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Neuroscience

मल्टी-वेल माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों में मानव इन विट्रो तंत्रिका संस्कृतियों का केंद्रित अल्ट्रासाउंड न्यूरोमॉड्यूलेशन

Published: May 3, 2024 doi: 10.3791/65115
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3, 2,3, 2,3, 1,4, 3, 3, 3, 1,2,3,4,5,6
1Electrical and Computer Engineering, Johns Hopkins University, 2HEPIUS Innovation Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Mechanical Engineering, Johns Hopkins University, 6Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

यहां, हम एक उच्च-थ्रूपुट सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (HiPSC) न्यूरॉन्स पर केंद्रित अल्ट्रासाउंड के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की निगरानी और मात्रा का ठहराव को सक्षम बनाता है।

Abstract

केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों को पशु मॉडल में प्रदर्शित किया गया है, और मनुष्यों में आंदोलन और मनोरोग विकारों के इलाज के लिए एफयूएस का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हालांकि, एफयूएस की सफलता के बावजूद, न्यूरॉन्स पर इसके प्रभावों को अंतर्निहित तंत्र खराब समझा जाता है, जिससे एफयूएस मापदंडों को ट्यून करके उपचार अनुकूलन मुश्किल हो जाता है। ज्ञान में इस अंतर को दूर करने के लिए, हमने मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से सुसंस्कृत न्यूरॉन्स का उपयोग करके इन विट्रो में मानव न्यूरॉन्स का अध्ययन किया। HiPSCs का उपयोग दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में मानव विशिष्ट neuronal व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह रिपोर्ट एक उच्च-थ्रूपुट प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है जो HiPSC न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की निगरानी और मात्रा का ठहराव को सक्षम बनाती है। FUS मापदंडों अलग-अलग और दवा और आनुवंशिक संशोधनों के माध्यम से HiPSC न्यूरॉन्स में हेरफेर करके, शोधकर्ता तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कर सकते हैं और HiPSC न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभावों को स्पष्ट कर सकते हैं। इस शोध में न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों की एक श्रृंखला के लिए सुरक्षित और प्रभावी एफयूएस-आधारित उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकते हैं।

Introduction

फोकस्ड अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) एक आशाजनक न्यूरोमॉड्यूलेशन मोडेलिटी है जो उप-मिलीमीटर रिज़ॉल्यूशन 1,2,3 के साथ सेंटीमीटर-स्तर की गहराई पर गैर-इनवेसिव उत्तेजना को सक्षम बनाता है। इन शक्तियों के बावजूद, FUS का नैदानिक प्रभाव सीमित है, आंशिक रूप से इसकी क्रिया के तंत्र के बारे में ज्ञान की कमी के कारण। एक ठोस सैद्धांतिक नींव के बिना, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों को अलग-अलग परिस्थितियों में व्यक्तिगत रोगियों की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए चिकित्सा को तैयार करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। यू एट अल 4 द्वारा प्रस्तावित एक प्रमुख सिद्धांत से पता चलता है कि न्यूरॉन सक्रियण के लिए मैकेनोसेंसिटिव आयन चैनल जिम्मेदार हैं। हालांकि, यह सिद्धांत मानव मस्तिष्क न्यूरॉन्स में एफयूएस सक्रियण की व्याख्या करने में विफल रहता है, जिसमें इन चैनलोंकी कमी होती है। यह अस्पष्टता क्लिनिक में FUS के उपयोग को सीमित करती है, क्योंकि यह उपचार परिणामों को अनुकूलित करने के लिए FUS मापदंडों की ट्यूनिंग को रोकती है।

पूर्व संबंधित अध्ययनों ने एफयूएस को कम करने वाले शारीरिक तंत्र की जांच करने और इष्टतम उत्तेजना मापदंडों को निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया है। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम प्रतिक्रिया के रूप में न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की निगरानी शामिल है, जो आयन-गेट निगरानी से जुड़े तरीकों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कैल्शियम आयन इमेजिंग4, ऑप्टिकल इमेजिंग1, और पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (जैसे, इलेक्ट्रोमोग्राफी6 या त्वचा-तंत्रिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी7)। हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययन गैर-मानव न्यूरॉन्स या विवो दृष्टिकोण में उपयोग करते हैं, जो उप-इष्टतम नियंत्रणों के कारण अतिरिक्त विचरण पेश कर सकते हैं। इसके विपरीत, इलेक्ट्रोड का उपयोग इन विट्रो मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में न्यूरोनल संकेतों को मापने के लिए (HiPSC) न्यूरॉन्स अधिक संवेदनशील माप और प्रयोगात्मक वातावरण पर अधिक से अधिक नियंत्रण प्रदान करता है. इस काम में, एक इन विट्रो प्रणाली सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों (विदेश मंत्रालयों) का उपयोग कर विकसित किया गया है FUS उत्तेजना के बाद HiPSC न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है. यह प्रणाली अल्ट्रासाउंड मापदंडों (जैसे, आवृत्ति, फट लंबाई, तीव्रता) को बदलते समय न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए समुदाय में शोधकर्ताओं को सशक्त बनाती है। इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली शारीरिक उत्तेजनाओं (जैसे, तापमान, दबाव, और गुहिकायन)8,9, के लिए न्यूरोनल संवेदनशीलता के नियंत्रण के एक उच्च स्तर को सक्षम बनाता है, के रूप में न्यूरॉन्स आयन चैनल कार्यक्षमता आनुवंशिक और औषधीय (जैसे, गैडोलीनियम का उपयोग आयन चैनलों को बाधित करने के लिए)10,11,12 हेरफेर किया जा सकता है. यह आणविक-स्तर नियंत्रण FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों के पीछे के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है।

Protocol

1. सामग्री की तैयारी

  1. संस्कृति माध्यम महाप्राण, और एम्बेडेड विदेश मंत्रालय(चित्रा 2ए)के साथ एक 24 अच्छी तरह से न्यूरॉन संस्कृति प्लेट में एक भी अच्छी तरह से भरने के लिए इसका इस्तेमाल करें. संस्कृति और Taga एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद न्यूरॉन्स प्रेरित.13.
  2. पैराफिल्म इंटरफ़ेस, रबर बैंड, और FUS शंकु को 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करके अपनी रबर झिल्ली के साथ जीवरश्लेषित करें, और उन्हें बाद में असेंबली के लिए धूआं हुड में रखें।
  3. Degas 300 एमएल विआयनीकृत पानी और 50 एमएल युग्मन जेल। युग्मन माध्यम के भीतर गुहिकायन उत्प्रेरण से बचने के लिए 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर पानी और जेल अपकेंद्रित्र.
    नोट: HiPSCs का मूल स्रोत GM01582 और CIPS सेल लाइनों से है। औसतन, 5 x 104 मोटर न्यूरॉन्स और 2.5 x 104 एस्ट्रोसाइट्स प्रति अच्छी तरह सेघनत्व 14 प्राप्त किया जा सकता है।

2. बाह्य उपकरणों का कनेक्शन और सेटअप

  1. शिकंजा का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर के लिए FUS शंकु को सुरक्षित करें, और शंकु को हवादार बाँझ हुड में एक लचीली रबर झिल्ली के साथ सील करें। चरण 1.3 से degassed और deionized (DG-DI) पानी के साथ शंकु भरें, और cavitation से बचने के लिए शंकु में बुलबुले की अनुपस्थिति सुनिश्चित करें.
  2. 3 डी-मुद्रित धारक को एक फ्रेम(चित्रा 2बी)को सुरक्षित करने के लिए एक अनुकूलित थ्रेडेड रॉड का उपयोग करें। फ्रेम को इस तरह रखें कि FUS ट्रांसड्यूसर का सिर उस कुएं के ऊपर हो जो उत्तेजित हो जाएगा।
  3. मध्यम और HiPSCs युक्त 24 अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय प्लेट पर अच्छी तरह से अच्छी तरह से parafilm सुरक्षित करने के लिए एक रबर बैंड का प्रयोग करें.
  4. अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के बैक-एंड ड्राइवर इलेक्ट्रॉनिक्स को जोड़कर एफयूएस सिस्टम तैयार करें, इस मामले में, ट्रांसड्यूसर पावर आउटपुट (टीपीओ; चित्रा 3 ए), एक 100-240 वी पावर आउटलेट (चित्रा 3 बी, कनेक्शन 6) के लिए और टीपीओ और एफयूएस ट्रांसड्यूसर (चित्रा 3 बी, कनेक्शन 1 और कनेक्शन 2, क्रमशः) से मिलान नेटवर्क को जोड़ना। मिलान नेटवर्क ट्रांसड्यूसर और टीपीओ के बीच कुशल विद्युत युग्मन सुनिश्चित करता है।
  5. विदेश मंत्रालय प्रणाली को पावर आउटलेट (100-240 वी) (चित्र 3बी, कनेक्शन 5) से कनेक्ट करें। विदेश मंत्रालय प्रणाली तुल्यकाकरण पोर्ट को टीपीओ से कनेक्ट करें (चित्र 3बी, कनेक्शन 3)। यह कनेक्शन विदेश मंत्रालय प्रणाली द्वारा डेटा अधिग्रहण को FUS उत्तेजना के साथ सिंक्रनाइज़ करेगा।
  6. विदेश मंत्रालय प्रणाली में 24-अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय प्लेट रखें, और ट्रांसड्यूसर और कुएं के बीच सीधे संपर्क को सक्षम करने के लिए ढक्कन को हटा दें। चरण 3.2(चित्रा 3ए और चित्रा 2बी)में वर्णित के रूप में, अच्छी तरह से प्लेट के ऊपर ट्रांसड्यूसर 5-10 मिमी रखें, degassed युग्मन जेल के लिए कमरे की अनुमति देने के लिए.

3. उत्तेजना और न्यूरोनल संकेत अधिग्रहण

  1. TPO नियंत्रण कक्ष (तालिका 1) पर FUS पैरामीटर सेट करें।
  2. पैराफिल्म के शीर्ष पर युग्मन जेल लागू करें, और युग्मन जेल में एफयूएस ट्रांसड्यूसर को कम करें, न्यूनतम हवा के बुलबुले(चित्रा 2ए)के साथ जेल के साथ संपर्क सुनिश्चित करें।
  3. यूजर इंटरफेस पर स्टार्ट बटन पर क्लिक करके एमईए सिस्टम रिकॉर्डिंग शुरू करें।
  4. टीपीओ (चित्रा 3 ए, लेबल 7) पर नीचे दाएं बटन दबाकर एफयूएस सोनिकेशन शुरू करें, और न्यूरॉन्स को आधारभूत स्थिति में लौटने की अनुमति देने के लिए सोनिकेशन के प्रत्येक दौर के बीच कम से कम 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
  5. विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग(चित्रा 3बी, कनेक्शन 3)के लिए FUS उत्तेजना अनुक्रम संरेखित करने के लिए FUS प्रणाली द्वारा उत्पन्न ट्रिगर पल्स का उपयोग करें.

4. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. USB कनेक्शन (चित्र 3B, कनेक्शन 4) का उपयोग करके विदेश मंत्रालय प्रणाली से डेटा को कंप्यूटर में स्थानांतरित करें। प्रयोग सेट अप पैनल पर क्लिक करके इसे शुरू करें। इसके बाद, वह डेटा प्रकार चुनें जिसे कोई रिकॉर्ड करना चाहता है। इस मामले में, कच्चे स्पाइक्स की सिफारिश की जाती है। अंत में, फ़ाइल को नाम दें, और स्थानांतरण को पूरा करने के लिए डिस्क ड्राइव के भीतर वांछित स्थान का चयन करें।
    नोट: https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod में जारी पायथन स्क्रिप्ट चलाकर निम्न चरणों का पालन किया जा सकता है।
  2. 16 इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक से डेटा में पढ़ें.
  3. बटरवर्थ बैंडपास फ़िल्टर को 5 हर्ट्ज से 3 किलोहर्ट्ज़ बैंडविड्थ के साथ बटरवर्थ ऑर्डर के साथ 8 के बटरवर्थ ऑर्डर के साथ लागू करें।
    नोट: इन मूल्यों को अनुकूलित करने के लिए, विशिष्ट कोशिकाओं की फायरिंग दर और शामिल कोशिकाओं की संख्या को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। इन 2 मूल्यों को गुणा करके, एक प्रयोग में सेल आबादी के समग्र फायरिंग दर का अनुमान लगा सकते हैं.
  4. सिग्नल को सुचारू करने के लिए σ = 3 के साथ एक गाऊसी फ़िल्टर लागू करें।
    नोट: पैरामीटर को विदेश मंत्रालय प्रणाली से अनुशंसित मूल्यों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, क्योंकि अत्यधिक चौरसाई के परिणामस्वरूप अधिग्रहण के बाद डेटा विरूपण हो सकता है, और बहुत कम चौरसाई अवांछित शोर का परिचय देगी।
  5. गाऊसी-चिकने सिग्नल के मानक विचलन के 5 गुना के रूप में संभावित स्पाइक्स का पता लगाने के लिए एक सीमा निर्धारित करें।
  6. खिड़की की लंबाई (यानी, 50 एमएस) द्वारा सभी 16 चैनलों में 50 एमएस विंडो में पंजीकृत स्पाइक्स की संख्या को विभाजित करके फायरिंग दर की गणना करें। अगले फ्रेम के लिए संकेत के साथ खिड़की पाली, और फायरिंग दर गणना (अनुपूरक चित्रा 1) दोहराएँ.
  7. FUS से जुड़ी फायरिंग दर में परिवर्तन के आधार पर स्थानांतरित डेटा से FUS सोनिकेशन समय पढ़कर सिग्नल का विश्लेषण करें।

5. बहु-अच्छी तरह से एमईए प्लेट की सफाई और पुन: उपयोग

  1. एक बार प्रयोगों पूरा कर रहे हैं, ध्यान से इलेक्ट्रोड सतह से बचने के लिए ध्यान रखना, बहु अच्छी तरह से थाली में कुओं से माध्यम को हटाने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें.
  2. प्रति कुएं में 2 एमएल डीजी-डीआई पानी डालें। महाप्राण और एक बार दोहराएं।
  3. किसी भी कोशिकाओं और मलबे को नापसंद करने के लिए, प्लेट में बाँझ डीजी-डीआई पानी (0.3 एमएल प्रति कुआं) के 10 एमएल के साथ एंजाइमी डिटर्जेंट टेर्ग-ए-जाइम के 1 ग्राम का मिश्रण जोड़ें। इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर सेते रहने दें।
  4. अगले दिन, कुओं से समाधान को हटा दें, और उन्हें बाँझ डीजी-डीआई पानी के 1 एमएल के साथ कुल्ला।
  5. 5-7 मिनट के लिए बहु अच्छी तरह से थाली सेते हैं, और महाप्राण. इस चरण को 5 बार दोहराएं।
  6. प्रति कुएं बाँझ डीजी-डीआई पानी के 0.5 एमएल जोड़ें। साफ बहु अच्छी तरह से थाली की आधार रेखा रिकॉर्ड करने के लिए मान्य है कि विदेश मंत्रालय थाली साफ है. एक साफ प्लेट कम तीव्रता मूल्यों के साथ गाऊसी शोर पैटर्न प्रदर्शित करना चाहिए.
  7. साफ बहु अच्छी तरह से थाली 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक यह फिर से इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. विदेश मंत्रालय में प्रति माह कम से कम एक बार संग्रहीत पानी को बदलें।

Representative Results

संक्षेप में, हम एक प्रोटोकॉल है कि इन विट्रो FUS neuromodulation HiPSCs से सुसंस्कृत न्यूरॉन्स का उपयोग कर निगरानी में सक्षम बनाता है प्रस्तुत करते हैं. HiPSC प्रेरित न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने और विश्लेषण के लिए इसी विद्युत प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए समग्र प्रणाली मंच चित्रा 1 में उल्लिखित है. यह अध्ययन न्यूरॉन्स की एफयूएस उत्तेजना और विदेश मंत्रालय प्रणाली में विद्युत प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने पर केंद्रित है, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। FUS और MEA सिस्टम के परिधीय घटक और उनके कनेक्शन चित्र 3 में चित्रित किए गए हैं।

फोकल पॉइंट का लक्षण वर्णन न्यूरोनल प्रयोगों से पहले किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अच्छी तरह से नीचे पूरी तरह से एफयूएस फोकल पॉइंट द्वारा कवर किया गया है। थर्मोक्रोमिक शीट पर फोकल स्पॉट का दृश्य, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, एफयूएस सिस्टम का मूल्यांकन करने के लिए किया जाना चाहिए। फोकल स्पॉट लक्षण वर्णन के बाद, फ़िल्टरिंग, थ्रेसहोल्डिंग और फायरिंग दर की गणना सहित पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और इन्हें चित्रा 5 और चित्रा 6 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। पर्यावरण से शोर को छानकर उपयोगी संकेतों को पुनः प्राप्त करने के लिए ये कदम आवश्यक हैं और इस प्रकार, FUS के कारण होने वाले न्यूरोनल गतिविधि परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए। चित्रा 6 ए-बी में रेखापुंज भूखंडों प्रत्येक चैनल में पता चला spikes दिखा. चूंकि कुएं का पूरा तल FUS ट्रांसड्यूसर के केंद्र बिंदु के भीतर है, इसलिए यह उम्मीद की जाती है कि FUS को सभी इलेक्ट्रोड में फायरिंग दर को बदलना चाहिए। फायरिंग दर में यह परिवर्तन चित्रा 6 सी में दिखाए गए फायरिंग दर प्लॉट में देखा गया है, जो दर्शाता है कि चुने गए उत्तेजना मापदंडों के परिणामस्वरूप न्यूरोनल फायरिंग दर में वृद्धि हुई है। विशेष रूप से, प्री-एफयूएस (यानी, बेसलाइन) फायरिंग दर 140 हर्ट्ज ± 116.7 हर्ट्ज थी, जबकि पोस्ट-एफयूएस फायरिंग दर निरंतर-तरंग एफयूएस के साथ 786 हर्ट्ज ± 419.4 हर्ट्ज थी। इसके अतिरिक्त, चित्रा 6 सी दिखाता है कि एफयूएस मापदंडों को बदलना (उदाहरण के लिए, निरंतर-लहर के बजाय स्पंदित-तरंग एफयूएस का उपयोग करके) फायरिंग दर में परिवर्तन की भयावहता को बदल सकता है, साथ ही न्यूरॉन्स के अपने आधारभूत राज्य में लौटने से पहले समय की मात्रा को बदल सकता है। कम तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एलआईएफयू) संस्कृतियों के महत्वपूर्ण वार्मिंग का कारण नहीं बनता है, खासकर जब उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड की तुलना में, जो थर्मल घाव को प्राप्त करने का इरादा रखता है। नैदानिक रूप से प्रभावशाली तापमान परिवर्तन की कमी सैद्धांतिक गणना और सिमुलेशन (पूरक चित्रा 2) द्वारा समर्थित है। यहां तक कि तालिका 1 में सूचीबद्ध प्रयोगात्मक एफयूएस मापदंडों के चरम मामलों में, तापमान में केवल न्यूनतम वृद्धि लगभग 0.04 डिग्री सेल्सियस देखी जा सकती है।

फायरिंग रेट प्लॉट का उपयोग FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है और इसका उपयोग उत्तेजक और निरोधात्मक प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है। मल्टी-वेल एमईए प्लेट का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इसे उच्च-थ्रूपुट तरीके से अलग-अलग न्यूरोनल राज्यों और उत्तेजना मापदंडों का अध्ययन करने के लिए कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक अच्छी तरह से न्यूरॉन्स के केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म का अवलोकन और माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करके उनकी न्यूरोनल गतिविधि का माप। प्रत्येक इलेक्ट्रोड (लाल, हरे और नीले रंग की रेखाएं) एक ही कुएं के भीतर न्यूरॉन्स की आबादी से रिकॉर्ड करती हैं। कच्चे न्यूरोनल इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग को न्यूरोनल फायरिंग पैटर्न का पता लगाने में बदलने के लिए एक प्रोसेसिंग पाइपलाइन लागू की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक बहु-अच्छी तरह से माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) के साथ एफयूएस न्यूरोमॉड्यूलेशन। (ए) एक बहु-अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय के साथ एफयूएस न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए सेटअप का योजनाबद्ध। FUS ट्रांसड्यूसर द्वारा उत्पन्न ध्वनिक तरंगें degassed पानी से भरे FUS शंकु के माध्यम से फैलती हैं और अल्ट्रासाउंड जेल का उपयोग करके युग्मित होती हैं। संदूषण को रोकने के लिए रबर बैंड का उपयोग करके पैराफिल्म को कुएं में सुरक्षित किया जाता है। एमईए प्लेट न्यूरॉन्स से एमईए सिस्टम में विद्युत रिकॉर्डिंग भेजती है। (बी) विदेश मंत्रालय प्रणाली में निहित मल्टी-वेल प्लेट पर एफयूएस ट्रांसड्यूसर की एक तस्वीर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो प्लेटफॉर्म सेटअप में। (ए) इन विट्रो प्लेटफॉर्म सेटअप के सामने। ट्रांसड्यूसर पावर आउटपुट (टीपीओ; बाएं) का उपयोग एफयूएस मापदंडों को प्रोग्राम करने के लिए किया जाता है। विदेश मंत्रालय प्रणाली (दाएं) अच्छी तरह से प्लेट में न्यूरॉन्स से विद्युत गतिविधि रिकॉर्ड करती है, जो एफयूएस ट्रांसड्यूसर द्वारा न्यूरोमॉड्यूलेटेड होती है। (बी) मिलान नेटवर्क (1) टीपीओ और (2) ट्रांसड्यूसर से कनेक्शन के साथ इन विट्रो प्लेटफॉर्म सेटअप के पीछे। (3) विदेश मंत्रालय प्रणाली से टीपीओ तक कनेक्शन डेटा अधिग्रहण को सिंक्रनाइज़ करता है। (4) डेटा ट्रांसफर के लिए विदेश मंत्रालय सिस्टम से कंप्यूटर से कनेक्शन। (5) विदेश मंत्रालय प्रणाली से बिजली कनेक्शन। (6) FUS प्रणाली से बिजली कनेक्शन। (7) सोनिकेशन बटन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: FUS ट्रांसड्यूसर की विशेषता। (ए) AMPLITUDE प्रणाली15 द्वारा मापा तालिका 1 में विस्तृत FUS मापदंडों का उपयोग करके फोकल स्पॉट का एक दबाव मानचित्र। (बी) चित्रा 3 में दिखाए गए प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके एक अच्छी तरह से के तल पर रखी थर्मोक्रोमिक शीट के पूर्व और बाद के सोनिकेशन। थर्मोक्रोमिक शीट तापमान परिवर्तन के जवाब में रंग बदलती है, जो न्यूरॉन्स के स्थान पर सफल उत्तेजना का दृश्य सत्यापन प्रदान करती है। सेमी2 की अधिकतम स्थानिक-शिखर पल्स औसत तीव्रता (ISPPA) और 3 मिनट के निरंतर sonication को इस तरह के फोकल पॉइंट के बेहतर दृश्य के लिए स्थानीय तापमान को काफी हद तक बदलने के लिए समायोजित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रसंस्करण पाइपलाइन। चरण 1: कच्ची विद्युत रिकॉर्डिंग N = 16 चैनलों से कैप्चर की जाती हैं। भविष्य के चरण चैनल 16 (लाल रंग में उल्लिखित) का उपयोग करके प्रक्रिया दिखाते हैं। चरण 2: प्रत्येक चैनल के लिए, एक बटरवर्थ बैंडपास फ़िल्टर (5 हर्ट्ज से 3 किलोहर्ट्ज़ बैंडपास) लागू किया जाता है, उसके बाद एक गाऊसी फ़िल्टर (σ = 3) होता है। एक सीमा को सोनिकेशन की शुरुआत में केंद्रित 2 एस विंडो के भीतर सिग्नल के मानक विचलन के पांच गुना के रूप में सेट किया गया है। चरण 3: थ्रेशोल्ड के ऊपर या नीचे के संकेतों को स्पाइक्स के रूप में जाना जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: रेखापुंज और फायरिंग दर भूखंड। (ए) सोनिकेशन समय के एक समारोह के रूप में प्रत्येक चैनल पर पता लगाए गए स्पाइक्स के रेखापुंज प्लॉट। FUS उत्तेजना का समय एक लाल रेखा का उपयोग करके एनोटेट किया जाता है। (बी) तुलना के लिए निरंतर एफयूएस के साथ विभिन्न एफयूएस सेटिंग्स के तहत न्यूरॉन्स का रेखापुंज प्लॉट। (सी) फायरिंग दर की गणना 50 एमएस स्लाइडिंग विंडो का उपयोग करके की गई थी। एफयूएस न्यूरोमॉड्यूलेशन से पहले और बाद की औसत फायरिंग दर क्रमशः 140 हर्ट्ज और 786 हर्ट्ज थी। स्पंदित FUS के साथ, औसत फायरिंग दर 230 हर्ट्ज और 540 हर्ट्ज थी। एक छोटी सक्रियता और कम दर परिवर्तन अलग-अलग FUS उत्तेजना के इस सेट द्वारा प्रेरित होने के लिए मनाया गया। फायरिंग दर की गणना के लिए प्रक्रिया पूरक चित्रा 1 में विस्तृत है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राचल मूल्य
अधिकतम पावर / 1.200 डब्ल्यू
पीवास्तविक 0.749 डब्ल्यू/चैनल।
मैंएसपीपीए 10.79 वाट/सेमी2
मैंएसपीटीए 0.05 डब्ल्यू/सेमी2
फट लंबाई 0.100 एमएस
आवृत्ति 250.00 किलोहर्ट्ज़
फ़ोकस 39.800 मिमी
काल 20.000 एमएस
समयपाल 60.000 सेकेंड

तालिका 1: चित्रा 4 में प्रस्तुत अध्ययन के लिए टीपीओ पर केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) पैरामीटर।

अनुपूरक चित्रा 1: रेखापुंज भूखंड से फायरिंग दर तक प्रसंस्करण। चरण 1: किसी दिए गए स्लाइडिंग विंडो के भीतर गिनती संख्या प्राप्त करने के लिए सभी चैनलों के बीच स्पाइक्स की गणना करें। नोट: यहां, बेहतर चित्रण के लिए एक बड़ी स्लाइडिंग विंडो (0.1 एस पर सेट) को चुना गया था। चरण 2: प्रति विंडो लंबाई स्पाइक्स को प्रति सेकंड स्पाइक्स में बदलें (उदाहरण के लिए, यहां, हर्ट्ज [हर्ट्ज] में बदलने के लिए 10 से गिनती गुणा करें, और फिर किलोहर्ट्ज़ [kHz] में मान प्राप्त करने के लिए 1,000 से विभाजित करें)। चरण 3: परिणामस्वरूप फायरिंग दर वक्र का अधिग्रहण किया गया। नमूना डेटा के साथ एक ओपन-सोर्स टूलकिट, GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod) पर उपलब्ध है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: एलआईएफयू16 के के-वेव सिमुलेशन परिणाम तापमान प्रोफाइल। चित्रा 4 में दिखाए गए ध्वनिक तीव्रता मानचित्र के आधार पर, के-वेव सिमुलेशन परिणाम तालिका 1 में सूचीबद्ध प्रयोगात्मक एफयूएस मापदंडों के चरम मामले का उपयोग करके फोकल ज़ोन (त्रिज्या: 2 मिमी) के केंद्र क्षेत्र के भीतर 0.04 डिग्री सेल्सियस की अधिकतम तापमान वृद्धि का सुझाव देता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह पांडुलिपि एक उपन्यास विधि का वर्णन करती है जिसका उपयोग एफयूएस न्यूरोमॉड्यूलेशन के दौरान हिपीएससी में न्यूरोनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न FUS ट्रांसड्यूसर और MEA सिस्टम के लिए सामान्य है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ देखे गए परिणामों को दोहराने के लिए, शोधकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ट्रांसड्यूसर का केंद्र बिंदु विदेश मंत्रालय के नीचे के क्षेत्र से अधिक है। इसके अलावा, यदि विभिन्न न्यूरोनल सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो फिल्टर मापदंडों को अच्छी तरह से कोशिकाओं के लिए अपेक्षित आवृत्ति प्रतिक्रिया के लिए ट्यून किया जाना चाहिए। यदि प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं, तो किसी को उपरोक्त मापदंडों (जैसे, फट लंबाई, तीव्रता, कर्तव्य चक्र, आदि) को संशोधित करने पर विचार करना चाहिए।

हालांकि इस काम ने एफयूएस उत्तेजना के बाद फायरिंग दर में वृद्धि का प्रदर्शन किया, लेकिन किसी भी निष्कर्ष को निकालने से पहले इस खोज की पुनरावृत्ति को प्रदर्शित करने के लिए अधिक डेटा एकत्र किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल विदेश मंत्रालय प्रणालियों की सीमाओं को विरासत में मिला है, जिसमें आमतौर पर प्रत्यक्ष माइक्रोइलेक्ट्रोड वर्तमान सिग्नल रिकॉर्डिंग से उत्पन्न कमजोरियां होती हैं। हालांकि न्यूरॉन के साथ सीधा संपर्क बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है, यह सेल को बदल सकता है और माप सटीकता को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, कुओं के छोटे आकार के कारण, हमारी प्रणाली में परिधीय ऊतक शामिल नहीं है, जो न्यूरोमॉड्यूलेशन17में भी भूमिका निभा सकता है। यह इस सेटअप से निकाले गए निष्कर्षों की प्रयोज्यता को विवो वातावरण में सीमित कर सकता है। अधिक जटिल नेटवर्क प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, एक उच्च चैनल घनत्व विदेश मंत्रालय प्रणाली अपनी संवेदनशीलता18 में सुधार करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. इस प्रस्तावित प्रणाली के लिए कई भविष्य दिशाओं की पहचान की गई है, जिसमें ट्रांसड्यूसर को पकड़ने और सटीक प्लेसमेंट19 सुनिश्चित करने के लिए 3 डी गैन्ट्री का उपयोग करना शामिल है। पोस्ट-प्रोसेसिंग एल्गोरिथ्म के संबंध में अतिरिक्त सुधार किए जा सकते हैं, जिसमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को वर्गीकृत करने के लिए स्पाइकिंग सॉर्टिंग एल्गोरिदम20 का उपयोग करना शामिल है। यह प्रक्रिया FUS के तंत्र पर भविष्य के अध्ययनों में बहु-इकाई न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए फायदेमंद होगी। सबसे महत्वपूर्ण बात, अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक, विद्युत और ऑप्टिकल उत्तेजनाओं जैसे उत्तेजना के अतिरिक्त तौर-तरीकों को शामिल करना आवश्यक है। इन तरीकों न्यूरोनल गुणों और व्यवहार बदल सकते हैं, इस तरह के विशिष्ट आयन चैनलों15 को बाधित या झिल्ली विशेषताओं21 को संशोधित करके जैसे. परिकल्पित सिग्नलिंग मार्ग के भीतर मुख्य कारकों को संशोधित करके, शोधकर्ता नियंत्रित वातावरण में प्रत्येक कारक के योगदान की पहचान कर सकते हैं और अंततः, खेल में जटिल बातचीत पर प्रकाश डाल सकते हैं।

विद्युत उत्तेजना22 न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए सबसे स्थापित तकनीकों में से एक है, जिसमें नैदानिक और अनुसंधान सेटिंग्स में सफल अनुप्रयोगों का एक लंबा इतिहास है। इसके विपरीत, FUS और ऑप्टोजेनेटिक्स23 अपेक्षाकृत नए तौर-तरीके हैं जिन्होंने हाल के वर्षों में ध्यान आकर्षित किया है। FUS के प्रमुख लाभ इसकी गैर-इनवेसिवनेस और गहराई पर न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने की क्षमता है जो विद्युत उत्तेजना और ऑप्टोजेनेटिक्स सहित अन्य तकनीकों तक पहुंचना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक्स24 की तरह, एफयूएस में तरंग प्रसार और संबंधित न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के मॉडलिंग से संबंधित कुछ सीमाएं हैं। विवो में ऊतक के विषम ध्वनिक गुणों की जटिलता को पकड़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो दबाव क्षेत्र में अनिश्चितताओं की ओर जाता है और, परिणामस्वरूप, न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं में। इन गुणों को सटीक रूप से मॉडलिंग करने में यह कठिनाई विशिष्ट वास्तविक दुनिया के अनुप्रयोगों के लिए तकनीक का अनुकूलन करते समय एक चुनौती प्रस्तुत करती है। अंतर्निहित जटिलताएं इस अध्ययन में एक की तरह इन विट्रो सिस्टम के महत्व पर जोर देती हैं, क्योंकि वे नियंत्रित ध्वनिक तीव्रता स्थितियों के तहत प्रतिक्रियाओं के प्रत्यक्ष अध्ययन को सक्षम करते हैं।

अंत में, यह प्रणाली मानव न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म में एक उच्च-थ्रूपुट प्रदान करती है। इस प्रणाली के साथ, एफयूएस की कार्रवाई के तंत्र को मानव न्यूरॉन्स से विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापकर पता लगाया जा सकता है जब एक नियंत्रित वातावरण में विभिन्न स्तरों और उत्तेजना के प्रकारों के संपर्क में आता है। इसलिए, यह आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले मानव और पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान पूरक उपकरण प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है। अमीर मनबाची बीके मेडिकल (जीई हेल्थकेयर) और न्यूरोसोनिक्स मेडिकल के लिए सिखाता है और परामर्श करता है और कई पेटेंट-लंबित एफयूएस प्रौद्योगिकियों पर एक आविष्कारक है। बेट्टी टायलर के पास एनआईएच से अनुसंधान निधि है और त्वरित संयोजन चिकित्सा (इक्विटी या विकल्प सहित) का सह-मालिक है। अश्वत्था थेरेप्यूटिक्स इंक ने अपने एक पेटेंट को लाइसेंस दिया है और वह पीबॉडी फार्मास्यूटिकल्स के लिए एक शेयरधारक है।

Acknowledgments

अमीर मनबाची और नीतीश ठाकोर ने डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी, डीएआरपीए, अवार्ड कॉन्ट्रैक्ट: N660012024075 से फंडिंग सपोर्ट स्वीकार किया। इसके अलावा, आमिर मनबाची जॉन्स हॉपकिन्स इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल रिसर्च (ICTR) के क्लिनिकल रिसर्च स्कॉलर्स प्रोग्राम (KL2) से फंडिंग सपोर्ट को स्वीकार करते हैं, जो नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज (NCATS), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) द्वारा प्रशासित है। नीतीश ठाकोर ने राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से वित्त पोषण सहायता को स्वीकार किया: R01 HL139158-01A1 और R01 HL071568-15।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEA System Axion Biosystem Inc. Maestro Edge Sampling Rate: 11500 Hz
MEA Plate Axion Biosystem Inc. CytoView MEA Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells
Well plate Interface Amcor Inc. Parafilm PM996; P7793 Thickness: 127 µm
CO2 Tank and Regulator for culture AirGas Inc./ Harris Inc. 9296NC Concentration: 5%
Culture Media ThermoFisher Inc. Laminin; 23017-015 Concentration: 1 µg/mL
HiPSC Neurons Peprotech CIPS and GM01582 Derived; 450-10 Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)
Transducer Sonic Concepts Inc. CTX250; 008 Center Frequency: 250 kHz
Matching Network Sonic Concepts Inc. CTX250; NFS102v2 Impedance: 50 Ω
Transducer Power Output (TPO) Sonic Concepts Inc. Version 4.1; 020 Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz
Membrane McMaster Inc. Silicone Rubber; 5542N115 Thickness: 0.0127 cm
Coupling Gel Parker Laboratory Inc. Aquasonic 100; B08DDWG GXB Viscosity: 130,000–185,000 cops
Connection to Probe holder McMaster Inc. Steal Threaded Rod; 90322A661 Length: 1–1/2" Long
Centrifuge ThermoFisher Inc. Sorvall Legend X1R; 75004261 Max acceleration: 10–25,830 x g
Hydrophone Sonic Concepts Inc. Y-104; 009 Range: 50 kHz–1.9 MHz
Water Tank Sonic Concepts Inc. WT Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Water Conditioning Unit Sonic Concepts Inc. WCU; SN006 Flow Velocity: 50 mL/s maximum
Oscilloscope Rohde-Schwarz Inc. RTC1002 Sampling rate: Up to 50 MHz
Stage Sonic Concepts Inc. MicroStage; 2 Accuracy: 1 µm
Thermochromic sheet TIPTEMP Inc. Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 Range: 22–24 °C
Computer Microsoft Surface Surface Pro CPU i5 1035G4: 3.7 GHz
Data Transfer Software Mathworks Inc. MATLAB Version 2021b
Processing Software Python Software Foundation Python Version 3.7.10

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References

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  3. Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83 (2021).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 207
मल्टी-वेल माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों में मानव <em>इन विट्रो</em> तंत्रिका संस्कृतियों का केंद्रित अल्ट्रासाउंड न्यूरोमॉड्यूलेशन
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Liang, R., Mess, G., Punnoose, J., Kempski Leadingham, K. M., Smit, C., Thakor, N., Habela, C. W., Tyler, B., Salimpour, Y., Manbachi, A. Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (207), e65115, doi:10.3791/65115 (2024).

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