Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hypothalamus kisspeptin nevroner som et mål for helcelle patch-klemme opptak

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre en helcellelapp-klemme på hjerneskiver som inneholder kisspeptin nevroner, den primære modulatoren av gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH) celler. Ved å legge til kunnskap om kisspeptin neuron aktivitet, har dette elektrofysiologiske verktøyet tjent som grunnlag for betydelige fremskritt i nevroendokrinologi feltet de siste 20 årene.

Abstract

Kisspeptiner er avgjørende for modningen av hypothalamus-hypofyse-gonadal (HPG) aksen og fruktbarhet. Hypothalamus kisspeptin nevroner lokalisert i anteroventral periventrikulær kjerne og rostral periventrikulær kjerne, samt bueformet kjernen i hypothalamus, prosjekt til gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) nevroner, blant andre celler. Tidligere studier har vist at kisspeptin signalering skjer gjennom Kiss1 reseptoren (Kiss1r), til slutt spennende GnRH neuron aktivitet. I mennesker og eksperimentelle dyremodeller er kisspeptiner tilstrekkelig for å indusere GnRH-sekresjon og følgelig frigjøring av luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH). Siden kisspeptiner spiller en viktig rolle i reproduktive funksjoner, arbeider forskere for å vurdere hvordan den inneboende aktiviteten til hypotalamiske kisspeptin nevroner bidrar til reproduksjonsrelaterte handlinger og identifisere de primære nevrotransmittere / neuromodulatorer som er i stand til å endre disse egenskapene. Helcellelapp-klemmeteknikken har blitt et verdifullt verktøy for å undersøke kyspeptinnevronaktivitet i gnagerceller. Denne eksperimentelle teknikken gjør det mulig for forskere å registrere og måle spontane eksitatoriske og hemmende ioniske strømmer, hvilemembranpotensial, aksjonspotensialavfyring og andre elektrofysiologiske egenskaper av cellemembraner. I denne studien gjennomgås viktige aspekter ved helcellepatch-klemmeteknikken, kjent som elektrofysiologiske målinger som definerer hypotalamiske kisspeptin nevroner, og en diskusjon av relevante problemstillinger om teknikken.

Introduction

Hodgkin og Huxley gjorde den første intracellulære registreringen av et aksjonspotensial beskrevet i flere vitenskapelige studier. Dette opptaket ble utført på blekksprutaksonet, som har en stor diameter (~ 500 μm), slik at en mikroelektrode kan plasseres inne i aksonet. Dette arbeidet ga store muligheter for vitenskapelig forskning, som senere kulminerte i etableringen av spenningsklemmemodus, som ble brukt til å studere det ioniske grunnlaget for handlingspotensialgenerering 1,2,3,4,5,6,7,8. Gjennom årene har teknikken blitt forbedret, og den har blitt mye brukt i vitenskapelig forskning 6,9. Oppfinnelsen av patch-clamp-teknikken, som fant sted på slutten av 1970-tallet gjennom studier initiert av Erwin Neher og Bert Sakmann, tillot forskere å registrere enkeltionkanaler og intracellulære membranpotensialer eller strømmer i nesten alle typer celler ved hjelp av bare en enkelt elektrode 9,10,11,12 . Patch-klemmeopptak kan gjøres på en rekke vevspreparater, for eksempel dyrkede celler eller vevsskiver, i enten spenningsklemmemodus (holde cellemembranen ved en innstilt spenning som tillater opptak av for eksempel spenningsavhengige strømmer og synaptiske strømmer) eller strømklemmemodus (tillater opptak av for eksempel endringer i hvilemembranpotensial indusert av ionstrømmer, aksjonspotensialer, og postsynaptisk potensialfrekvens).

Bruken av patch-clamp-teknikken gjorde flere bemerkelsesverdige funn mulig. Faktisk er de viktigste funnene på de elektrofysiologiske egenskapene til hypotalamiske kisspeptin nevroner lokalisert ved anteroventral periventrikulær og rostral periventrikulær kjerner (AVPV / PeN Kisspeptin), også kjent som rostral periventrikulært område av tredje ventrikkel (RP3V), og den bueformede kjernen i hypothalamus (ARHkisspeptin) 13,14,15 er av særlig interesse. I 2010 utførte Ducret et al. de første opptakene av AVPV / PeNKisspeptinnevroner i mus ved hjelp av et annet elektrofysiologisk verktøy, løscellen patch-clamp teknikk. Disse studiene ga en elektrisk beskrivelse av AVPV / PeNKisspeptin nevroner og viste at deres avfyringsmønstre er brunstsyklusavhengige16. I 2011 brukte Qiu et al. hele cellelapp-klemmeteknikken for å demonstrere at ARHkisspeptin nevroner uttrykker endogene pacemakerstrømmer17. Deretter viste Gottsch et al. at kisspeptin nevroner utviser spontan aktivitet og uttrykker både h-type (pacemaker) og T-type kalsiumstrømmer, noe som tyder på at ARHkisspeptin nevroner deler elektrofysiologiske egenskaper med andre pacemakernevroner i sentralnervesystemet18. I tillegg har det blitt påvist at ARH kisspeptin nevroner utviser seksuelt dimorfe avfyringshastigheter og at AVPV /PeN Kisspeptin nevroner utviser et bimodalt hvilemembranpotensial (RMP) påvirket av ATP-sensitive kaliumkanaler (KATP) 19,20. Videre ble det fastslått at gonadale steroider positivt påvirker den spontane elektriske aktiviteten til kisspeptin nevronene hos mus 19,20,21. De første arbeidene som studerer kyspeptinnevroners elektrofysiologiske egenskaper er nevnt 16,17,18,19,20. Siden da har mange studier brukt helcelle patch-clamp-teknikken for å demonstrere hvilke faktorer / nevromodulatorer som er tilstrekkelige til å modulere den elektriske aktiviteten til kisspeptin nevroner (figur 1) 17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Gitt betydningen av denne teknikken for studiet av nevroner som kreves for reproduksjon, blant annet celletyper som ikke dekkes her, beskriver denne artikkelen de grunnleggende trinnene for utviklingen av helcellepatch-klemmeteknikken, for eksempel å forberede løsningene, dissekere og kutte hjernen og utføre forseglingen av cellemembranen for opptak. Videre diskuteres relevante problemstillinger om teknikken, for eksempel fordeler, tekniske begrensninger og viktige variabler som må kontrolleres for optimal eksperimentell ytelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institute of Biomedical Sciences Animals Ethics Committee ved Universitetet i São Paulo og ble utført i henhold til de etiske retningslinjene vedtatt av det brasilianske dyreforsøkskollegiet.

1. Forberedelse av løsninger

  1. Fremstilling av intern løsning
    MERK: Den interne oppløsningen fyller patch-clamp-mikropipetten og vil kontakte cellens indre (se et eksempel i figur 2). Interne løsninger kan variere avhengig av hvilken type aktivitet som skal måles33.
    1. Velg den interne løsningen med tanke på eksperimentelt formål og riktig dokumenttype. For å registrere membranpotensial i strømklemmemodus, bruk den interne løsningen sammensatt av 120 mM K-glukonat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl og 4 mM (Mg)-ATP. Vei alle saltene i henhold til ønsket sluttvolum, som gitt i tabell 1.
    2. Bruk nok avionisert vann til å nå 90% av det endelige volumet av løsningen. Dette volumet vil sikre nok plass til å justere pH og osmolaritet.
    3. Etter å ha tilsatt og blandet alle ingrediensene grundig, juster pH til 7,2-7,3 med 5 M KOH ved hjelp av en pH-måler. Bruk et osmometer for å sjekke osmolariteten, som skal være rundt 275-280 mOsm (juster, om nødvendig, bare ned).
    4. Tilbered den interne oppløsningen på forhånd og oppbevar ved 8 °C. Legg til ATP på dagen for eksperimentet. Oppbevar den interne ATP-oppløsningen ved -20 °C (1 ml alikoter) i 3-4 måneder.
  2. Fremstilling av skiveoppløsning
    1. Forbered kutteoppløsning inneholdende 238 mM sukrose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mM NaH 2 PO4, 10 mM glukose, 1,0 mM CaCl 2 og 5,0 mM MgCl2. Vei alle saltene i henhold til ønsket sluttvolum, som vist i tabell 2. Det nøyaktige volumet av denne løsningen som skal fremstilles, vil avhenge av skjærekammerets størrelse.
    2. Mens du blander alle saltene i avionisert vann, må du hele tiden mette med karbogen (95%O2 og 5% CO2). Fest polyetylenrør (1,57 mm ytre diameter [OD] x 1,14 mm innvendig diameter [ID]) til en karbogensylinder for å tilføre karbogen til kutteløsningen. Hold den åpne enden av røret inne i begeret som inneholder skiveoppløsningen.
    3. Etter å ha blandet alle ingrediensene godt, juster pH til 7,3 med 10% salpetersyre ved hjelp av en pH-måler. Bruk et osmometer for å kontrollere osmolariteten, som skal være 290-295 mOsm (juster, om nødvendig, bare ned). Avkjøl deretter oppløsningen til 0-2 °C.
  3. Forbered aCSF-løsning for opptak
    1. Forbered kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) løsning for opptak som inneholder 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glukose og 2,5 mM CaCl2. Vei alle saltene i henhold til ønsket sluttvolum, gitt i tabell 3.
    2. Mens du blander alle saltene i avionisert vann, må du hele tiden mette med karbogen (95%O2 og 5% CO 2), som beskrevet i trinn 1.2.2.
    3. Etter tilsetning og blanding av alle ingrediensene, juster pH til 7,3 (10% salpetersyre kan brukes) ved hjelp av en pH-måler. Bruk et osmometer for å kontrollere osmolariteten, som skal være 290-300 mOsm. Hell deretter aCSF i et beger og hold den i et vannbad ved 30 °C.

2. Hjernedisseksjon og skiver

MERK: Siden forskjellige hjernestrukturer kan kreve kutting i forskjellige plan (koronal, sagittal eller horisontale skiver), avhenger den nøyaktige tilnærmingen for å skaffe skivene av hjerneområdet av interesse. Vanligvis, for å studere Kiss1-uttrykkende celler i AVPV / PeN og ARH (her betegnet som AVPV / PeN Kisspeptin nevroner og ARHkisspeptin nevroner; Figur 2A,B), koronale hjerneskiver (200-300 μm) lages vanligvis 17,19,20,21,34. AVPV/PeN Kisspeptin nevronene ligger ca. 0,5 til -0,22 mm fra bregma, mens ARHkisspeptin nevroner er på -1,22 til -2,70 mm. Kjernenes plassering kan bestemmes ved hjelp av et stereotaktisk musehjerneatlas35 eller Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Voksne Kiss1-Cre/GFP-hunner (diestrus-stadium) og hannmus36 ble brukt i denne studien.

  1. Fjerning av hjernen
    1. Forbered disseksjonsstedet og verktøyene som trengs for å trekke ut hjernen: halshuggingssaks, irissaks, Castroviejo buet saks, osteotom, pinsett, slikkepott, filterpapir, petriskål, barberblad og cyanoakrylat lim.
    2. Før du lager skivene, må du forberede benken som disseksjonen skal utføres på, da alle etterfølgende prosedyrer må utføres raskt. Sørg for å ha tilgang til en kutteenhet, for eksempel en vibratom.
    3. Forbered et opptakskammer for å opprettholde hjerneskivene før du skjærer vevet. Skaff deg et opptakskammer, bademål på 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x B x H), fra et kommersielt merke (materialfortegnelse) eller lag et internt.
      MERK: Et internt gjenvinningskammer kan fremstilles som følger: kutt en 24-brønns plate slik at ni brønner er tilgjengelige. Lim en nylonskjerm til bunnen av de ni brønnene. Med resten av brønnplaten, lage en base slik at den nedre delen av nylon er fri. Denne tilpassede basen kan plasseres inne i et 500 ml beger som inneholder aCSF (tilleggsfigur 1).
    4. Etter å ha forberedt alt, bedøv dyret med inhalert bedøvelse ved bruk av 4% -5% isofluran. Anestesien må være i henhold til en protokoll godkjent av etisk komité. Kort tid etter at dyret er immobile, utfør hale og pote klemmetester for å sikre at dyret er dypt bedøvet.
    5. Halshugg musene raskt mens hjertet fortsatt er aktivt for å øke cellens levedyktighet. Høst hjernen raskt etter halshugging.
    6. Med kirurgisk saks, gjør et snitt i huden på toppen av dyrets skalle, fra kaudal til rostral, og fjern hodebunnen fra dyrets hode. Deretter kutter du interparietalplaten langs sagittalsuturen med irissaksen og fjerner oksipitalbenet. Skyv osteotomet under parietalbenet og trekk det forsiktig ut til hjernen blir utsatt.
    7. Etter å ha eksponert hjernen, snu hodet opp ned, senk hjernen forsiktig for å visualisere trigeminusnerven på hver side, og kutt deretter trigeminusnerven ved hjelp av Castroviejo buet saks. Etter å ha visualisert hypothalamus, identifiser optisk nerve og kutt den forsiktig.
      MERK: Vær forsiktig når du kutter optisk nerve, da å trekke den vil rive det tilstøtende hypotalamiske området som inneholder AVPV / PeN-kjernen.
    8. Klipp den fremre delen av frontallappen og fjern hjernen helt. Fordyp hjernen umiddelbart i skiveløsningen til du får skivene.
  2. Kutting av hjerneprøver
    1. Legg hjernen på filterpapir (støttet på en petriskål) for å tørke overflødig løsning. Deretter, med et skarpt skjæreblad, utfør et koronat kutt som skiller hjernestammen med cerebellum fra resten av vevet.
    2. Lim deretter den kaudale delen av hjernen til bunnen av vibratomet og fyll kammeret til kutteanordningen med skiver / aCSF-løsningen avkjølt til 0-2 ° C. Under prosedyren, pakk tørris rundt vibratomkammeret for å holde skiveløsningen kald.
    3. Sett barberbladet inn i vibratomen og still inn enhetens passende skjæreparametere: hastighet = 3, frekvens = 9 og mating = 250 μm. Bruk en akryloverføringspipette (invertert Pasteur-glasspipette festet til en silikonsmokk) for å overføre skivene til gjenvinningskammeret (beskrevet i trinn 2.1.3) under vevskuttingsprosedyren. Vent 60 min for vevsgjenoppretting etter stykkeoppkjøp.

3. Celleforsegling for opptak

  1. Forsikre deg om at alt utstyret (mikroskop, forsterker, digitaliserer, mikromanipulator og andre) er slått på før du starter opptaket.
  2. Fyll opptakskammeret, fra et kommersielt merke (Table of Materials), festet til mikroskopet med aCSF-løsningen for opptak. Bruk en perfusjonspumpe til kontinuerlig perfusering av aCSF med en hastighet på 2 ml/min.
  3. Overfør et hjernestykke av interesse (en om gangen) til opptakskammeret. Bruk en akryloverføringspipette (invertert Pasteur-glasspipette festet til en silikonsmokk) for å overføre de hypotalamiske skivene til kammeret. Bruk et stykkeanker (materialfortegnelse) til å holde stykket slik at det ikke beveger seg under aCSF-perfusjonen.
  4. Plasser et stykke i midten av opptakskammeret festet til mikroskopet. Stykkeposisjonen er avgjørende for å gi god oversikt over ønsket område under mikroskopet og for en perfekt rekkevidde av opptaksmikropipetten.
  5. Bruk et nedsenkningsmikroskops objektivlinse med lav effekt (10x eller 20x) for å hjelpe til med å plassere stykket og finne interesseområdet.
  6. Etter å ha funnet interesseområdet, bytt objektivlinsen til den kraftige linsen (63x) og fokuser på vevsnivået, observer det endogene fluorescerende proteinet og formene til cellene i målområdet for å lokalisere kisspeptincellene på overflaten av hjerneskiven20.
  7. Når en mulig målcelle er plassert, merk den på dataskjermen med musepekeren eller ved å tegne et format, som en firkant, over interesseområdet. Dataskjermmerket hjelper til med å lede posisjonen til opptaksmikropipetten til cellen.
  8. Etter å ha bestemt den nøyaktige plasseringen av målcellen, løft målet og introduser opptaksmikropipetten fylt med den interne løsningen. Når mikropipetten plasseres i elektrodeholderen, må du sørge for at den interne oppløsningen er i kontakt med sølvelektroden.
    MERK: For klargjøring av mikropipetter, plassering og plassering på elektrodeholderen, se33.
  9. Påfør positivt trykk før mikropipetten senkes i aCSF-oppløsningen, for å forhindre at rusk kommer inn i mikropipetten, ved hjelp av en 1-3 ml luftfylt sprøyte koblet til mikropipettholderen gjennom et polyetylenrør (≈130 cm lenger); Påfør nesten 100-200 μL luft.
  10. Bruk mikromanipulatoren til å lede mikropipetten under midten av objektivet. Beveg knappene på mikromanipulatoren for å lede mikropipetten på X-Y-Z-aksen mot cellen av interesse.
  11. Juster fokus for å se tuppen av mikropipetten og plasser fokus nærmere, men ikke for nært, stykket. Reduser hastigheten på mikromanipulatoren og senk mikropipetten sakte til fokusplanet. Forsikre deg om at mikropipettespissen ikke trenger brått inn i skiven, men heller synker sakte ned til den berører overflaten av cellen/målområdet.
  12. Påfør lett overtrykk (≈100 μL) med den 1-3 ml luftfylte sprøyten festet til mikropipettholderen for å fjerne rusk fra innflygingsbanen.
  13. Fokuser på målcellen og beveg mikromanipulatoren sakte på X-Y-Z-aksen for å bringe mikropipetten nærmere målcellen. Når mikropipetten berøres av cellen, observeres et smilehull forårsaket av trykket som påføres gjennom mikropipettespissen (figur 2C).
  14. Etter å ha dannet smilehullet, på grunn av mikropipettens nærhet til cellen, påfør svak, kort sug gjennom munnen (1-2 s) gjennom røret som er koblet til mikropipettholderen for å generere tetningen mellom mikropipetten til cellen (gigaohmetetning eller gigaseal >1 GΩ; Figur 2D). For å danne tetningen, bruk spenningsklemmemodus på programvaren. For detaljer om seldannelse, se33.
  15. Hvis tetningen forblir stabil (gigaohmforseglingen skal være mekanisk stabil og uten støyforstyrrelser, bestemt ved observasjon i ca. 1 min), sett holdespenningen på det nærmeste fysiologiske hvilepotensialet til cellen av interesse. For kisspeptin hypothalamus nevroner anbefales -50 mV.
  16. Påfør kort sug gjennom munnen (undertrykk) med mikropipetten forseglet til cellen for å bryte plasmamembranen (figur 2E). Tilstrekkelig helcellekonfigurasjon oppnås når suging utføres med tilstrekkelig kraft, slik at den sprukne membranen ikke tetter mikropipetten og ikke tiltrekker seg en betydelig del av membranen eller til og med cellen.
  17. Kontroller systeminnstillingshåndboken som brukes. Bruk programvaren (se Materialfortegnelse) til å digitalt kontrollere og beregne seriemotstanden (SR) og helcellekapasitansen (kv).
  18. I spenningsklemmemodus, etter å ha brutt cellemembranen, aktiverer du hele cellealternativet og klikker på Auto-kommandoen som refererer til hele cellefanen. Cellens SR og kv beregnes automatisk og vises umiddelbart av programvaren. Disse parametrene kan også kontrolleres ved å utføre membrantesten med forsterkeren nevnt i materialfortegnelsen33.
  19. Sørg for å sjekke cellens levedyktighetsparametere. For kyspeptinnevroner, kontroller at de elektrofysiologiske målingene er: SR < 25 mΩ, inngangsmotstand > 0,3 GΩ, og holder nåværende absoluttverdi < 30 pA (personlige observasjoner og referanse21). Middelverdien av kv av AVPV / PeN Kisspeptin eller ARHkisspeptin nevroner er ≈ 10-12 pF i gonade-intakte mus20.
  20. Overvåk SR og cellens steady-state kapasitans under forsøkene. Forsikre deg om at SR ikke endres mer enn 20% under et opptak, og at membrankapasitansen er stabil.
  21. Sjekk programvareinnstillingene. Lag spesifikke protokoller for opptakene i henhold til typen eksperiment. For å registrere membranpotensial i strømklemmemodus, med utstyr nevnt i materialfortegnelsen, lavpassfiltrere de elektrofysiologiske signalene ved 2-4 kHz og analysere resultatene offline i en programvare (se materialfortegnelsen for programvareinformasjon).
  22. Når helcellekonfigurasjonen er riktig oppnådd, måler du synaptiske strømmer i spenningsklemmemodus (figur 2G). Registrer endringer i hvilemembranpotensial (RMP) og induserte RMP-variasjoner i strømklemmemodus (figur 2H). Endringer i RMP, som depolarisering av cellemembranen, kan induseres ved å gi et kjent legemiddel/nevrotransmitter til badet (beskrevet i trinn 3.2), som illustrert i figur 1.
    MERK: I strømklemmemodus kan positiv eller negativ strøm injiseres for å holde membranspenningen ved ønsket spenning. For kyspeptinnevroner setter vi vanligvis nullstrøminjeksjon (I = 0) for å registrere den spontane variasjonen i membranpotensialet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å studere mulige effekter av humant rekombinant veksthormon (hGH) på aktiviteten til hypotalamiske kisspeptin nevroner, utførte vi hele celle patch-clamp-opptak i hjerneskiver og vurderte om dette hormonet forårsaker akutte endringer i aktiviteten til AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin nevroner. Voksne Kiss1-Cre/GFP-hunner (diestrus-stadium) og hannmus36 ble brukt i denne studien. Gonad-intakte dyr ble valgt for forsøkene, siden egenskapene til deres hypotalamiske kisspeptin nevroner kan variere avhengig av kjønnssteroidnivåer19,20. Selv om det var utenfor omfanget av denne studien å evaluere forskjeller mellom kjønn, henviser vi leseren til Croft et al. og Frazão et al.19,20 for mer informasjon. Genmodifiserte dyr, som mus og rotter, representerer spennende verktøy for denne typen eksperimenter, siden celler som uttrykker et bestemt gen eller en selektiv-indusert ablasjon kan identifiseres av et fluorescerende protein som GFP, blant annet23,26,36. Bruken av genmodifiserte mus representerer et gjennombrudd i forståelsen av kisspeptin neuron aktivitet.

Registrerte nevroner (26 celler ut av 12 dyr) ble bestemt i henhold til nevroanatomiske egenskaper35 og uttrykket av den endogene GFP20. I strømklemmemodus ble nevroner registrert under I = 0 i helcelle patch-clamp-konfigurasjon. AVPV / PeNKisspeptin nevroner (12 celler fra ni dyr) viste en gjennomsnittlig RMP på -59,0 mV ± 3,0 mV (område: -75 mV til -46 mV), inngangsmotstand på 0,9 ± 0,1 GΩ, wcc på 12,3 pF ± 1,6 pF og SR på 19,4 ± 1,9 mΩ. Blant de registrerte nevronene viste tre av 12 AVPV/PeNKisspeptin celler spontane utladninger av aksjonspotensialer (AP) i hvile (0,1 Hz ± 0,06 Hz; gjennomsnittlig RMP for de spontant aktive cellene var -50,7 mV ± 2,7 mV). Den gjennomsnittlige RMP for ARHkisspeptin nevroner (14 celler fra 12 dyr) var -50,0 mV ± 1,5 mV (område: -62 mV til -39 mV), gjennomsnittlig inngangsmotstand var 1,7 ± 0,1 GΩ, wcc var 9,2 pF ± 0,7 pF og SR på 16,9 ± 1,7 mΩ. De fleste ARHkisspeptin nevroner var hvilende, mens fire av 14 celler viste spontane APs i hvile (0,9 Hz ± 0,5 Hz; gjennomsnittlig RMP av de spontant aktive cellene var -52,7 mV ± 1,4 mV).

Administrering av hGH (20 μg / g) til badet induserte en signifikant hyperpolarisering av RMP for mange av de registrerte nevronene, fem av 12 AVPV / PeN Kisspeptin nevroner (≈55% av cellene fra 9 mus), og ni av 14 registrerte ARH kisspeptin nevroner (≈65% av cellene fra 12 mus, p = 0,0006, Fishers eksakte test; Figur 3). AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin hyperpolariserte nevroner endret RMP signifikant sammenlignet med de ikke-responsive cellene (figur 3B, E; Mann-Whitney-testen). Effektene på RMP (figur 3C,F; gjentatte målinger ANOVA og Tukeys post-test) ble fulgt av en signifikant reduksjon av helcelleinngangsmotstanden (IR) på AVPV/PeN Kisspeptin (0,9 ± 0,1 GΩ til 0,7 ± 0,1 GΩ under hGH-applikasjon, p = 0,02; Figur 3D), og på ARHkisspeptin (1,7 ± 0,1 GΩ til 1,0 ± 0,1 GΩ under hGH-applikasjon, p < 0,0001; gjentatte målinger ANOVA og Tukeys post-test; Figur 3G) Neurons. I tillegg ble frekvensen av spontane AP (fAP) av hGH-hyperpolariserte nevroner redusert i begge populasjoner av celler (0,1 Hz ± 0,06 Hz til 0,0 Hz ± 0,0 Hz i AVPV / PeN Kisspeptin og 1,0 Hz ± 0,5 Hz til 0,2 Hz ± 0,1 Hz i ARHkisspeptin nevroner). Omfanget av denne reduksjonen nådde imidlertid ikke et nivå av statistisk signifikans (p > 0,05, Mann-Whitneys test). Etter utvaskingen av hGH ble RMP og IR gjenopprettet til baseline (figur 3A, C, D, F, G). De resterende kisspeptinnevronene responderte ikke på hGH-administrasjon.

Vi har tidligere vist at pGH ikke induserer noen effekter på hypothalamus kisspeptin neuron aktivitet (se Silveira et al.25; Figur 3H). Merk at det er kjent at hGH kan aktivere prolaktin (PRL) reseptorer i tillegg til GH-reseptorer37,38. Dessuten depolariserer PRL indirekte bare ≈20% av AVPV / PeNKisspeptin nevroner hos mus24. I motsetning til dette modulerer PRL ikke den raske synaptiske overføringen av ARHkisspeptin celler24. Derfor synes den hGH-induserte hyperpolariseringseffekten rapportert her å være uspesifikk. De observerte forskjellene kan avhenge av variabler som legemiddelkonsentrasjon, artsforskjell (menneske vs. mus), eller til og med tilstedeværelsen av salter i sammensetningen av de brukte legemidlene, som tidligere rapportert28.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram som oppsummerer helcellelapp-klemmeteknikkens bidrag til kunnskapen om kysspeptinnevronenes aktivitet. Kisspeptin nevroner (vist i grønt) er lokalisert i anteroventral periventrikulær og rostral periventrikulær kjerner (AVPV / PeN) og bueformet kjernen i hypothalamus (ARH). AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin celler sender direkte forbindelser til gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH) nevroners soma lokalisert i det preoptiske området (POA) og deres terminaler ved median eminens (ME), som kulminerer i moduleringen av hypothalamus-hypofyse-aksen (HPG). Ulike nevromodulatorer, som hormoner, har vist seg å differensielt modulere aktiviteten til AVPV / PeN Kisspeptin og ARHkisspeptin nevroner. Mulige effekter på hvilemembranpotensialet er skjematisk demonstrert ved representative sporinger oppnådd ved bruk av helcellebane-klemmeteknikk og strøm-klemmeopptak. Den røde fargen indikerer at en spesifikk nevrotransmitter induserer depolariseringen av hvilemembranpotensialet (RMP)17,22,24,26,28,29,30,31,32; den blå fargen indikerer ingen effekt på RMP 24,25,26,27,30. Den stiplede linjen indikerer RMP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Grunnleggende trinn for å oppnå forsegling av cellen av interesse ved helcelle patch-clamp-teknikken. (A,B) Representative fotomikrografer av hjerneskiver (250 μm) som inneholder kisspeptinceller ved den anteroventrale periventrikulære kjernen (AVPV) og bueformede kjernen i hypothalamus (ARH). Kisspeptin nevroner ble identifisert ved grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk. (C) Fotomikrograf som viser en mikropipette (inneholdende elektrolyttløsning [intern oppløsning]) nær nok til cellen til å lage et smilehull i plasmamembranen for å utføre forseglingen. (D,E) Mildt undertrykk (munnsug utført på et rør festet til headstage og mikropipette) er nødvendig for å forsegle cellemembranen til mikropipetten (D). En annen påføring av negativt trykk (mildt og kortvarig) er nødvendig for å indusere plasmamembranbrudd (E). (F) Registreringen av celleaktiviteten utføres av et mekanisk oppsett som brukes til patch-clamp-eksperimenter. Etter å ha brutt plasmamembranen, kan strømmer som strømmer gjennom de ioniske kanalene i den lappede cellen registreres av en elektrode koblet til en svært følsom forsterker. En tilbakekoblingsmotstand genererer strømmen som trengs for spenningsklemme (G) eller strømklemme (H) opptak. Forkortelser: 3V = tredje ventrikkel; ME = median eminens. Skalastenger: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Testing av legemiddelspesifisitet. (A) Representativt strømklemmeopptak som viser at humant rekombinant veksthormon (hGH) induserte en hyperpolarisering av hvilemembranpotensialet (RMP) til kisspeptinnevronene lokalisert ved den bueformede kjernen i hypothalamus (ARHkisspeptin). (VG Nett) Bardiagrammer som viser gjennomsnittlig endring i hvilemembranpotensialet (RMP) (B, C, E, F) og gjennomsnittlig inngangsmotstand (IR) (D, G) av hGH-responsive kisspeptin nevroner lokalisert ved anteroventral periventrikulær og rostrale periventrikulære kjerner (AVPV /PeN Kisspeptin) (B-D) eller ARH (E-G). Representativ strømklemmeregistrering som viser at svineveksthormon (pGH) ikke induserte noen effekt på RMP av ARHkisspeptin nevroner, som tidligere rapportert25 (H). Signifikanstestene som brukes er Mann-Whitney-testen for (B) og (E), og gjentatte målinger ANOVA og Tukeys posttest for (C,D,F,G). Den stiplede linjen indikerer RMP. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Intern løsning (100 ml)
Salt FW (g/mol) Konsentrasjon Vekt (g)
K-glukonat 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
KCl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH = 7,3 / osmolaritet = 275 - 280 mOsm

Tabell 1: Reagenser til fremstilling av den interne løsningen. Tabellen inneholder molekylvekten (FW), ønskede konsentrasjoner og den beregnede vekten av saltene for fremstilling av 100 ml oppløsning.

aCSF/kutteoppløsning (250 ml)
Salt FW Konsentrasjon Vekt (g)
Sukrose 342.3 238 mM 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-glukose 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7,3 / osmolaritet = 290 - 295 mOsm

Tabell 2: Reagenser for å fremstille kutteløsningen. Tabellen inneholder molekylvekten (FW), ønskede konsentrasjoner og beregnet vekt av saltene for fremstilling av 250 ml oppløsning. Hjernen er nedsenket i denne løsningen for å bli skåret.

aCSF for opptak (1 L)
Salt FW Konsentrasjon Vekt (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1,2 mM 0.296
D-glukose 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7,3 / osmolaritet = 290-300 mOsm

Tabell 3: Reagenser for å klargjøre aCSF for opptak. Tabellen inneholder molekylvekten (FW), ønskede konsentrasjoner og beregnet vekt av saltene for fremstilling av 1 liter oppløsning.

Tilleggsfigur 1: Eksempel på et egenprodusert restitusjonskammer. (A,B) Et internt gjenvinningskammer kan fremstilles som følger: kutt en 24-brønns plate slik at ni brønner er tilgjengelige. Lim en nylonskjerm til bunnen av de ni brønnene. Med resten av brønnplaten, lage en base slik at den nedre delen av nylon er fri. (C) Denne tilpassede basen kan plasseres inne i et 500 ml beger som inneholder kunstig spinalvæske (aCSF) konstant mettet med karbogen (95% O2 og 5% CO2). (D) Begeret som holder gjenopprettingskammeret holdes i vannbadet under eksperimentering. (E,F) En akryloverføringspipette brukes til å overføre hjerneskivene til gjenopprettingskammeret. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utviklingen av helcellelappeklemmeteknikken hadde en betydelig innvirkning på det vitenskapelige samfunn, og ble ansett som av avgjørende betydning for å utvikle vitenskapelig forskning og muliggjøre flere funn. Dens innvirkning på vitenskapen var nok til å kulminere i Nobelprisen i medisin i 1991, da denne oppdagelsen åpnet døren for en bedre forståelse av hvordan ionkanaler fungerer under fysiologiske og patologiske forhold, samt identifisering av potensielle mål for terapeutiske midler 11,39,40,41. Innen medisin var et av de fremragende funnene som ble gjort ved hjelp av denne teknikken, at flere stoffer som ble brukt klinisk interagerer direkte med ionekanaler (f.eks. lokalbedøvelse, antiarytmika, antidiabetika og muskelavslappende midler)42. Derfor er anvendeligheten tydelig i kliniske institutter og grunnforskningsavdelinger. Denne artikkelen beskriver protokollen for grunnleggende forberedelse for å utføre helcelle patch-clamp eksperimenter på hjerneskiver som inneholder hypothalamus kisspeptin nevroner. Vi skisserer de grunnleggende trinnene og fremhever bemerkelsesverdige parametere som må kontrolleres for å oppnå vev og forberede løsninger for patch-clamp-teknikken. Denne artikkelen kan imidlertid ikke fullt ut beskrive kompleksiteten til denne teknikken og mekanismene som er involvert i hver type opptak, spesielt analysen. For videre teoretisk læring anbefales noen bøker og anmeldelser om patch-clamp-teknikken 10,43,44,45,46.

Hver løsning som brukes i patch-clamp-metoden har et bestemt formål; Derfor må dens spesifikke sammensetninger og kriterier vedtas strengt under forberedelsen. For eksempel bør den interne løsningens sammensetning bestemmes i henhold til eksperimentets mål, siden den varierer avhengig av hvilken type strøm som skal måles. Den kloridbaserte løsningen nevnt her, hvor Cl- (15 mM) etterligner den fysiologiske konsentrasjonen av cellecytoplasma47, brukes til å studere aktive og passive nevronegenskaper eller responser på synaptisk inngang. Det er viktig å understreke at kloridinnholdet i den interne løsningen holder kloridlikevektspotensialet på optimale nivåer for celleopptak (i nevnte løsning ECL er det ca. -59 mV). Den intracellulære kloridkonsentrasjonen kan estimeres ved å evaluere reverseringspotensialet for GABA-indusert strøm (EGABA), forutsatt at all strøm gjennom GABAA-reseptoren bæres av Cl-21,48. For studiet av hypothalamus kisspeptin nevroner, må man vurdere at den intracellulære Cl- konsentrasjonen for ARH kisspeptin er høyere enn for AVPV / PeNKisspeptin celler21. Denne egenskapen må vurderes når du planlegger et eksperiment. Osmolariteten til den interne løsningen anbefales å være minst 5 % lavere enn for aCSF for opptak for å unngå tap av forsegling på grunn av mulig hevelse og/eller cellesvekkelse33,47. Hvis det er behov for å legge til en intracellulær forbindelse som videre kan brukes som en cellemarkør til den interne løsningen, for eksempel biocytin eller et intracellulært fargestoff (f.eks. Alexa Fluor 594), kan K + -nivåene reduseres slik at osmolariteten kontinuerlig kan opprettholdes 20,47,49,50.

Å utføre en rask hjernedisseksjon og opprettholde en lav temperatur (0-2 °C) under kutting med en passende kutteløsning er avgjørende. Kutteløsningene kan variere i henhold til typen celle og / eller hjernegruppe som evalueres33,47. ACSF-løsningen som brukes til å oppnå hjerneskivene (dvs. skiveløsning) har vanligvis en annen sammensetning enn aCSF for opptak (for sammenligning, se tabell 2 og tabell 3). Kationkonsentrasjonene (Ca 2+ og Mg2+) kan justeres for å modifisere eksitabiliteten til nevroner, noe som også kan påvirke avfyringsterskelen og nevrotransmitterfrigjøringen47. Lav Ca 2+ og høy Mg2+ media er mye brukt for å minimere mulige excitotoxiske prosesser (for mer informasjon, se51). I tillegg kan lav Ca 2 + og høy Mg2 + media stimulere hypothalamus neuron aktivitet52. Når det gjelder aCSF for opptak, er noen egenskaper like. Buffersystemet er basert på NaHCO3, høye NaCl-konsentrasjoner (generelt >100 mM) og lave KCl-konsentrasjoner (generelt <5 mM), relative konsentrasjoner av Ca 2+ og Mg2+ (2: 1 brukes ofte) er vanligvis rundt 2 mM, og glukosenivåene kan variere fra 1 til 10 mM47. Foruten variasjoner av løsningenes osmolaritet, pH eller temperaturendringer (digitalt kontrollert til å være mellom 30-32 °C), er det viktig å fremheve at andre problemer kan oppstå under den eksperimentelle protokollen som vesentlig forstyrrer eksperimenteringen. Elektrofysiologiske målinger må være stabile under registreringene, og eventuelle variasjoner må ha en kritisk avlesning. For eksempel tar SR-endringer hensyn til cellulær tilgang i helcellemodus og har betydelige konsekvenser for målte strømmer og potensialer. Videre er det viktig å understreke at en relevant begrensning knyttet til patch-clamp-metoden som må vurderes, er mekanisk overstimulering av cellen ved overdreven suge-/trykkprotokoller som kan indusere morfologiske og funksjonelle endringer53. Denne skjevheten er ofte vanskelig å kontrollere i protokoller der suging utføres gjennom munnen i stedet for en enhet som nøyaktig kan kontrollere sugeintensiteten som påføres. I tillegg kan vevsrelaterte problemer, som kulminerer med en høy prosentandel av celledødelighet, oppstå på grunn av utilstrekkelig disseksjon, hypoksi eller musens helsetilstand som en forsker ikke kan identifisere ved observasjon.

Den største fordelen med helcellepatch-klemmeteknikken er evnen til å registrere nevroner i bestemte hjernegrupper av interesse nøyaktig. Denne teknikken har hatt enorm nytte av etableringen av genmodifiserte dyr. Vår gruppe arbeider vanligvis med en musemodell som uttrykker hrGFP under Kiss1-genpromotoren eller en annen som uttrykker Cre-recombinase under Kiss1-genpromotoren og GFP under Cre-betinget uttrykk. Imidlertid er det mange validerte dyremodeller i dag23,26,36. I tillegg representerer fraværet av blod-hjernebarrieren og det faktum at det ekstracellulære og intracellulære miljøet lett kan kontrolleres og manipuleres, fordeler med denne metoden; Imidlertid representerer de ikke nødvendigvis en fysiologisk tilstand. Blant begrensningene i denne teknikken sammenlignet med in vivo-preparater, eller andre opptakstyper som tar sikte på å bevare den cytoplasmatiske ioniske konsentrasjonen, for eksempel opptak på celle eller perforert, er det viktig å nevne at invasiviteten til helcellekonfigurasjonen forårsaker dialyse av cytoplasmainnholdet54. Dialyse kan føre til avbrudd av molekylære aspekter som er nødvendige for at enkelte fenomener skal utvikle seg eller uttrykkes. Ved å registrere fra skiver, må det huskes at de fleste av nevronenes projeksjoner er seksjonert. Dermed er det utenfor teknikkens omfang å evaluere hvor mye denne forstyrrelsen påvirker de observerte effektene eller en fysiologisk tilstand. Som nevnt utføres koronale hjerneskiver på 200-300 μm vanligvis for å studere aktiviteten til hypotalamiske kisspeptin nevroner 17,19,20,21,34. Begrensningen av å bruke en tykkere hjerneskiveseksjon for å studere kisspeptinceller og forskjellige skivevinkler som opprettholder spesifikk AVPV / PeN- eller ARH-tilkobling55 trenger ytterligere undersøkelser. I tillegg, ved å teste effekten av et hormon / stoff, syntetisk eller ikke, på RMP av et nevron, er flere studier basert på stoffet EC50 (hvis det er kjent) eller på publiserte data som viser at en bestemt konsentrasjon er effektiv for å aktivere avfyringshastighet eller endre [Ca2 +] i nivåer. Man bør imidlertid være oppmerksom på sammensetningen/spesifisiteten til medikamentet som skal brukes i forsøkene, da det er mulig at rensede syntetiske stoffer, sammenlignet med andre lignende stoffer, kan ha antagonistiske effekter28. Som vist tidligere25, mens renset pGH induserer ingen effekt på hypothalamus kisspeptin neuron aktivitet, produserte hGH kontroversielle data (se figur 3). Lignende resultater ble vist når insulineffekter på ARH ble vurdert28. Derfor bør stoffspesifisitet vurderes når man planlegger et eksperiment og tolker de oppnådde resultatene.

Patch-clamp-teknikken er et utmerket verktøy for å skaffe data om nevronelektrisk aktivitet og har betydelig bidratt til kunnskapen om flere nevronpopulasjoner, for eksempel kisspeptin-nevronene. De fleste detaljene som er gitt her, brukes vanligvis til opptak av hypotalamiske nevroner, som vi tidligere har rapportert 25,50,56,57,58,59,60. Det er viktig at for å registrere andre nevronpopulasjoner i tillegg til kisspeptin nevroner, må man kjenne eller bestemme de elektrofysiologiske målingene som kan bidra til å identifisere celletyper, for eksempel cellekapasitans, SR, inngangsmotstand, cellefyringsmønster og andre parametere. Disse egenskapene varierer mellom forskjellige hjerneceller, hjernekjerner og fysiologiske eller induserte tilstander, for eksempel sirkulerende kjønnssteroidnivåer 16,19,20,21,61, noe som vesentlig kan forstyrre den kritiske analysen av resultatene. I tillegg er det nødvendig å forstå de mulige variablene som er involvert i vevpreparasjon og deres tilhørende fordeler og begrensninger for å arbeide med denne teknikken. Alle trinnene som er beskrevet her, må utføres med omhu, da enhver endring i variablene som er involvert i protokollen, kan forstyrre resultatene drastisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter skal oppgis.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av São Paulo Research Foundation [FAPESP grant numbers: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); og av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Denne måneden i JoVE hjernen skive strøm-klemme opptak Kiss1 hypothalamus
Hypothalamus kisspeptin nevroner som et mål for helcelle patch-klemme opptak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter