Gestandaardiseerde identificatie van de samengestelde structuur in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van ionenval massaspectrometrie en meertraps fragmentatieanalyse
Summary
Hier beschrijven we een algemeen protocol en ontwerp dat kan worden toegepast om sporenhoeveelheden en minder belangrijke bestanddelen te identificeren in de complexe natuurlijke productformuleringen (matrixen) in de Tibetaanse geneeskunde.
Abstract
Tibetaanse medicijnen zijn complex en bevatten tal van onbekende verbindingen, waardoor diepgaand onderzoek naar hun moleculaire structuren cruciaal is. Vloeistofchromatografie-elektrospray ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wordt vaak gebruikt om Tibetaanse geneeskunde te extraheren; Er blijven echter veel onvoorspelbare onbekende verbindingen over na het gebruik van de spectrumdatabase. Dit artikel ontwikkelde een universele methode voor het identificeren van componenten in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van ionenval massaspectrometrie (IT-MS). De methode omvat gestandaardiseerde en geprogrammeerde protocollen voor monstervoorbereiding, MS-instelling, LC-prerun, methode-instelling, MS-acquisitie, meertraps MS-bewerking en handmatige gegevensanalyse. Twee representatieve verbindingen in de Tibetaanse geneeskunde Abelmoschus manihot zaden werden geïdentificeerd met behulp van meervoudige fase fragmentatie, met een gedetailleerde analyse van typische samengestelde structuren. Daarnaast bespreekt het artikel aspecten zoals ionmodusselectie, mobiele faseaanpassing, optimalisatie van het scanbereik, botsingsenergieregeling, omschakeling van botsingsmodus, fragmentatiefactoren en beperkingen van de methode. De ontwikkelde gestandaardiseerde analysemethode is universeel en kan worden toegepast op onbekende verbindingen in de Tibetaanse geneeskunde.
Introduction
De kwalitatieve analyse van sporencomponenten in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is een cruciaal onderwerp geworden in het onderzoek. Vanwege het grote aantal verbindingen in TCM is het moeilijk om ze te isoleren voor analyse van nucleaire magnetische resonantiespectrometer (NMR) of röntgendiffractometer (XRD), waardoor op massaspectrometrie (MS) gebaseerde methoden die alleen lage monstervolumes vereisen steeds populairder worden. Bovendien is vloeistofchromatografie (LC) in combinatie met MS de afgelopen jaren veel gebruikt in TCM-onderzoek voor de verbeterde scheiding van complexe monsters en kwalitatieve analyse van chemische verbindingen1. Een veelgebruikte methode is vloeistofchromatografie-elektrospray ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS), die veel wordt gebruikt in kwalitatief onderzoek naar Tibetaanse geneeskunde2. Met deze methode worden complexe componenten verrijkt en gescheiden in een LC-kolom en wordt de massa-ladingsverhouding (m/z) van de adductionen waargenomen met behulp van een MS-detector. Het doorzoeken van tandem MS (MS/MS of MS2) databases is momenteel de snelste aanpak voor betrouwbare samengestelde annotaties in small molecule analyse met behulp van quadrupole time-of-flight (Q-TOF) MS en Orbitrap MS3. De slechte kwaliteit van databases en de aanwezigheid van verschillende isomeren belemmeren echter de identificatie van onbekende verbindingen. Bovendien is de informatie die door de MS/MS-database wordt verstrekt, beperkt 4,5,6,7. Het is belangrijk om de chemische verbindingen in elke TCM te onderzoeken met behulp van een algemeen protocol dat op grote schaal kan worden toegepast op andere TCM.
IT-MS vangt een breed scala aan ionen op door verschillende radiofrequentie (RF) spanningen toe te passen op de ringelektroden8. IT-MS kan tijdreeksen meertraps MS-scans uitvoeren in verschillende chronologische volgordes, waarbij fragmentatie van ingrediënten meervoudige fase MS (MS n) wordt verkregen, waarbijn het aantal productionstadia9 is. Lineaire IT-MS wordt beschouwd als het beste voor structuuridentificatie omdat het kan worden gebruikt voor sequentiële MSn-experimenten 10. Gerichte ionen kunnen worden geïsoleerd en geaccumuleerd in lineaire IT-MS1. De MS n (n ≥ 3) in IT-MS biedt meer fragmentinformatie dan MS/MS in Q-TOF-MS. Omdat IT-MS het doelion en zijn fragmentionen niet kan vergrendelen, is het een krachtig hulpmiddel voor de structuuropheldering van onbekende verbindingen, waaronder isomeren1. MSn-technologie is op grote schaal toegepast op de structurele analyse van onbekende eiwitten, peptiden en polysacchariden11,12. Het abundantieniveau van fragmentionen in MSn biedt meer moleculaire fragmentinformatie over gerichte verbindingen in complexe monsters dan MS / MS in Q-TOF-MS. Daarom is het toepassen van MSn-technologie op structurele identificatie in TCM essentieel.
Tibetaanse geneeskunde is een belangrijk onderdeel van TCM13, en deze geneesmiddelen zijn voornamelijk afgeleid van dieren, planten en mineralen gevonden in het plateaugebied14. Het Tibetaanse medicijn Abelmoschus manihot zaden (AMS) is het zaad van Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS is een traditioneel kruidengeneesmiddel dat wordt gebruikt voor de behandeling van aandoeningen zoals atopische dermatitis, reuma en lepra. Het bevat chalcone, dat antibacteriële, schimmelwerende, antikanker-, antioxidatieve en ontstekingsremmende effecten bezit15. In de huidige studie werden MS n-procedures verbeterd en werd een gedetailleerde methode ontwikkeld om samengestelde structuren in de Tibetaanse geneeskunde AMS te identificeren met behulp van IT-MS en MSn. Bepaalde MS-parameters, waaronder de ionenmodus, het scanbereik en de botsingsmodus, werden geoptimaliseerd om problemen bij het identificeren van sporenverbindingen te overwinnen. Deze studie heeft tot doel de gestandaardiseerde structuuridentificatie van sporenverbindingen in TCM te bevorderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
IT-MS en zijn MSn-technologie bieden een nieuwe benadering voor het identificeren van de structuur van trace TCM-verbindingen. In tegenstelling tot Q-TOF-MS, dat de fragmentionen niet diep kon identificeren, blinkt IT-MS met MSn-technologie uit door zijn vermogen om ionen te isoleren en te accumuleren. Dit artikel schetst een methode voor het identificeren van sporenverbindingen in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van de IT-MS en MSn techniek. De methode gebruikt de n-waarde in MS<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Xinglin Talent Program van Chengdu University of TCM (nr. 030058191), de Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) en de National Natural Science Foundation of China (82204765).
Materials
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
- Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
- Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
- Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
- Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
- Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
- Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
- Chang, H. -. L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
- Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
- Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
- Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
- Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
- Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
- Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
- Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).
- Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
- Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , (2022).
- Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
- Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
- Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
- Wu, S. -. L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
- Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).
