JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다.

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64989
, , ,
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas,Universidade de Sao Paulo

Summary

여기에서 우리는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 세포의 주요 조절자인 키스펩틴 뉴런을 포함하는 뇌 조각에 전체 세포 패치 클램프를 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 키스펩틴 뉴런 활동에 대한 지식을 추가함으로써 이 전기생리학적 도구는 지난 20년 동안 신경내분비학 분야에서 상당한 발전의 기초가 되었습니다.

Abstract

키스펩틴은 시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축의 성숙과 생식력에 필수적입니다. 시상 하부의 아치형 핵뿐만 아니라 전복부 뇌실 주위 핵과 뇌실 주위 핵에 위치한 시상 하부 키스 펩틴 뉴런은 다른 세포 중에서도 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH) 뉴런에 투영됩니다. 이전 연구에서는 키스펩틴 신호 전달이 Kiss1 수용체(Kiss1r)를 통해 발생하여 궁극적으로 GnRH 뉴런 활동을 흥분시키는 것으로 나타났습니다. 인간 및 실험 동물 모델에서 키스펩틴은 GnRH 분비를 유도하고 결과적으로 황체 형성 호르몬(LH) 및 난포 자극 호르몬(FSH) 방출에 충분합니다. 키스펩틴은 생식 기능에 필수적인 역할을 하기 때문에 연구자들은 시상하부 키스펩틴 뉴런의 내재적 활동이 생식 관련 작용에 어떻게 기여하는지 평가하고 이러한 특성을 변화시킬 수 있는 주요 신경 전달 물질/신경 조절제를 식별하기 위해 노력하고 있습니다. 전체 세포 패치 클램프 기술은 설치류 세포에서 키스펩틴 뉴런 활동을 조사하는 데 유용한 도구가 되었습니다. 이 실험 기술을 통해 연구자들은 자발적 흥분성 및 억제성 이온 전류, 휴지 막 전위, 활동 전위 발사 및 세포막의 기타 전기생리학적 특성을 기록하고 측정할 수 있습니다. 본 연구에서는 시상하부 키스펩틴 뉴런을 정의하는 전기생리학적 측정으로 알려진 전체 세포 패치 클램프 기술의 중요한 측면과 이 기술에 대한 관련 문제에 대한 논의를 검토합니다.

Introduction

호지킨(Hodgkin)과 헉슬리(Huxley)는 여러 과학 연구에서 기술된 활동 전위에 대한 최초의 세포 내 기록을 만들었습니다. 이 기록은 직경이 큰 오징어 축삭(~500μm)에서 수행되어 미세 전극을 축삭 내부에 배치할 수 있습니다. 이 연구는 과학 연구에 큰 가능성을 제공했으며, 나중에 활동 전위 생성 1,2,3,4,5,6,7,8의 이온 기초를 연구하는 데 사용 된 전압 클램프 모드의 생성으로 절정에 달했습니다. 수년에 걸쳐이 기술은 개선되었으며 과학 연구 6,9에 널리 적용되었습니다. 1970년대 후반 Erwin Neher와 Bert Sakmann이 시작한 연구를 통해 이루어진 패치 클램프 기술의 발명으로 연구자들은 단일 전극만을 사용하여 거의 모든 유형의 세포에서 단일 이온 채널과 세포막 전위 또는 전류를 기록할 수 있었습니다 9,10,11,12. 패치 클램프 기록은 배양된 세포 또는 조직 절편과 같은 다양한 조직 제제에서 전압 클램프 모드(예: 전압 의존 전류 및 시냅스 전류를 기록할 수 있는 설정 전압에서 세포막을 유지) 또는 전류 클램프 모드(예를 들어 이온 전류에 의해 유도된 휴지막 전위의 변화를 기록할 수 있음)에서 수행할 수 있습니다. 활동 전위 및 시냅스 후 전위 주파수).

패치 클램프 기술을 사용하여 몇 가지 주목할만한 발견이 가능했습니다. 실제로, 제3뇌실의 심실 주위 영역(RP3V) 및 시상하부의 아치형 핵(ARHkisspeptin)13,14,15 특히 관심이 있습니다. 2010년 Ducret et al. 또 다른 전기생리학적 도구인 느슨한 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 생쥐에서 AVPV/PeNKisspeptin뉴런의 첫 번째 기록을 수행했습니다. 이 연구는 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런에 대한 전기적 설명을 제공했으며 이들의 발화 패턴이 발정 주기에 의존한다는 것을 입증했습니다16. 2011년 Qiu et al.은 ARH키스펩틴 뉴런이 내인성 심박조율기 전류를 발현한다는 것을 입증하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용했다17. 그 후, Gottsch et al. 키스펩틴 뉴런이 자발적인 활동을 나타내고 h형(심박조율기)과 T형 칼슘 전류를 모두 발현한다는 것을 보여주었으며, 이는 ARH키스펩틴 뉴런이 다른 중추신경계 심박조율기 뉴런과 전기생리학적 특성을 공유함을 시사한다18. 또한, ARH 키스펩틴 뉴런은 유성 이형성 발화 속도를 나타내고 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런은 ATP 민감성 칼륨 채널(K ATP)에 의해 영향을 받는 바이모달 휴지막 전위(RMP)를 나타낸다는 것이 입증되었습니다19,20. 또한, 생식선 스테로이드가 생쥐 19,20,21에서 키스펩틴 뉴런의 자발적인 전기적 활동에 긍정적인 영향을 미친다는 것이 확인되었습니다. 키스펩틴 뉴런의 전기생리학적 특성을 연구한 첫 번째 연구는 16,17,18,19,20에 언급되어 있습니다. 그 이후로 많은 연구에서 키스펩틴 뉴런의 전기적 활성을 조절하기에 충분한 인자/신경 조절제를 입증하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용했습니다(그림 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

여기에서 다루지 않은 다른 세포 유형 중에서 번식에 필요한 뉴런 연구에 대한 이 기술의 중요성을 감안할 때 이 기사에서는 용액 준비, 뇌 해부 및 절단, 기록을 위한 세포막 밀봉 수행과 같은 전체 세포 패치 클램프 기술 개발을 위한 기본 단계를 설명합니다. 또한 최적의 실험 성능을 위해 제어해야 하는 장점, 기술적 한계 및 중요한 변수와 같은 기술에 대한 관련 문제에 대해 논의합니다.

Protocol

모든 동물 시술은 상파울루 대학의 생물 의학 연구소 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 브라질 동물 실험 대학에서 채택한 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 용액 준비 내부 용액 준비참고: 내부 용액은 패치 클램프 마이크로피펫을 채우고 셀 내부와 접촉합니다( 그림 2의 파일 참조). 내부 용액은 측정할 활동의 종류에 따라…

Representative Results

시상하부 키스펩틴 뉴런의 활성에 대한 인간 재조합 성장 호르몬(hGH)의 가능한 효과를 연구하기 위해 뇌 조각에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하고 이 호르몬이 AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH키스펩틴 뉴런의 활성에 급성 변화를 일으키는지 여부를 평가했습니다. 성인 Kiss1-Cre/GFP 암컷(diestrus-stage) 및 수컷 마우스36마리가 이 연구에 사용되었습니다. 생식선-온전?…

Discussion

전체 세포 패치 클램프 기술의 개발은 과학계에 상당한 영향을 미쳤으며 과학 연구를 개발하고 여러 발견을 가능하게 하는 데 가장 중요한 것으로 간주되었습니다. 과학에 대한 그것의 영향은 1991년 노벨 의학상에서 절정에 달하기에 충분했으며, 이 발견은 생리학적 및 병리학적 조건에서 이온 채널이 어떻게 기능하는지에 대한 더 나은 이해와 치료제의 잠재적 표적 식별의 문을 열었기 때문입니…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 상파울루 연구 재단[FAPESP 보조금 번호: 2021/11551-4(JNS), 2015/20198-5(TTZ), 2019/21707/1(RF); 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) – Finance Code 001″(HRV)의 지원을 받았습니다.

Materials

Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various –
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus – can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices – Commander Software
LAS X wide field system Leica – Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various –
cyanoacrylate glue LOCTITE/various –
Decapitation scissors various –
Filter paper various –
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various –
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various –
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Whole-cell Patch-clamp RecordingsElectrophysiological PropertiesCell MembranesIonic CurrentsCellular ResponseBrain DissectionHypothalamusOptic NerveVibratomeACSF SolutionMicroscopeAmplifierDigitizerMicromanipulatorPerfusion Pump
check_url/64989?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image