Isolering og karakterisering af murin uterosacral ledbånd og bækkenbundsorganer
Summary
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol til dissekering af uterosacral ledbånd og andre bækkenbundsvæv, herunder livmoderhalsen, endetarmen og blæren hos mus, for at udvide undersøgelsen af kvindelige reproduktive væv.
Abstract
Bækkenorganprolaps (POP) er en tilstand, der påvirker bækkenbundens integritet, struktur og mekaniske støtte. Organerne i bækkenbunden understøttes af forskellige anatomiske strukturer, herunder muskler, ledbånd og bækkenfascia. Det uterosakrale ledbånd (USL) er en kritisk bærende struktur, og skade på USL resulterer i en højere risiko for at udvikle POP. Denne protokol beskriver dissektionen af murine USL’er og bækkenbundsorganerne sammen med erhvervelsen af unikke data om USL’s biokemiske sammensætning og funktion ved hjælp af Raman-spektroskopi og evaluering af mekanisk adfærd. Mus er en uvurderlig model for præklinisk forskning, men dissekering af murine USL er en vanskelig og indviklet proces. Denne procedure præsenterer en tilgang til at styre dissektionen af murin bækkenbundsvæv, herunder USL, for at muliggøre flere vurderinger og karakterisering. Dette arbejde har til formål at hjælpe dissektion af bækkenbundsvæv af grundforskere og ingeniører og dermed udvide tilgængeligheden af forskning i USL og bækkenbundsforhold og den prækliniske undersøgelse af kvinders sundhed ved hjælp af musemodeller.
Introduction
Ca. 50% af kvinderne er ramt af bækkenorganprolaps (POP)1,2. Omkring 11% af disse kvinder passer til kriterierne for at gennemgå kirurgisk reparation, hvilket har en dårlig succesrate (~ 30%)3,4. POP er kendetegnet ved nedstigningen af nogle eller alle bækkenorganerne (dvs. blære, livmoder, livmoderhals og endetarm) fra deres naturlige position på grund af USL’s og bækkenbundsmusklernes manglende evne til at yde tilstrækkelig støtte5. Denne tilstand involverer anatomisk dysfunktion og forstyrrelse af bindevævet såvel som neuromuskulær skade ud over prædisponerende faktorer 3,6. POP er forbundet med flere faktorer såsom alder, vægt, paritet og leveringstype (dvs. vaginale eller kejsersnit). Disse faktorer menes at påvirke den mekaniske integritet af alle bækkenbundsvæv, med graviditet og paritet menes at være de vigtigste drivkræfter for POP 5,7,8.
De uterosakrale ledbånd (USL’er) er vigtige understøttende strukturer for livmoderen, livmoderhalsen og vagina og binder livmoderhalsen til korsbenet4. Skader på USL’erne sætter kvinder i øget risiko for at udvikle POP. Det menes, at graviditet og fødsel pålægger USL yderligere belastning, hvilket potentielt fremkalder skade og øger chancerne for POP. USL er et komplekst væv sammensat af glatte muskelceller, blodkar og lymfeknuder fordelt heterogent langs ledbåndet, som kan opdeles i tre forskellige sektioner: cervikal, mellemliggende og sakral region9. USL’s mekaniske integritet er afledt af ekstracellulære matrixkomponenter (ECM) som kollagener, elastin og proteoglycaner 5,9,10. Type I kollagenfibre er kendt for at være en vigtig bærende trækkomponent i ligamentvæv og er derfor sandsynligvis involveret i USL-svigt og POP11.
Der mangler viden om årsagerne, forekomsten og virkningerne af POP hos kvinder. Udviklingen af en passende dyremodel af POP er nødvendig for at fremme vores forståelse af den kvindelige bækkenbund. Mus og mennesker har lignende anatomiske landemærker i bækkenet, såsom urinlederne, endetarmen, blæren, æggestokkene og runde ledbånd9, samt lignende skæringspunkter mellem USL og livmoderen, livmoderhalsen og korsbenet. Desuden tilbyder mus let genetisk manipulation og har potentialet til at være en let tilgængelig, omkostningseffektiv model til undersøgelse af POP9.
Denne undersøgelse udviklede en metode til at få adgang til og isolere USL og de forskellige bækkenbundsvæv fra nulliparøse (dvs. aldrig gravide) mus. De ekstraherede USL’er blev udsat for enzymatisk fordøjelse (dvs. for at fjerne kollagener og glycosaminoglycaner), testet for at bestemme det mekaniske respons under trækbelastning og evalueret for biokemisk sammensætning i en proof-of-concept-undersøgelse. Evnen til at isolere intakt væv vil lette yderligere mekaniske og biokemiske karakteriseringer af bækkenbundskomponenterne, hvilket er et afgørende første skridt i retning af at forbedre vores forståelse af skadesrisici i forbindelse med fødsel, graviditet og POP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effekten af strukturelle skader på kvindeligt reproduktionsvæv er underundersøgt, og der er behov for en let tilgængelig dyremodel til POP-forskning. Musen er en omkostningseffektiv model, der kan efterligne humane reproduktionsstudier16. På grund af den stigende interesse for undersøgelsen af det kvindelige reproduktive system er der behov for metoder, der hjælper undersøgelsen af disse væv. For at imødekomme dette behov etableres der i dette arbejde en metode til at dissekere og forber…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) -tilskuddet (CB), NSF Graduate Research Fellowship (LS), Schmidt Science Fellowship (CL), University of Colorado Research &; Innovation Seed Grant Program (2020-pris til V.F., S.C. og K.C.) og Anschutz Boulder Nexus Seed Grant ved University of Colorado (til VF og K.C.). Særlig anerkendelse går til Dr. Tyler Tuttle for hjælp med lastekammerets design samt Calve-laboratoriemedlemmerne for nyttige diskussioner.
Materials
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 396 (9566), 1027-1038 (2007).
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O’Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
