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Neuroscience

Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64989
, , ,
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas,Universidade de Sao Paulo

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer une pince de patch à cellules entières sur des tranches de cerveau contenant des neurones kisspeptine, le principal modulateur des cellules de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH). En ajoutant des connaissances sur l’activité des neurones kisspeptine, cet outil électrophysiologique a servi de base à des progrès significatifs dans le domaine de la neuroendocrinologie au cours des 20 dernières années.

Abstract

Les kisspeptines sont essentielles à la maturation de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) et à la fertilité. Les neurones hypothalamiques kisspeptine situés dans le noyau périventriculaire antéroventral et le noyau périventriculaire rostral, ainsi que le noyau arqué de l’hypothalamus, projettent les neurones de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), entre autres cellules. Des études antérieures ont démontré que la signalisation de la kisspeptine se produit par le récepteur Kiss1 (Kiss1r), ce qui stimule finalement l’activité neuronale de la GnRH. Chez l’homme et les modèles animaux expérimentaux, les kisspeptines sont suffisantes pour induire la sécrétion de GnRH et, par conséquent, la libération d’hormone lutéinisante (LH) et d’hormone folliculostimulante (FSH). Puisque les kisspeptines jouent un rôle essentiel dans les fonctions de reproduction, les chercheurs travaillent à évaluer comment l’activité intrinsèque des neurones hypothalamiques kisspeptine contribue aux actions liées à la reproduction et à identifier les neurotransmetteurs/neuromodulateurs primaires capables de modifier ces propriétés. La technique de patch-clamp à cellules entières est devenue un outil précieux pour étudier l’activité des neurones kisspeptine dans les cellules de rongeurs. Cette technique expérimentale permet aux chercheurs d’enregistrer et de mesurer les courants ioniques excitateurs et inhibiteurs spontanés, le potentiel de membrane au repos, le potentiel d’action et d’autres propriétés électrophysiologiques des membranes cellulaires. Dans la présente étude, des aspects cruciaux de la technique de patch-clamp à cellules entières, connus sous le nom de mesures électrophysiologiques qui définissent les neurones hypothalamiques de la kisspeptine, et une discussion des questions pertinentes concernant la technique, sont examinés.

Introduction

Hodgkin et Huxley ont fait le premier enregistrement intracellulaire d’un potentiel d’action décrit dans plusieurs études scientifiques. Cet enregistrement a été réalisé sur l’axone du calmar, qui a un grand diamètre (~500 μm), permettant de placer une microélectrode à l’intérieur de l’axone. Ce travail a fourni de grandes possibilités pour la recherche scientifique, aboutissant plus tard à la création du mode tension-pince, qui a été utilisé pour étudier la base ionique de la génération de potentiel d’action 1,2,3,4,5,6,7,8. Au fil des ans, la technique a été améliorée et elle est devenue largement appliquée dans la recherche scientifique 6,9. L’invention de la technique du patch-clamp, qui a eu lieu à la fin des années 1970 grâce à des études initiées par Erwin Neher et Bert Sakmann, a permis aux chercheurs d’enregistrer des canaux ioniques uniques et des potentiels ou courants de membrane intracellulaire dans pratiquement tous les types de cellules en utilisant une seule électrode 9,10,11,12 . Les enregistrements patch-clamp peuvent être effectués sur une variété de préparations tissulaires, telles que des cellules cultivées ou des tranches de tissus, soit en mode de serrage de tension (maintien de la membrane cellulaire à une tension définie permettant l’enregistrement, par exemple, de courants dépendants de la tension et de courants synaptiques) ou en mode de pince de courant (permettant l’enregistrement, par exemple, des changements dans le potentiel de membrane au repos induits par les courants ioniques, les potentiels d’action et la fréquence du potentiel postsynaptique).

L’utilisation de la technique patch-clamp a rendu possible plusieurs découvertes notables. En effet, les résultats fondamentaux sur les propriétés électrophysiologiques des neurones hypothalamiques kisspeptine situés au niveau des noyaux périventriculaire antéroventrulaire et périventriculaire rostral (AVPV/PeNKisspeptin), également connu sous le nom de zone périventriculaire rostrale du troisième ventricule (RP3V), et le noyau arqué de l’hypothalamus (ARHkisspeptine)13,14,15 présentent un intérêt particulier. En 2010, Ducret et al. ont effectué les premiers enregistrements de neurones AVPV / PeNKisspeptinchez la souris en utilisant un autre outil électrophysiologique, la technique de patch-clamp à cellules lâches. Ces études ont fourni une description électrique des neurones AVPV/PeNKisspeptin et ont démontré que leurs schémas de déclenchement dépendent du cycle œstral16. En 2011, Qiu et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières pour démontrer que les neurones ARHkisspeptin expriment les courants endogènes du stimulateur cardiaque17. Par la suite, Gottsch et al. ont montré que les neurones kisspeptine présentent une activité spontanée et expriment à la fois des courants calciques de type h (stimulateur cardiaque) et de type T, suggérant que les neurones ARHkisspeptine partagent des propriétés électrophysiologiques avec d’autres neurones cardiaques du système nerveux central18. De plus, il a été démontré que les neurones de lakisspeptine ARH présentent des taux de déclenchement sexuellement dimorphes et que les neurones AVPV/PeNKisspeptin présentent un potentiel de membrane au repos bimodal (RMP) influencé par les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP)19,20. En outre, il a été établi que les stéroïdes gonadiques affectent positivement l’activité électrique spontanée des neurones kisspeptine chez la souris 19,20,21. Les premiers travaux qui étudient les propriétés électrophysiologiques des neurones kisspeptine sont mentionnés 16,17,18,19,20. Depuis lors, de nombreuses études ont utilisé la technique de patch-clamp à cellules entières pour démontrer quels facteurs/neuromodulateurs sont suffisants pour moduler l’activité électrique des neurones kisspeptine (Figure 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Compte tenu de l’importance de cette technique pour l’étude des neurones nécessaires à la reproduction, parmi d’autres types de cellules non abordés ici, cet article décrit les étapes de base pour le développement de la technique de patch-clamp à cellules entières, telles que la préparation des solutions, la dissection et le découpage du cerveau, et l’exécution du sceau de la membrane cellulaire pour les enregistrements. De plus, des questions pertinentes sur la technique sont discutées, telles que ses avantages, ses limites techniques et ses variables importantes qui doivent être contrôlées pour une performance expérimentale optimale.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo et ont été effectuées conformément aux directives éthiques adoptées par le Collège brésilien d’expérimentation animale. 1. Préparation des solutions Préparation de la solution interneREMARQUE : La solution interne remplit la micropipette patch-clamp et entrera en contact avec l’intéri…

Representative Results

Pour étudier les effets possibles de l’hormone de croissance recombinante humaine (hGH) sur l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine, nous avons effectué des enregistrements de patch-clamp à cellules entières dans des tranches de cerveau et évalué si cette hormone provoque des changements aigus dans l’activité des neurones AVPV / PeNKisspeptin et ARHkisspeptin. Des souris adultes Kiss1-Cre/GFP femelles (stade diestrus) et mâles36 ont été utilisées…

Discussion

Le développement de la technique de patch-clamp à cellules entières a eu un impact significatif sur la communauté scientifique, étant considéré comme d’une importance primordiale pour le développement de la recherche scientifique et permettant plusieurs découvertes. Son impact sur la science a été suffisant pour aboutir au prix Nobel de médecine en 1991, car cette découverte a ouvert la porte à une meilleure compréhension du fonctionnement des canaux ioniques dans des conditions physiologiques et patholo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par la Fondation de recherche de São Paulo [numéros de subvention FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); et par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Finance Code 001 » (HRV).

Materials

Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various –
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus – can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices – Commander Software
LAS X wide field system Leica – Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various –
cyanoacrylate glue LOCTITE/various –
Decapitation scissors various –
Filter paper various –
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various –
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various –
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518
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References

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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).
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