التحفيز الآلي متعدد الوسائط والتسجيل العصبي المتزامن من كائنات صغيرة متعددة
Summary
نقدم طريقة للتحفيز الكيميائي والمتعدد الوسائط المرن وتسجيل النشاط العصبي المتزامن من العديد من ديدان Caenorhabditis elegans . تستخدم هذه الطريقة الموائع الدقيقة والأجهزة والبرامج مفتوحة المصدر وتحليل البيانات الآلي الخاضع للإشراف لتمكين قياس الظواهر العصبية مثل التكيف والتثبيط الزمني والحديث المتبادل للتحفيز.
Abstract
ساهمت مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا الفلورية بشكل كبير في فهمنا للديناميكيات العصبية من مستوى الخلايا العصبية الفردية إلى دوائر الدماغ بأكملها. ومع ذلك ، قد تختلف الاستجابات العصبية بسبب الخبرة السابقة أو الحالات الداخلية أو العوامل العشوائية ، مما يولد الحاجة إلى طرق يمكنها تقييم الوظيفة العصبية عبر العديد من الأفراد في وقت واحد. في حين أن معظم تقنيات التسجيل تفحص حيوانا واحدا في كل مرة ، فإننا نصف استخدام الفحص المجهري واسع المجال لتوسيع نطاق التسجيلات العصبية إلى العشرات من Caenorhabditis elegans أو غيرها من الكائنات الحية دون المليمترية في وقت واحد. تتيح الأجهزة والبرامج مفتوحة المصدر مرونة كبيرة في برمجة التجارب المؤتمتة بالكامل التي تتحكم في شدة وتوقيت أنواع التحفيز المختلفة ، بما في ذلك المحفزات الكيميائية والبصرية والميكانيكية والحرارية والكهرومغناطيسية. على وجه الخصوص ، توفر أجهزة تدفق الموائع الدقيقة تحكما دقيقا ومتكررا وكميا في المنبهات الحسية الكيميائية بدقة زمنية دون الثانية. ثم يستخرج خط أنابيب تحليل البيانات شبه الآلي NeuroTracker الاستجابات العصبية الفردية وعلى مستوى السكان للكشف عن التغييرات الوظيفية في الإثارة والديناميكيات العصبية. تقدم هذه الورقة أمثلة على قياس التكيف العصبي ، والتثبيط الزمني ، والحديث المتبادل للتحفيز. تزيد هذه التقنيات من دقة التحفيز وتكراره ، وتسمح باستكشاف التباين السكاني ، ويمكن تعميمها على إشارات الفلورسنت الديناميكية الأخرى في الأنظمة الحيوية الصغيرة من الخلايا والكائنات العضوية إلى الكائنات الحية والنباتات بأكملها.
Introduction
سمحت تقنيات تصوير الكالسيوم بالتسجيل غير الباضع للديناميكيات العصبية في الجسم الحي في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري الفلوري ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المعبر عنها في الخلايا المستهدفة1،2،3. تستخدم هذه المستشعرات عادة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، مثل عائلة الببتيد GFP-calmodulin-M13 (GCaMP) ، لزيادة شدة التألق عند تنشيط الخلايا العصبية وارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. كان تصوير الكالسيوم قويا بشكل خاص في الديدان الخيطية C. elegans لفحص كيفية عمل الخلايا العصبية والدوائر العصبية في الحيوانات الحية والتصرف4،5،6،7،8،9،10 ، لأن طبيعتها الشفافة تعني عدم الحاجة إلى عملية جراحية للوصول البصري ، وتستهدف محفزات الجينات الخاصة بالخلية التعبير إلى الخلايا محل الاهتمام. غالبا ما تستخدم هذه التقنيات أجهزة الموائع الدقيقة ، والتي توفر بيئات يتم التحكم فيها بدقة لدراسة الظواهر البيولوجية والكيميائية والفيزيائية على نطاق فيزيائي صغير11,12. تكثر أجهزة الموائع الدقيقة لقياس النشاط العصبي ، مع تصميمات جديدة قيد التطوير باستمرار ، ويتم تصنيعها بسهولة في مختبر الأبحاث. ومع ذلك ، فإن العديد من التصميمات تحبس حيوانا واحدا في كل مرة ، مما يحد من الإنتاجية التجريبية7،9،13. غالبا ما تختلف الاستجابات العصبية اختلافا كبيرا بين الحيوانات بسبب الاختلافات في الخبرة السابقة ، أو الحالات الداخلية مثل الإجهاد أو الجوع ، أو العوامل العشوائية مثل مستويات التعبير الجيني. هذه الاختلافات تحدد الحاجة إلى طرق يمكن أن تحفز وتراقب في وقت واحد العديد من الحيوانات واستخراج المعلومات من الأفراد4.
بالإضافة إلى ذلك ، تصبح بعض الظواهر العصبية واضحة فقط في ظل ظروف تحفيز محددة ، مثل التثبيط الزمني14 ، والذي يشير إلى قمع قصير للاستجابات عندما يحدث التحفيز في تتابع سريع. يمكن للأنظمة الفيزيولوجية الكهربية أن تدفع النشاط العصبي عبر مساحة تحفيز واسعة لهذا الغرض ، حيث تعدل ، على سبيل المثال ، تيار النبض الكهربائي ، والجهد ، والتردد ، وشكل الموجة ، ودورة العمل ، وتوقيت قطارات التحفيز الدورية. سيستفيد التحفيز غير المباشر بواسطة المحفزات المكتشفة بشكل طبيعي أو الأنظمة البصرية الوراثية من اتساع مماثل لآليات التحكم. في الوقت الحالي ، يتم تقديم العديد من المحفزات الطبيعية بطريقة “تشغيل-إيقاف” بسيطة ، مثل عرض الرائحة وإزالتها ، باستخدام أنظمة تجارية كانت بطيئة في إضافة المرونة. ومع ذلك ، يمكن للمتحكمات الدقيقة غير المكلفة الآن أتمتة توصيل عدة أنواع من المحفزات بطريقة قابلة للتخصيص وفقا لاحتياجات الباحثين. بالاقتران مع الموائع الدقيقة ، حققت هذه الأنظمة هدف زيادة الإنتاجية التجريبية والمرونة ، مما يسمح بقياس الاستجابات العصبية لمجموعة متنوعة من المحفزات الدقيقة في وقت واحد في العديد من الحيوانات 4,6. يمكن استخدام التحفيز متعدد الوسائط لمزيد من استجواب الدوائر العصبية ، مثل مراقبة التغيرات في استثارة الأعصاب عند التحفيز المستمر قبل وأثناء وبعد الاضطراب المتعامد مثل التعرض للأدوية4. إن فوائد أنظمة الفحص المجهري المفتوحة وغير المكلفة واضحة للنهوض بالبحث العلمي ، ولكن من الناحية العملية ، يمكن أن تعيق الحاجة إلى مصادر الأجزاء والبناء والتحقق من الأداء اعتماد هذه التقنيات.
يهدف هذا البروتوكول إلى التخفيف من بعض هذه التحديات التقنية. في حين ركزت البروتوكولات السابقة على استخدام جهاز الموائع الدقيقة والتحفيز الأساسي9،15،17 ، فإننا نصف هنا بناء واستخدام نظام توصيل تحفيز مرن وآلي ومتعدد الوسائط للتصوير العصبي في C. elegans أو الكائنات الصغيرة الأخرى باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة الموصوفة سابقا4. تتم برمجة النظام مفتوح المصدر عبر ملفات نصية بسيطة لتحديد التجارب ، ويقوم برنامج تحليل البيانات NeuroTracker باستخراج بيانات النشاط العصبي بشكل شبه تلقائي من مقاطع الفيديو المجهرية. نوضح هذا النظام بأمثلة لتقييم التثبيط الزمني ، وإزالة التثبيط ، والحديث المتبادل للتحفيز باستخدام الخلايا العصبية الحسية الكيميائية AWA ، والتي تزيل الاستقطاب استجابة لروائح الطعام المختلفة أو استجابة للضوء عند التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء البصري 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، نصف نظام الفحص المجهري المفتوح الوصول لتقييم ظواهر النشاط العصبي باستخدام التسليم الدقيق زمنيا لأنماط التحفيز المختلفة. توفر منصة الموائع الدقيقة محفزات قابلة للتكرار مع إبقاء عشرات الحيوانات في مجال رؤية المجهر. يسمح عدد قليل من حزم برامج الفحص المجهري التجاري بالب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Fox Avery لاختبار هذه البروتوكولات ومراجعة المخطوطة وإريك هول للمساعدة في البرمجة. تم توفير التمويل للطرق المعروضة هنا جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
