Automatiserad multimodal stimulering och samtidig neuronal inspelning från flera små organismer
Summary
Vi presenterar en metod för flexibel kemisk och multimodal stimulering och registrering av samtidig neural aktivitet från många Caenorhabditis elegans-maskar . Denna metod använder mikrofluidik, hårdvara och mjukvara med öppen källkod och övervakad automatiserad dataanalys för att möjliggöra mätning av neuronala fenomen som anpassning, tidshämning och stimulusöverhörning.
Abstract
Fluorescerande genetiskt kodade kalciumindikatorer har bidragit starkt till vår förståelse av neural dynamik från nivån av enskilda neuroner till hela hjärnkretsar. Neurala svar kan dock variera beroende på tidigare erfarenhet, interna tillstånd eller stokastiska faktorer, vilket genererar behovet av metoder som kan bedöma neural funktion hos många individer samtidigt. Medan de flesta inspelningstekniker undersöker ett enda djur åt gången, beskriver vi användningen av bredfältmikroskopi för att skala upp neuronala inspelningar till dussintals Caenorhabditis elegans eller andra submillimeterskaliga organismer samtidigt. Hårdvara och programvara med öppen källkod möjliggör stor flexibilitet vid programmering av helautomatiska experiment som styr intensiteten och tidpunkten för olika stimulanstyper, inklusive kemiska, optiska, mekaniska, termiska och elektromagnetiska stimuli. I synnerhet ger mikrofluidiska flödesanordningar exakt, repeterbar och kvantitativ kontroll av kemosensoriska stimuli med tidsupplösning under en sekund. NeuroTrackers halvautomatiserade dataanalyspipeline extraherar sedan individuella och populationsomfattande neurala svar för att avslöja funktionella förändringar i neural excitabilitet och dynamik. Denna uppsats presenterar exempel på mätning av neuronal anpassning, temporal hämning och stimulansöverhörning. Dessa tekniker ökar precisionen och repeterbarheten av stimulering, möjliggör utforskning av populationsvariationer och är generaliserbara till andra dynamiska fluorescerande signaler i små biosystem från celler och organoider till hela organismer och växter.
Introduction
Kalciumavbildningstekniker har möjliggjort icke-invasiv registrering av in vivo neural dynamik i realtid med hjälp av fluorescensmikroskopi och genetiskt kodade kalciumindikatorer uttryckta i målcellerna 1,2,3. Dessa sensorer använder vanligtvis ett grönt fluorescerande protein (GFP), såsom GFP-kalmodulin-M13-peptidfamiljen (GCaMP), för att öka fluorescensintensiteten vid neuronal aktivering och förhöjda intracellulära kalciumnivåer. Kalciumavbildning har varit särskilt kraftfull i nematoden C. elegans för att undersöka hur neuroner och neurala kretsar fungerar i levande, beter sig djur 4,5,6,7,8,9,10, eftersom deras transparenta natur innebär att ingen kirurgisk process krävs för optisk åtkomst, och cellspecifika genpromotorer riktar uttryck till cellerna av intresse. Dessa tekniker använder ofta mikrofluidiska anordningar, som ger exakt kontrollerade miljöer för att studera biologiska, kemiska och fysiska fenomen i liten fysisk skala11,12. Mikrofluidiska enheter finns i överflöd för att mäta neural aktivitet, med nya konstruktioner som kontinuerligt utvecklas, och de tillverkas lätt i forskningslaboratoriet. Men många mönster fångar ett enda djur åt gången, vilket begränsar experimentell genomströmning 7,9,13. Neurala svar varierar ofta väsentligt mellan djur på grund av skillnader i tidigare erfarenhet, interna tillstånd som stress eller hunger eller stokastiska faktorer som genuttrycksnivåer. Dessa skillnader skapar ett behov av metoder som samtidigt kan stimulera och observera många djur och extrahera information från individer4.
Dessutom blir vissa neuromodulerande fenomen uppenbara endast under specifika stimuleringsförhållanden, såsom temporal hämning14, som hänvisar till den korta undertryckningen av svar när stimulering sker i snabb följd. Elektrofysiologiska system kan driva neural aktivitet över ett brett stimulansutrymme för detta ändamål, modulera till exempel den elektriska pulsströmmen, spänningen, frekvensen, vågformen, arbetscykeln och tidpunkten för periodiska stimulanståg. Indirekt stimulering av naturligt detekterade stimuli eller optogenetiska system skulle dra nytta av en liknande bredd av kontrollmekanismer. För närvarande presenteras många naturliga stimuli på ett enkelt “on-off” -sätt, såsom luktpresentation och borttagning, med hjälp av kommersiella system som har varit långsamma för att lägga till flexibilitet. Men billiga mikrokontroller kan nu automatisera leveransen av flera typer av stimuli på ett sätt som är anpassningsbart till forskarnas behov. I kombination med mikrofluidik har dessa system uppnått målet om ökad experimentell genomströmning och flexibilitet, vilket gör att neurala svar på en mängd exakta stimuli kan mätas samtidigt hos många djur 4,6. Multimodal stimulering kan användas för att ytterligare förhöra neuronkretsarna, såsom genom att övervaka förändringar i neural excitabilitet vid konsekvent stimulering före, under och efter en ortogonal störning såsom läkemedelsexponering4. Fördelarna med billiga, öppna mikroskopisystem är tydliga för att främja vetenskaplig forskning, men i praktiken kan behovet av inköp av delar, konstruktion och prestandavalidering hindra antagandet av dessa tekniker.
Detta protokoll syftar till att lindra några av dessa tekniska utmaningar. Medan tidigare protokoll har fokuserat på användning av mikrofluidiska enheter och grundläggande stimulering 9,15,17, beskriver vi här konstruktionen och användningen av ett flexibelt, automatiserat, multimodalt stimulansleveranssystem för neural avbildning i C. elegans eller andra små organismer som använder tidigare beskrivna mikrofluidiska enheter4. Systemet med öppen källkod programmeras via enkla textfiler för att definiera experimenten, och dataanalysprogrammet NeuroTracker extraherar halvautomatiskt neurala aktivitetsdata från mikroskopvideorna. Vi demonstrerar detta system med exempel på bedömning av temporal hämning, disinhibition och stimulus crosstalk med hjälp av den kemosensoriska neuronen AWA, som depolariserar som svar på olika matlukter eller som svar på ljus när man uttrycker optogenetiska ljuskänsliga jonkanaler 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi ett öppet mikroskopisystem för bedömning av neurala aktivitetsfenomen med hjälp av tidsmässigt exakt leverans av olika stimulansmönster. Den mikrofluidiska plattformen levererar repeterbara stimuli samtidigt som tiotals djur hålls i mikroskopets synfält. Få kommersiella mikroskopiprogramvarupaket möjliggör enkel programmering av olika stimulustidsmönster, och de som gör det kräver ofta manuell inmatning av varje mönster eller proprietära filformat. Däremot definieras experi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Fox Avery för att ha testat dessa protokoll och granskat manuskriptet och Eric Hall för programmeringshjälp. Finansiering för de metoder som presenteras här tillhandahölls delvis av National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
