Summary
Ici, nous proposons un protocole pour l’administration intratrachéale de lipopolysaccharides (LPS) via une intubation endotrachéale oropharyngée non invasive. Cette méthode minimise le traumatisme de l’intervention chirurgicale pour l’animal et délivre avec précision le LPS à la trachée, puis aux poumons.
Abstract
Le modèle murin de lésion pulmonaire aiguë (LAI) induite par le lipopolysaccharide (LPS) ou l’endotoxine est toujours parmi les modèles les plus couramment utilisés dans les études animales de lésions pulmonaires aiguës ou d’inflammation aiguë. Les méthodes actuellement les plus couramment utilisées dans les modèles murins de lésions pulmonaires aiguës sont l’injection intrapéritonéale de LPS et la trachéotomie pour la perfusion trachéale de LPS. Cependant, la première méthode manque de ciblage pulmonaire et endommage d’autres organes, et la dernière méthode induit un traumatisme opératoire, un risque d’infection et un faible taux de survie. Ici, nous recommandons une méthode d’intubation endotrachéale oropharyngée non invasive pour l’instillation de LPS chez la souris. Dans cette méthode, le LPS est introduit de manière non invasive dans la trachée par la cavité oropharyngée pour être instillé dans les poumons à l’aide d’un appareil d’intubation endotrachéale. Cette méthode assure non seulement le ciblage pulmonaire, mais évite également les dommages et le risque de mort chez les animaux. Nous nous attendons à ce que cette approche soit largement utilisée dans le domaine des lésions pulmonaires aiguës.
Introduction
Les lésions pulmonaires aiguës (LAI) sont un syndrome clinique courant. Sous une variété de facteurs pathogènes, la perturbation de la barrière physiologique des cellules épithéliales pulmonaires et des cellules endothéliales vasculaires entraîne une augmentation de la perméabilité alvéolaire, entraînant ainsi une diminution de la compliance pulmonaire, un œdème pulmonaire et une hypoxémie sévère1. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est la forme la plus grave de LAI. L’inflammation incontrôlée et les dommages causés par le stress oxydatif sont considérés comme les principales causes de l’ALI et du SDRA2 plus grave. Lorsque les cellules épithéliales alvéolaires sont directement endommagées en raison d’un traumatisme, la chaîne de réponse inflammatoire des macrophages alvéolaires est activée, entraînant une inflammation du poumon3. À l’échelle mondiale, il y a plus de 3 millions de patients atteints de SDRA aigu par an, et ils représentent environ 10 % des admissions en unité de soins intensifs; De plus, le taux de mortalité dans les cas graves atteint 46 %4,5,6. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un modèle animal approprié d’ALI pour étudier sa pathogenèse. La souris est l’animal expérimental le plus couramment utilisé dans l’étude de l’ALI, car ses voies respiratoires peuvent bien simuler les voies respiratoires humaines pour les études sur l’ALI. De plus, l’ALI se manifeste par une infiltration massive de cellules inflammatoires, une augmentation de la perméabilité vasculaire pulmonaire et un œdème pulmonaire. Les changements dans les cytokines inflammatoires dans le sérum et le rapport poids sec-humide des poumons reflètent le degré d’ALI7.
À l’heure actuelle, les principales méthodes de modélisation de l’ALI induite par le LPS chez la souris comprennent l’intubation trachéale intranasale et chirurgicale 8,9. Ici, nous proposons une nouvelle méthode pour délivrer du LPS dans la trachée par intubation oropharyngée non invasive. Cette méthode utilise un intubateur éclairé pour trouver la trachée de la souris, puis délivre du LPS dans la trachée et les poumons. Cette méthode délivre le LPS aux poumons avec plus de précision que la méthode d’administration intranasale. Par rapport à l’intubation trachéale chirurgicale, cette méthode ne nécessite pas de chirurgie, évite de causer des plaies et réduit la douleur chez la souris10. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour établir un modèle murin plus convaincant de l’IAL.
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Protocol
Le protocole d’expérimentation animale a été examiné et approuvé par le Comité de gestion de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (dossier n° 2021-11). Des souris C57/BL mâles (20-25 g, âgées de 6 à 8 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été gardées dans une chambre animale et étaient libres de boire et de manger pendant l’expérience.
1. Préparation
- Assurez-vous que la plate-forme d’intubation se compose d’une base, d’une colonne montante, d’un trombone, de deux élastiques et de ficelles. Prenez une ficelle, passez la ficelle à travers les deux trous au sommet de la colonne montante et attachez les deux extrémités de la ficelle, respectivement, aux petites saillies au sommet de la colonne montante.
REMARQUE: Laissez de la place pour que la tête de la souris passe entre la chaîne et les deux trous. - Attachez deux élastiques à chaque extrémité du trombone et collez le trombone avec les élastiques à l’arrière de la colonne montante. Enfin, fixez le riser à la base à 90° (Figure 1).
- Sélectionnez une canule de la taille et de la longueur appropriées. Pour une souris de 20−30 g, un cathéter de 22 G (2,5−3,8 cm de long) peut être utilisé11. Assemblez la canule sur un stylo canule et allumez la lumière du stylo (Figure 2).
- Préparez de petites pinces chirurgicales et une pipette Pasteur en les désinfectant avec de l’alcool à 70%.
2. Préparation de la substance d’essai
- Peser et dissoudre 3 mg de LPS dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2) pour former une solution de LPS à une concentration de 3 mg/mL.
- Peser et dissoudre 10 mg de pentobarbital sodique dans 1 mL de solution saline normale pour former une solution de pentobarbital sodique à 1 %. Filtrer-stériliser la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm.
3. Instillation oropharyngée non invasive
- Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 1% de pentobarbital sodique à une dose de 50 mg/kg12,13. Déterminer la profondeur de l’anesthésie par un manque de réponse au réflexe de redressement.
- Placez la souris anesthésiée sur la plateforme d’intubation. Fixez les dents antérieures supérieures avec le fil et les deux avant-pieds avec les élastiques (Figure 3).
- Retirez la langue avec une pince à épiler et tenez-la avec la main gauche. Poussez lentement la canule, le long de la bouche, avec la main droite vers le haut, jusqu’à l’épiglotte mandibulaire. Utilisez la lumière du stylo canule pour trouver la trachée et insérez-la lentement dans la trachée (Figure 4).
- Une fois la canule insérée dans la trachée, retirez lentement le stylo d’intubation et laissez la canule à l’intérieur. Insérez la pipette Pasteur dans le joint de la canule et appuyez sur la tête (Figure 5).
REMARQUE : Si la poitrine de la souris se gonfle, l’intubation est réussie (Figure 6). - Après une intubation endotrachéale réussie, instiller aux souris 3 mg/mL de LPS à 3 mg/kg à travers la canule à l’aide d’une microseringue à tête plate14,15 (figure 7).
- Une fois cela fait, retirez la canule et la microseringue. Retirez la souris de l’échafaudage et placez-la dans une cage séparément pour récupérer. Observez l’état respiratoire de la souris jusqu’à ce qu’elle se soit rétablie et qu’elle ait retrouvé sa conscience.
NOTE: À 12 h après l’instillation trachéale LPS, euthanasier les souris en suivant la procédure approuvée par le comité d’éthique animale. Les dosages sériques du TNF-α et les mesures du poids des poumons secs et humides ont été effectués à l’aide de procédures standard.
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Representative Results
La méthode proposée pour l’instillation de LPS chez la souris a été vérifiée en évaluant l’expression de la cytokine inflammatoire TNF-α et le rapport poids sec-humide des poumons 12 h après l’instillation de LPS. Il y avait quatre groupes dans l’expérience: témoin à blanc (sans aucun traitement), intubation chirurgicale16, intranasale17,18 et intubation oropharyngée non invasive (n = 6). Par rapport au groupe témoin blanc, les taux sériques de TNF-α dans le groupe d’intubation oropharyngée non invasive ont été significativement augmentés (Figure 8A). Le rapport poids sec-humide des poumons a également augmenté (figure 8B), atteignant le même niveau que celui du groupe d’intubation trachéale chirurgicale. Les ensembles de données ont été analysés statistiquement avec une ANOVA non appariée et des tests de Tukey Kramer à comparaisons multiples post-hoc. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM, et un niveau de p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.
Figure 1 : Raccords et assemblage de la plate-forme d’intubation. La plate-forme se compose d’une base, d’une contremarche, d’un trombone, de deux élastiques et de quelques cordes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Kit d’intubation. Cette figure montre le kit d’intubation et son assemblage. Cela comprend une lampe à stylet, une fibre optique et une canule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Fixation de la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Localisation de la trachée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Vérification de la pompe de la pipette Pasteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Image avant et après de la poitrine montrant une intubation réussie. (A) Poitrine avant l’intubation. (B) Thorax après intubation; La zone montrant le bombement de la poitrine est marquée d’un cercle rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Microéchantillonneur à tête plate pour l’administration de LPS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Évaluation de la validité de l’instillation non invasive de LPS. (A) Expression du TNF-α dans le sérum de souris C57BL/6 12 h après une injection endotrachéale de LPS. (B) Analyse des données du rapport poids sec-humide dans les tissus pulmonaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans un premier temps, nous avons regardé à l’intérieur de la cavité buccale pour trouver l’emplacement de la trachée19. Cependant, au cours de ce processus, nous avons découvert que la trachée des souris C57 / BL est étroite, ce qui rend difficile de trouver l’emplacement correct par cette méthode sans l’aide d’équipements tels qu’un endoscope20. Après une exploration plus approfondie, nous avons constaté que la lumière de la lampe à intubateur pouvait pénétrer la surface du corps, permettant à l’opérateur de déterminer la position de la canule21.
Pour vérifier si le tube était entré dans la trachée, nous avons d’abord essayé d’utiliser un petit miroir, qui a été refroidi en le plaçant sur de la glace. Après l’intubation, nous avons utilisé un miroir pour approcher l’ouverture de la canule. Si de la brume apparaissait sur le miroir, l’intubation était considérée comme réussie. Cependant, nous avons constaté que cette méthode d’examen ne permettait pas de déterminer avec précision si la canule était entrée dans la trachée. Tout d’abord, la tête de canule était proche de la bouche de la souris, et il n’a pas été possible de déterminer si le brouillard qui apparaissait sur le miroir était causé par le gaz expiré de la bouche. Deuxièmement, le miroir devait être refroidi. Lors d’une utilisation constante, le temps nécessaire pour refroidir le miroir a également entraîné une augmentation du temps d’expérience. Nous avons ensuite utilisé une pipette Pasteur pour pomper de l’air dans la trachée; La poitrine de la souris gonflerait si la canule était insérée dans la trachée, et si elle était insérée dans l’œsophage, le bas-ventre droit gonflerait22. Par conséquent, nous avons utilisé cette méthode comme base pour juger si l’intubation a réussi.
Par rapport à l’intubation trachéale chirurgicale, l’intubation oropharyngée non invasive évite les plaies chirurgicales et améliore le taux de survie des animaux de laboratoire23. Par rapport à l’intubation intranasale, l’intubation oropharyngée non invasive conduit à une entrée plus précise de la canule dans les bronches et les poumons24. Cependant, la maîtrise de ces compétences techniques nécessite beaucoup de pratique. Dans le cas de souris de petite taille, l’insertion de la canule dans la trachée est difficile et on peut facilement gratter la trachée pendant l’opération. Par conséquent, nous suggérons que des souris avec des tailles corporelles plus grandes devraient être sélectionnées pour l’expérience.
La méthode peut également être utilisée pour administrer d’autres médicaments liquides à la bronche et au poumon, ce qui signifie qu’elle a un large potentiel d’application25,26.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.: 81903902), la China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), le Sichuan Science and Technology Program (No.: 2020YJ0172) et le Xinglin Scholar Research Premotion Project de l’Université de Chengdu de TCM (No.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
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