한 인슐린 효과를 평가했을 때도 비슷한 결과가 나타났다28. 따라서 실험을 계획하고 얻은 결과를 해석할 때 약물 특이성을 고려해야 합니다.

패치 클램프 기술은 뉴런의 전기적 활동에 대한 데이터를 얻기 위한 훌륭한 도구이며 키스펩틴 뉴런과 같은 여러 뉴런 집단에 대한 지식에 크게 기여했습니다. 여기에 제공된 대부분의 세부 사항은 이전에 보고한 바와 같이 시상하부 뉴런의 기록에 일반적으로 사용됩니다.25,50,56,57,58,59,60. 중요한 것은 키스펩틴 뉴런 이외의 다른 뉴런 집단을 기록하려면 세포 커패시턴스, SR, 입력 저항, 세포 발사 패턴 및 기타 매개변수와 같은 세포 유형을 식별하는 데 도움이 될 수 있는 전기생리학적 측정값을 알고 있거나 결정해야 한다는 것입니다. 이러한 특성은 상이한 뇌 세포, 뇌핵, 및 순환 성 스테로이드 수치 16,19,20,21,61과 같은 생리학적 또는 유도된 상태 사이에서 다양하며, 이는 결과의 비판적 분석을 실질적으로 방해할 수 있다. 또한, 이 기술을 사용하기 위해서는 조직 준비와 관련된 가능한 변수와 관련 이점 및 한계를 이해해야 합니다. 프로토콜과 관련된 변수의 변경이 결과를 크게 방해할 수 있으므로 여기에 설명된 모든 단계는 신중하게 수행해야 합니다.

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Disclosures

선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 상파울루 연구 재단[FAPESP 보조금 번호: 2021/11551-4(JNS), 2015/20198-5(TTZ), 2019/21707/1(RF); 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) - Finance Code 001"(HRV)의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

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