Summary
Här föreslår vi ett protokoll för intratrakeal lipopolysackarid (LPS) leverans via icke-invasiv orofaryngeal endotrakeal intubation. Denna metod minimerar trauma av det kirurgiska ingreppet för djuret och levererar exakt LPS till luftstrupen och sedan till lungorna.
Abstract
Musmodellen för akut lungskada (ALI) inducerad av lipopolysackarid (LPS) eller endotoxin är fortfarande bland de vanligaste modellerna i djurstudier av akut lungskada eller akut inflammation. De nuvarande vanligaste metoderna i musmodeller för akut lungskada är en intraperitoneal injektion av LPS och trakeostomi för trakealinfusion av LPS. Den förstnämnda metoden saknar dock lunginriktning och skadar andra organ, och den senare metoden inducerar operativt trauma, infektionsrisk och låg överlevnad. Här rekommenderar vi en icke-invasiv orofaryngeal endotrakeal intubationsmetod för LPS-instillation hos möss. I denna metod införs LPS icke-invasivt i luftstrupen genom orofaryngealhålan för att införas i lungan med hjälp av en apparat för endotrakeal intubation. Denna metod säkerställer inte bara lunginriktning utan undviker också skador och risken för dödsfall hos djuren. Vi förväntar oss att detta tillvägagångssätt kommer att bli allmänt använt inom området akut lungskada.
Introduction
Akut lungskada (ALI) är ett vanligt kliniskt syndrom. Under en mängd olika patogena faktorer leder störningen av den fysiologiska barriären hos lungepitelcellerna och vaskulära endotelceller till ökad alveolär permeabilitet, vilket orsakar minskad lungöverensstämmelse, lungödem och svår hypoxemi1. Acute respiratory distress syndrome (ARDS) är den allvarligaste formen av ALI. Okontrollerad inflammation och oxidativ stressskada anses vara de främsta orsakerna till ALI och den allvarligare ARDS2. När alveolära epitelceller skadas direkt på grund av trauma aktiveras den inflammatoriska responskedjan av alveolära makrofager, vilket leder till inflammation i lungan3. Globalt finns det mer än 3 miljoner patienter med akut ARDS per år, och de står för cirka 10% av intensivvårdsavdelningarna; Dessutom är dödligheten i svåra fall så hög som 46%4,5,6. Därför finns det ett behov av att upprätta en lämplig djurmodell av ALI för att studera dess patogenes. Musen är det vanligaste försöksdjuret i studien av ALI eftersom dess luftvägar kan simulera de mänskliga luftvägarna väl för ALI-studier. Vidare manifesterar ALI som massiv inflammatorisk cellinfiltration, ökad pulmonell vaskulär permeabilitet och lungödem. Förändringarna i inflammatoriska cytokiner i serum och förhållandet mellan torr och våt vikt i lungorna återspeglar graden av ALI7.
För närvarande innefattar de huvudsakliga metoderna för modellering av LPS-inducerad ALI hos möss intranasal och kirurgisk trakealintubation 8,9. Här föreslår vi en ny metod för att leverera LPS till luftstrupen via icke-invasiv orofaryngeal intubation. Denna metod använder en upplyst intubator för att hitta musens luftstrupe och levererar sedan LPS i luftstrupen och lungan. Denna metod levererar LPS till lungorna mer exakt än den intranasala leveransmetoden. Jämfört med kirurgisk trakeal intubation kräver denna metod inte operation, undviker att orsaka sår och minskar smärta hos möss10. Därför kan denna metod användas för att skapa en mer övertygande musmodell av ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöksprotokollet granskades och godkändes av förvaltningskommittén för Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (rekordnummer 2021-11). Möss av hantyp C57/BL (20-25 g, 6-8 veckor gamla) användes i den aktuella studien. Mössen hölls i en djurkammare och var fria att dricka och äta under experimentet.
1. Förberedelse
- Se till att intubationsplattformen består av en bas, en stigare, ett gem, två gummiband och några strängar. Ta en sträng, passera strängen genom de två hålen på toppen av stigaren och binda de två ändarna av strängen till de små utsprången på toppen av stigaren.
OBS: Lämna utrymme för musens huvud att passera mellan strängen och de två hålen. - Bind två gummiband i varje ände av gemet och tejpa gemet med gummibanden på baksidan av stigaren. Slutligen fäst stigaren på basen vid 90 ° (figur 1).
- Välj en kanyl av lämplig storlek och längd. För en 20-30 g mus kan en 22 G kateter (2,5-3,8 cm lång) användas11. Sätt ihop kanylen på en kanylpenna och tänd pennans lampa (bild 2).
- Förbered små kirurgiska pincett och en Pasteur-pipett genom att desinficera dem med 70% alkohol.
2. Beredning av testämnet
- Vikt och lös 3 mg LPS i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,2) för att bilda en LPS-lösning med en koncentration av 3 mg/ml.
- Väg upp och lös upp 10 mg pentobarbitalnatrium i 1 ml normal saltlösning för att bilda en 1% pentobarbitalnatriumlösning. Filtersterilisera lösningen med ett 0,45 μm sprutfilter.
3. Icke-invasiv orofaryngeal instillation
- Bedöva mössen med en intraperitoneal injektion av 1% pentobarbitalnatrium i en dos av 50 mg/kg12,13. Bestäm anestesidjupet genom brist på svar på rätningsreflexen.
- Placera den bedövade musen på intubationsplattformen. Fäst de övre framtänderna med tråden och de två framfötterna med gummibanden (figur 3).
- Dra ut tungan med pincett och håll den med vänster hand. Tryck kanylen långsamt, längs munnen, med höger hand uppåt, till mandibular epiglottis. Använd kanylpennans ljus för att hitta luftstrupen och sätt långsamt in den i luftstrupen (figur 4).
- När kanylen har förts in i luftstrupen, dra långsamt ut intubationspennan och lämna kanylen inuti. Sätt in Pasteur-pipetten i kanylfogen och tryck på huvudet (figur 5).
OBS: Om musens bröstkorg buktar, är intubationen framgångsrik (figur 6). - Efter framgångsrik endotrakeal intubation, injicera mössen med 3 mg/ml LPS vid 3 mg/kg genom kanylen med hjälp av en mikrospruta med platt huvud14,15 (figur 7).
- När du är klar, ta bort kanylen och mikrosprutan. Ta bort musen från ställningen och placera den i en bur separat för att återhämta sig. Observera musens andningstillstånd tills den har återhämtat sig och återfått medvetandet.
OBS: Vid 12 h efter LPS-trakealinstillation, avliva mössen enligt det förfarande som godkänts av djurförsöksetisk kommitté. Serum TNF-α-analyser och torr-våta lungviktmätningar utfördes med standardprocedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den föreslagna metoden för LPS-instillation hos möss verifierades genom att utvärdera uttrycket av det inflammatoriska cytokinet TNF-α och lungans torr-våtviktförhållande 12 timmar efter LPS-instillation. Det fanns fyra grupper i experimentet: blank kontroll (utan behandling), kirurgisk intubation16, intranasal17,18 och icke-invasiv orofaryngeal intubation (n = 6). Jämfört med den blinda kontrollgruppen ökade serumnivåerna av TNF-α i den icke-invasiva orofaryngeala intubationsgruppen signifikant (figur 8A). Lungans torr-våtviktsförhållande ökade också (figur 8B) och nådde samma nivå som i den kirurgiska trakealintubationsgruppen. Datamängderna analyserades statistiskt med en oparad ANOVA och post-hoc multipeljämförelser Tukey Kramer tester. Alla data presenteras som medelvärde ± SEM och en nivå på p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Figur 1: Intubationsplattformsbeslag och montering. Plattformen består av en bas, en stigare, ett gem, två gummiband och några strängar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Intubationssats. Denna figur visar intubationssatsen och dess montering. Detta inkluderar en pennlampa, en optisk fiber och en kanyl. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Musfixering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Lokalisering av luftstrupen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Verifiering av pasteurpipettpump. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Före och efter bild av bröstet som visar framgångsrik intubation. (A) Bröstkorg före intubation. b) Bröstkorg efter intubation. Området som visar bröstets utbuktning är markerat med en röd cirkel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Flat head microsampler för leverans av LPS. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Bedömning av giltigheten av den icke-invasiva LPS-instillationen . (A) Uttryck av TNF-α i serum hos C57BL/6-möss 12 timmar efter en endotrakeal injektion av LPS. (B) Dataanalys av förhållandet mellan lungvävnad och torr-våtvikt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inledningsvis tittade vi inuti munhålan för att hitta platsen för luftstrupen19. Men under denna process upptäckte vi att luftstrupen hos C57 / BL-möss är smal, vilket gör det svårt att hitta rätt plats med denna metod utan hjälp av utrustning som ett endoskop20. Vid ytterligare undersökning fann vi att ljuset från intubatorlampan kunde tränga igenom kroppens yta, så att operatören kunde bestämma kanylensposition 21.
För att kontrollera om röret hade kommit in i luftstrupen försökte vi först använda en liten spegel, som kyldes genom att placera den på is. Efter intubation använde vi en spegel för att närma oss kanylöppningen. Om dimma dök upp på spegeln ansågs intubationen vara framgångsrik. Vi fann dock att denna undersökningsmetod inte exakt kunde avgöra om kanylen hade kommit in i luftstrupen. Först var kanylhuvudet nära musens mun, och det kunde inte fastställas om dimman som uppträdde på spegeln orsakades av utandad gas från munnen. För det andra behövde spegeln kylas. Vid konstant användning ledde den tid som krävdes för att kyla spegeln också till en ökning av experimenttiden. Vi använde sedan en Pasteur-pipett för att pumpa luft in i luftstrupen; Musens bröstkorg skulle svälla om kanylen sattes in i luftstrupen, och om den sattes in i matstrupen skulle den högra underlivet svälla22. Därför använde vi denna metod som grund för att bedöma om intubationen lyckades.
Jämfört med kirurgisk trakealintubation undviker icke-invasiv orofaryngeal intubation kirurgiska sår och förbättrar överlevnaden hos försöksdjuren23. Jämfört med intranasal intubation leder icke-invasiv orofaryngeal intubation till mer exakt inträde av kanylen i bronkus och lungor24. Att behärska dessa tekniska färdigheter kräver dock mycket övning. När det gäller möss med små kroppsstorlekar är det svårt att sätta in kanylen i luftstrupen, och man kan lätt repa luftstrupen under operationen. Därför föreslår vi att möss med större kroppsstorlekar bör väljas för experimentet.
Metoden kan också användas för att leverera andra flytande läkemedel till bronkerna och lungan, vilket innebär att den har bred applikationspotential25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr: 81903902), China Postdoctoral Science Foundation (nr: 2019M663457), Sichuan Science and Technology Program (nr: 2020YJ0172) och Xinglin Scholar Research Premotion Project vid Chengdu University of TCM (nr: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
