Identificación estandarizada de la estructura compuesta en la medicina tibetana utilizando espectrometría de masas de trampa iónica y análisis de fragmentación de múltiples etapas
Summary
Aquí, describimos un protocolo general y un diseño que podría aplicarse para identificar trazas y componentes menores en las complejas formulaciones de productos naturales (matrices) en la medicina tibetana.
Abstract
Los medicamentos tibetanos son complejos y contienen numerosos compuestos desconocidos, lo que hace que la investigación en profundidad sobre sus estructuras moleculares sea crucial. La cromatografía líquida-espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por electrospray (LC-ESI-TOF-MS) se usa comúnmente para extraer medicina tibetana; Sin embargo, muchos compuestos desconocidos impredecibles permanecen después de usar la base de datos Spectrum. El presente artículo desarrolló un método universal para identificar componentes en la medicina tibetana utilizando espectrometría de masas de trampa iónica (IT-MS). El método incluye protocolos estandarizados y programados para la preparación de muestras, configuración de MS, preejecución de LC, establecimiento de métodos, adquisición de MS, operación de MS de múltiples etapas y análisis manual de datos. Se identificaron dos compuestos representativos en la medicina tibetana Abelmoschus manihot utilizando fragmentación en múltiples etapas, con un análisis detallado de las estructuras compuestas típicas. Además, el artículo discute aspectos como la selección del modo iónico, el ajuste de fase móvil, la optimización del rango de escaneo, el control de energía de colisión, el cambio de modo de colisión, los factores de fragmentación y las limitaciones del método. El método de análisis estandarizado desarrollado es universal y se puede aplicar a compuestos desconocidos en la medicina tibetana.
Introduction
El análisis cualitativo de los componentes traza en la medicina tradicional china (MTC) se ha convertido en un tema crucial en la investigación. Debido al alto número de compuestos en TCM, es difícil aislarlos para el análisis del espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN) o del difractómetro de rayos X (XRD), lo que hace que los métodos basados en espectrometría de masas (MS) que solo requieren volúmenes de muestra bajos sean cada vez más populares. Además, la cromatografía líquida (LC) junto con MS ha sido ampliamente utilizada en la investigación de MTC en los últimos años para mejorar la separación de muestras complejas y el análisis cualitativo de compuestos químicos1. Un método común es la cromatografía líquida-espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por electrospray (LC-ESI-TOF-MS), que es ampliamente utilizada en la investigación cualitativa sobre la medicina tibetana2. Con este método, los componentes complejos se enriquecen y separan en una columna LC, y la relación masa-carga (m / z) de los iones de aducción se observa utilizando un detector MS. La búsqueda en bases de datos MS EN TÁNDEM (MS/MS o MS2) es actualmente el enfoque más rápido para anotaciones compuestas confiables en el análisis de moléculas pequeñas utilizando tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF) MS y Orbitrap MS3. Sin embargo, la mala calidad de las bases de datos y la presencia de varios isómeros dificultan la identificación de compuestos desconocidos. Además, la información proporcionada por la base de datos MS/MS es limitada 4,5,6,7. Es importante investigar los compuestos químicos en cada MTC utilizando un protocolo general que pueda aplicarse ampliamente a otra MTC.
IT-MS captura una amplia gama de iones aplicando diferentes voltajes de radiofrecuencia (RF) a los electrodos de anillo8. IT-MS puede realizar exploraciones de MS de múltiples etapas de series temporales en diversos órdenes cronológicos, proporcionando fragmentación de MS de múltiples etapas (MS n) de ingredientes, donden es el número de etapas de iones del producto9. La IT-MS lineal se considera la mejor para la identificación de estructuras, ya que se puede utilizar para experimentos secuenciales deMS n 10. Los iones objetivo pueden aislarse y acumularse en el lineal IT-MS1. El MS n (n ≥ 3) en IT-MS proporciona más información de fragmentos que MS/MS en Q-TOF-MS. Dado que IT-MS no puede bloquear el ion objetivo y sus iones de fragmento, es una herramienta poderosa para la elucidación de la estructura de compuestos desconocidos, incluidos los isómeros1. La tecnología MSn ha sido ampliamente aplicada al análisis estructural de proteínas, péptidos y polisacáridos desconocidos11,12. El nivel de abundancia de iones fragmentados en MSn proporciona más información de fragmentos moleculares sobre compuestos específicos en muestras complejas que MS / MS en Q-TOF-MS. Por lo tanto, la aplicación de la tecnología MSn a la identificación estructural en TCM es esencial.
La medicina tibetana es un componente importante de la MTC13, y estos medicamentos se derivan principalmente de animales, plantas y minerales que se encuentran en el área de la meseta14. La medicina tibetana Abelmoschus manihot seeds (AMS) es la semilla de Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS es una medicina herbal tradicional utilizada para tratar afecciones como la dermatitis atópica, el reumatismo y la lepra. Contiene chalcona, que posee efectos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos, antioxidantes y antiinflamatorios15. En el presente estudio, se mejoraron los procedimientos deMS n y se desarrolló un método detallado para identificar estructuras compuestas en la medicina tibetana AMS utilizando IT-MS y MSn. Ciertos parámetros de MS, incluido el modo de iones, el rango de escaneo y el modo de colisión, se optimizaron para superar los problemas en la identificación de compuestos traza. Este estudio tiene como objetivo promover la identificación estandarizada de la estructura de compuestos traza en la MTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
IT-MS y su tecnología MSn ofrecen un nuevo enfoque para identificar la estructura de los compuestos TCM traza. A diferencia de Q-TOF-MS, que no pudo identificar profundamente los iones del fragmento, IT-MS con tecnología MSn sobresale debido a su capacidad para aislar y acumular iones. Este artículo describe un método para identificar compuestos traza en la medicina tibetana utilizando la técnica IT-MS y MSn . El método utiliza el valor n en MSn para determinar la cantida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Programa de Talento Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No. 030058191), la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Sichuan (2022NSFSC1470) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204765).
Materials
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
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