Isolamento e caracterização dos ligamentos uterossacrais murinos e órgãos do assoalho pélvico
Summary
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para dissecar ligamentos uterossacrais e outros tecidos do assoalho pélvico, incluindo colo uterino, reto e bexiga em camundongos, para expandir o estudo dos tecidos reprodutivos femininos.
Abstract
O prolapso de órgãos pélvicos (DPO) é uma condição que afeta a integridade, a estrutura e o suporte mecânico do assoalho pélvico. Os órgãos do assoalho pélvico são sustentados por diferentes estruturas anatômicas, incluindo músculos, ligamentos e fáscia pélvica. O ligamento uterossacro (USL) é uma estrutura crítica de suporte de carga, e a lesão da USL resulta em um risco maior de desenvolver POP. O presente protocolo descreve a dissecção de USLs murinos e dos órgãos do assoalho pélvico, juntamente com a aquisição de dados únicos sobre a composição bioquímica e função da USL usando espectroscopia Raman e a avaliação do comportamento mecânico. Camundongos são um modelo inestimável para pesquisa pré-clínica, mas dissecar a USL murina é um processo difícil e intrincado. Este procedimento apresenta uma abordagem para guiar a dissecção dos tecidos murinos do assoalho pélvico, incluindo o USL, para possibilitar múltiplas avaliações e caracterização. Este trabalho visa auxiliar a dissecção de tecidos do assoalho pélvico por cientistas e engenheiros básicos, ampliando assim a acessibilidade da pesquisa sobre as condições do USL e do assoalho pélvico e o estudo pré-clínico da saúde da mulher utilizando modelos de camundongos.
Introduction
Aproximadamente 50% das mulheres são acometidas pelo prolapso de órgãos pélvicos (POP)1,2. Cerca de 11% dessas mulheres enquadram-se nos critérios para serem submetidas ao reparo cirúrgico, que apresenta baixa taxa de sucesso (~30%)3,4. A DPO é caracterizada pela descida de algum ou de todos os órgãos pélvicos (bexiga, útero, colo uterino e reto) de sua posição natural devido à falha da USL e dos músculos do assoalho pélvico em fornecer suporte adequado5. Essa condição envolve disfunção anatômica e ruptura do tecido conjuntivo, bem como lesão neuromuscular, além de fatores predisponentes 3,6. A DPO está associada a múltiplos fatores, como idade, peso, paridade e tipo de parto (i.e., partos vaginais ou cesáreos). Acredita-se que esses fatores afetem a integridade mecânica de todos os tecidos do assoalho pélvico, sendo a gravidez e a paridade os principais causadores daDPO5,7,8.
Os ligamentos uterossacrais (USLs) são importantes estruturas de suporte para o útero, colo uterino e vagina e ligam o colo ao sacro4. Danos às USLs colocam as mulheres em maior risco de desenvolver POP. Acredita-se que a gravidez e o parto imponham tensão adicional à USL, o que potencialmente induz lesões e aumenta as chances de DPO. A USL é um tecido complexo composto por células musculares lisas, vasos sanguíneos e linfáticos distribuídos heterogeneamente ao longo do ligamento, que pode ser dividido em três cortes distintos: cervical, intermediário e sacral9. A integridade mecânica da USL é derivada de componentes da matriz extracelular (MEC) como colágenos, elastina e proteoglicanos 5,9,10. Sabe-se que as fibras colágenas tipo I são um importante componente de tração dos tecidos ligamentares e, portanto, provavelmente estão envolvidas na falência da USL e naDPO11.
Há falta de conhecimento sobre as causas, prevalência e efeitos da DPO em mulheres. O desenvolvimento de um modelo animal apropriado de DPO é necessário para avançar no entendimento do assoalho pélvico feminino. Camundongos e humanos têm pontos anatômicos semelhantes dentro da pelve, como ureteres, reto, bexiga, ovários e ligamentos redondos9, bem como pontos de intersecção semelhantes da USL com o útero, colo do útero e sacro. Além disso, camundongos oferecem facilidade de manipulação genética e têm o potencial de ser um modelo facilmente acessível e custo-efetivo para o estudo da POP9.
Este estudo desenvolveu um método para acessar e isolar a USL e os diferentes tecidos do assoalho pélvico de camundongos nulíparas (ou seja, nunca grávidas). As USLs extraídas foram submetidas à digestão enzimática (isto é, para remover colágenos e glicosaminoglicanos), testadas para determinar a resposta mecânica sob carga de tração e avaliadas quanto à composição bioquímica em um estudo de prova de conceito. A capacidade de isolar tecidos intactos facilitará futuras caracterizações mecânicas e bioquímicas dos componentes do assoalho pélvico, o que é um primeiro passo crucial para melhorar nossa compreensão dos riscos de lesão relacionados ao parto, gravidez e DPO.
Protocol
Representative Results
Discussion
O efeito de danos estruturais nos tecidos reprodutivos femininos é pouco estudado, e um modelo animal de fácil acesso para pesquisa de POP é necessário. O camundongo é um modelo custo-efetivo que pode mimetizar estudos reprodutivos humanos16. Devido ao crescente interesse no estudo do aparelho reprodutor feminino, há necessidade de métodos que auxiliem o estudo desses tecidos. Para suprir essa necessidade, neste trabalho, estabeleceu-se um método para dissecar e preparar tecidos murinos do…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (C.B.), pela NSF Graduate Research Fellowship (L.S.), pela Schmidt Science Fellowship (C.L.), pela University of Colorado Research and Innovation Seed Grant Program (prêmio de 2020 para V.F., S.C. e K.C.), e pela Anschutz Boulder Nexus Seed Grant da Universidade do Colorado (para V.F. e K.C.). Agradecimento especial vai para o Dr. Tyler Tuttle para ajudar com o projeto da câmara de carregamento, bem como para os membros do laboratório Calve para discussões úteis.
Materials
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
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