Identificação Padronizada da Estrutura Composta na Medicina Tibetana Usando Espectrometria de Massa com Armadilha de Íons e Análise de Fragmentação em Múltiplos Estágios
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo geral e um projeto que podem ser aplicados para identificar quantidades residuais e constituintes menores nas formulações complexas de produtos naturais (matrizes) na medicina tibetana.
Abstract
Os medicamentos tibetanos são complexos e contêm numerosos compostos desconhecidos, tornando crucial a pesquisa aprofundada sobre suas estruturas moleculares. Cromatografia líquida-espectrometria de massa por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS) é comumente usada para extrair medicamentos tibetanos; No entanto, muitos compostos desconhecidos imprevisíveis permanecem após o uso do banco de dados Spectrum. O presente artigo desenvolveu um método universal para identificação de componentes na medicina tibetana usando espectrometria de massas com armadilha iônica (IT-MS). O método inclui protocolos padronizados e programados para preparação de amostras, configuração de EM, pré-execução de LC, estabelecimento de métodos, aquisição de EM, operação de EM em múltiplos estágios e análise manual de dados. Dois compostos representativos na medicina tibetana Abelmoschus manihot sementes foram identificados usando fragmentação de múltiplos estágios, com uma análise detalhada de estruturas compostas típicas. Além disso, o artigo discute aspectos como seleção do modo de íon, ajuste de fase móvel, otimização da faixa de varredura, controle de energia de colisão, comutação do modo de colisão, fatores de fragmentação e limitações do método. O método de análise padronizado desenvolvido é universal e pode ser aplicado a compostos desconhecidos na medicina tibetana.
Introduction
A análise qualitativa de componentes traço na medicina tradicional chinesa (MTC) tornou-se um tópico crucial na pesquisa. Devido ao alto número de compostos na MTC, é difícil isolá-los para análise de espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN) ou difratômetro de raios X (DRX), tornando cada vez mais populares métodos baseados em espectrometria de massa (MS) que requerem apenas baixos volumes de amostras. Adicionalmente, a cromatografia líquida (CL) acoplada à EM tem sido amplamente utilizada na pesquisa em MTC nos últimos anos para a melhor separação de amostras complexas e análise qualitativa de compostosquímicos1. Um método comum é a cromatografia líquida-espectrometria de massas por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS), que é amplamente utilizada em pesquisas qualitativas em medicina tibetana2. Com este método, componentes complexos são enriquecidos e separados em uma coluna LC, e a relação massa-carga (m/z) dos íons adutos é observada usando um detector MS. A busca em bancos de dados tandem MS (MS/MS ou MS2) é atualmente a abordagem mais rápida para anotações de compostos confiáveis em análises de pequenas moléculas usando o tempo de voo quadrupolo (Q-TOF) MS e o Orbitrap MS3. No entanto, a baixa qualidade dos bancos de dados e a presença de vários isômeros dificultam a identificação de compostos desconhecidos. Além disso, as informações fornecidas pelo banco de dados do MS/MS são limitadas 4,5,6,7. É significativo investigar os compostos químicos em cada MTC usando um protocolo geral que pode ser amplamente aplicado a outros MTC.
O IT-MS captura uma ampla gama de íons aplicando diferentes tensões de radiofrequência (RF) aos eletrodos do anel8. O IT-MS pode realizar varreduras de MS de vários estágios de séries temporais em diversas ordens cronológicas, fornecendo fragmentação de MS de múltiplos estágios (MS n) de ingredientes, onden é o número de estágios de íons do produto9. O IT-MS linear é considerado o melhor para identificação de estruturas, pois pode ser utilizado para experimentos sequenciais de MSn 10. Íons alvo podem ser isolados e acumulados em IT-MSlinear 1. O MS n (n ≥ 3) em IT-MS fornece mais informações fragmentadas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Uma vez que IT-MS não pode bloquear o íon alvo e seus íons fragmentos, é uma ferramenta poderosa para a elucidação da estrutura de compostos desconhecidos, incluindo isômeros1. A tecnologia MSn tem sido amplamente aplicada na análise estrutural de proteínas, peptídeos e polissacarídeos desconhecidos11,12. O nível de abundância de íons fragmentos em MSn fornece mais informações de fragmentos moleculares sobre compostos alvo em amostras complexas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Assim, a aplicação da tecnologia MSn na identificação estrutural na MTC é essencial.
A medicina tibetana é um componente significativo da MTC13, e esses medicamentos são principalmente derivados de animais, plantas e minerais encontrados na área do planalto14. O medicamento tibetano Abelmoschus manihot seeds (AMS) é a semente de Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS é um fitoterápico tradicional usado para tratar condições como dermatite atópica, reumatismo e hanseníase. Contém chalcona, que possui efeitos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos, antioxidantes e anti-inflamatórios15. No presente estudo, os procedimentos de MS n foram aprimorados, e um método detalhado foi desenvolvido para identificar estruturas compostas na medicina tibetana AMS usando IT-MS e MSn. Certos parâmetros do MS, incluindo o modo de íons, o alcance de varredura e o modo de colisão, foram otimizados para superar problemas na identificação de compostos traços. Este estudo tem como objetivo promover a identificação padronizada da estrutura de compostos traço na MTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
IT-MS e sua tecnologia MSn oferecem uma nova abordagem para identificar a estrutura de compostos TCM traço. Ao contrário do Q-TOF-MS, que não conseguiu identificar profundamente os íons fragmentados, o IT-MS com tecnologia MSn se destaca devido à sua capacidade de isolar e acumular íons. Este artigo descreve um método para identificar compostos traço na medicina tibetana usando a técnica IT-MS e MSn . O método utiliza o valor de n em MSn para determinar a quantidade d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (No. 030058191), pela Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) e pela National Natural Science Foundation of China (82204765).
Materials
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
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