Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقة لإعداد جهاز قائم على منصة الروك فعال من حيث التكلفة يستخدم للحث على الحرمان من النوم في الفئران. أثبت هذا الجهاز فعاليته في إحداث اضطرابات في أنماط النوم المثبتة بتخطيط كهربية الدماغ (EEG) ، بالإضافة إلى إحداث تغييرات أيضية وجزيئية مرتبطة بالحرمان من النوم.
Abstract
يشير اضطراب إيقاع الساعة البيولوجية إلى عدم التزامن بين البيئة الخارجية أو السلوك والساعة الجزيئية الداخلية ، مما يضعف الصحة بشكل كبير. الحرمان من النوم هو أحد الأسباب الأكثر شيوعا لاضطراب إيقاع الساعة البيولوجية. تم الإبلاغ عن طرائق مختلفة (على سبيل المثال ، المنصات على الماء ، والمناولة اللطيفة ، وغرف القضبان المنزلقة ، والطبول الدوارة ، والهزازات المدارية ، وما إلى ذلك) للحث على الحرمان من النوم في الفئران للتحقيق في آثاره على الصحة. تقدم الدراسة الحالية طريقة بديلة للحرمان من النوم في الفئران. تم تصميم جهاز آلي قائم على منصة الروك وهو فعال من حيث التكلفة ويعطل النوم بكفاءة في الفئران الجماعية على فترات زمنية قابلة للتعديل. يحفز هذا الجهاز تغييرات مميزة للحرمان من النوم مع الحد الأدنى من الاستجابة للإجهاد. وبالتالي ، قد تكون هذه الطريقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة الآثار والآليات الأساسية للحرمان من النوم على التسبب في أمراض متعددة. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر حلا فعالا من حيث التكلفة ، لا سيما عندما تكون هناك حاجة إلى تشغيل أجهزة متعددة للحرمان من النوم بالتوازي.
Introduction
يشير اضطراب إيقاع الساعة البيولوجية إلى عدم التزامن بين البيئة الخارجية أو السلوك والساعة البيولوجية الداخلية. أحد الأسباب الأكثر شيوعا لاضطراب إيقاع الساعة البيولوجية هو الحرمان من النوم1. لا يؤثر الحرمان من النوم سلبا على صحة الإنسان فحسب ، بل يزيد أيضا بشكل كبير من خطر الإصابة بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان2 وأمراض القلب والأوعية الدموية3. ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء الآثار الضارة للحرمان من النوم لا تزال غير معروفة إلى حد كبير ، وإنشاء نماذج للحرمان من النوم أمر ضروري لتعزيز فهمنا في هذا الصدد.
تم الإبلاغ عن طرق مختلفة للحرمان من النوم في الفئران ، مثل استخدام منصات المياه4 ، والمناولة اللطيفة5 ، وغرف القضبان المنزلقة6 ، والطبول الدوارة7 ، وبروتوكولات تحريك الأقفاص5،8،9. تقوم غرف القضبان المنزلقة تلقائيا بمسح القضبان عبر الجزء السفلي من القفص ، مما يجبر الفئران على المشي فوقها والبقاء مستيقظا. تتضمن بروتوكولات تحريك الأقفاص وضع أقفاص على الهزازات المدارية المختبرية ، مما يؤدي إلى اضطراب فعال في النوم. في حين أن هذه الطرق تلقائية وفعالة ، إلا أنها قد تكون باهظة الثمن عندما تكون هناك حاجة إلى أجهزة متعددة للعمل بالتوازي ، خاصة بالنسبة لتصميمات الدراسة المحددة التي تتضمن عددا كبيرا من الفئران المحرومة من النوم اللازمة للتنميط الجيني اليومي. من ناحية أخرى ، تعد منصات المياه وبروتوكولات المناولة اللطيفة طرقا أرخص وأبسط تستخدم عادة للحث على الحرمان من النوم. ومع ذلك ، لا تسمح منصة المياه بالتحكم التلقائي في دورات الحرمان والراحة المحددة مسبقا10,11 ، وتتطلب المعالجة اللطيفة يقظة مستمرة من الباحثين لإزعاج النوم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الخلط بين الطرائق الأخرى ، مثل الطبول الدوارة ، بسبب العزلة الاجتماعية أو الإجهاد12.
مستوحاة من الطريقة القائمة على الهزاز المداري ، نهدف إلى تقديم بروتوكول لإنشاء جهاز قائم على منصة الروك للحرمان من النوم في الفئران. هذه الطريقة رخيصة وفعالة ومرهقة إلى الحد الأدنى ويمكن التحكم فيها وآلية. يسمح لنا البروتوكول الحالي بإنشاء جهاز قائم على منصة الروك بتكلفة أرخص بعشر مرات تقريبا من الهزازات المدارية ، بناء على إمكانية الوصول إلينا. عطل هذا الجهاز النوم بشكل فعال في الفئران الجماعية وتسبب في تغييرات مميزة للحرمان من النوم مع الحد الأدنى من الاستجابة للإجهاد. سيكون مفيدا بشكل خاص للباحثين المهتمين بالتحقيق في الآثار والآليات الأساسية للحرمان من النوم على التسبب في أمراض متعددة ، خاصة عندما تنطوي الدراسة على الحرمان من النوم متعدد المجموعات بالتوازي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع بروتوكولات التجارب على في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات رعاية المختبري في مستشفى رينجي ، كلية الطب ، جامعة شنغهاي جياو تونغ. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8 إلى 10 أسابيع ، في الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتم سرد الأجزاء الرئيسية المطلوبة لإنشاء الجهاز في الشكل 1A.
1. إعداد جهاز الحرمان من النوم
- قم بتأمين أحد طرفي قناة فولاذية مشقوقة 50 سم في منتصف قناة فولاذية مشقوقة 40 سم بمسامير (انظر جدول المواد) لعمل هيكل على شكل حرف T ؛ كرر العملية واصنع هيكلين على شكل حرف T (الشكل 1B-a).
- اجعل الهيكلين على شكل حرف T يقفان لأعلى بتوازي 30 سم ، وقم بتوصيل قيعان الهيكلين على شكل حرف T بأسطوانة فولاذية متوافقة مع المسمار مقاس 30 سم (انظر جدول المواد) باستخدام البراغي (الشكل 1B-b).
- ضع منصة مستطيلة فولاذية (20 × 25 سم) (انظر جدول المواد) بين الهيكلين على شكل حرف T (الشكل 1B-c).
ملاحظة: في حالة عدم توفر منصات مستطيلة فولاذية جاهزة للاستخدام بالحجم المحدد ، يمكن للمرء أن يصنع واحدة عن طريق لحام الفولاذ المسطح بسمك 2 مم. - قم بتأمين كل طرف من طرفي أسطوانة فولاذية متوافقة مع المسمار مقاس 30 سم متصلة في المنصة بمحملين مثبتين على كل هيكل على شكل حرف T على بعد 10 سم لأسفل من الأعلى (الشكل 1B-d).
- قم بتأمين حامل محرك (انظر جدول المواد) على أحد الهياكل على شكل حرف T على بعد 25 سم لأسفل من الأعلى باستخدام البراغي (الشكل 1B-e).
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام لاصق البناء لتأمين حامل المحرك على الهيكل على شكل حرف T بدلا من الأطقم. - قم بتركيب محرك (انظر جدول المواد) على حامل المحرك بمسامير (الشكل 1B-f).
- قم بتأمين مروحة تبريد (انظر جدول المواد) بأشرطة ذاتية القفل على الهيكل على شكل حرف T أسفل المحرك (الشكل 1B-g).
- ثبت طرف محمل قضيب التوصيل بزاوية منصة تواجه المحرك باستخدام مسامير (الشكل 1B-h).
- ثبت طرفا آخر من قضيب التوصيل بعمود المحرك باستخدام البراغي (الشكل 1B-i).
- احفر فتحتين مقاس 4 مم في كل زاوية من الزوايا الأربع لحاوية بلاستيكية أو قفص قياسي (انظر جدول المواد) باستخدام مثقاب كهربائي ، وحفر فتحتين مقاس 4 مم وفتحة سفلية 6 مم على الجانب الأيسر من القفص (الشكل 1B-j).
- قم بتأمين القفص على منصة المستطيل بأشرطة ذاتية القفل من خلال فتحات الزاوية (الشكل 1B-k).
- قم بحفر ثقب 5 مم في غطاء أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام مثقاب كهربائي ، وقم بتوصيل الفتحة بفوهة طويلة مزودة بصمام كروي لمنع تسرب المياه.
ملاحظة: سيكون هيدروجيل خيارا بديلا لإمدادات المياه إذا كان تخصيص زجاجات المياه أمرا صعبا. - قم بتأمين زجاجة الماء المخصصة على الجانب الأيسر من القفص باستخدام أشرطة ذاتية القفل من خلال فتحتين مقاس 4 مم ، مع مرور الفوهة عبر فتحة 6 مم (الشكل 1B-l).
- قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية الناتجة لمحول طوب الطاقة بطرفي المحرك (الشكل 1B-l).
ملاحظة: لا توجد متطلبات قطبية محددة لتوصيل الأسلاك بأطراف المحرك. - قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية المدخلة لمحول طوب الطاقة بموصل الوقت (الشكل 1B-m).
2. تحريض الحرمان من النوم
- اضغط على أزرار علامة الجمع في أقصى اليمين على النصفين الأيسر والأيمن من موصل الوقت (انظر جدول المواد) ، على التوالي ، حتى يظهر "M" على العدادات الميكانيكية على كلا الجانبين (الشكل 1C-a).
- اضغط على أزرار علامة الجمع الوسطى على النصفين الأيسر والأيمن من موصل الوقت حتى يظهر "5M" على العدادات الميكانيكية على كلا الجانبين (الشكل 1C-b).
- اضغط على زر علامة الجمع في أقصى اليسار في النصف الأيسر من موصل الوقت حتى يظهر "15M" على العداد الميكانيكي الأيسر (الشكل 1C-c).
ملاحظة: سيتم بعد ذلك تشغيل موصل الوقت لمدة 15 دقيقة وإيقاف تشغيله لمدة 5 دقائق في الوضع الدوري. - ضع الفئران في القفص بالماء والطعام الإعلاني.
- تزويد موصل الوقت ومروحة التبريد بالطاقة.
ملاحظة: ستتأرجح المنصة الآن عند 10 دورات في الدقيقة. - قم بوزن كل فأر في وقت Zeitgeber 0 (ZT0) كل يوم.
ملاحظة: يضيء الضوء من الساعة 8 صباحا (ZT0) إلى الساعة 8 مساء (ZT12).
3. اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم
- قياس مستويات الجلوكوز الصائم في الفئران الصائمة عن طريق أخذ عينات من الدم من أوردة الذيل.
- حقن محلول الجلوكوز في كل فأر (2 جم / كجم من وزن الجسم) داخل الصفاق باستخدام محاقن سعة 1 مل.
- جمع عينات الدم من خلال الوريد الذيل، واختبار الجلوكوز في الدم في 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 120 دقيقة بعد حقن الجلوكوز ، على التوالي.
- ضع الفئران مرة أخرى في القفص مع الطعام والماء ad libitum بعد الاختبار.
4. حصاد أنسجة المخ
- قطع رأس الفئران بعد التخدير الكافي عن طريق تعريضها للأيزوفلوران (2٪) لمدة 3-5 دقائق.
- كشف الجمجمة وجعل قطع عمودي 1 سم في الجمجمة باستخدام مقص جراحي.
- قم بإزالة الجمجمة باستخدام مرقئ البعوض (انظر جدول المواد) لكشف أنسجة المخ.
- حرك الدماغ بالكامل برفق خارج تجويف الجمجمة باستخدام ملاقط منحنية.
ملاحظة: يجب إزالة أنسجة المخ وفقا للسياسات المحلية. - اغسل أنسجة المخ باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (1x PBS ، 4 درجات مئوية).
- قم بتجميد أنسجة المخ السليمة في النيتروجين السائل وانقل الأنسجة إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
ملاحظة: عند تخزينها في -80 درجة مئوية ، تكون أنسجة المخ المجمدة بالفلاش مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.
5. الكشف عن التعبير الجيني عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
- قم بإذابة أنسجة المخ عند 4 درجات مئوية أو على الثلج.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل ، واستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الطريقة القائمة على تريزول13.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد) بعد استخراج الحمض النووي الريبي.
- قم بإجراء النسخ العكسي لإجمالي الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام) إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة تجارية14.
- قياس مستويات التعبير الجيني عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الفعلي15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الجهاز الثابت للحرمان من النوم في الفئران في الشكل 1 د. في اليوم 7 بعد بدء الحرمان من النوم ، أشار مخطط كهربية الدماغ (EEG) ومراقبة تخطيط كهربية العضل (EMG)16 إلى أن الجهاز قلل بشكل كبير من مدة النوم وزاد من مدة اليقظة في الفئران (الشكل 2A-D). وفي الوقت نفسه ، زاد البروتوكول الحالي بشكل كبير من تراكم الأدينوزين ومستويات mRNA من Homer1a في الدماغ (الشكل 2E ، F) ، وهي علامات على الحرمان الناجح من النوم17. باستخدام مجموعة ELISA18 ، لاحظنا أن مستويات الكورتيكوستيرون في الدم لم تتغير بشكل كبير من خلال بروتوكول الحرمان من النوم الحالي (الشكل 2G). بعد الحرمان من النوم لمدة 7 أيام ، انخفض وزن الجسم والغدة الصعترية بشكل ملحوظ (الشكل 3A-D) ، بما يتفق مع التقارير السابقة19. علاوة على ذلك ، كان تحمل الجلوكوز ضعيفا بشكل كبير في الفئران بعد الحرمان من النوم (الشكل 3E ، F). للتحقيق في التغيرات في التعبير الجيني على مدار الساعة ، تم جمع أنسجة المخ كل 4 ساعات على مدار اليوم. لاحظنا أن أنماط التعبير عن جينات الساعة في الدماغ قد تغيرت بشكل كبير بعد الحرمان من النوم (الشكل 3G والجدول 1) ، مما يشير إلى اضطراب الساعة الجزيئية20.
الشكل 1: إنشاء الجهاز القائم على منصة الروك. (أ) الرسوم التوضيحية التي تصور الأجزاء الرئيسية المطلوبة لتجميع الجهاز القائم على منصة الروك. (ب) خطوات تفصيلية توضح تجميع جهاز الحرمان من النوم. ( ج) الصور التي تعرض إعدادات المعلمات في موصل الوقت. (د) صورة فوتوغرافية لحجرة الاهتزاز المجمعة بالكامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم اضطراب النوم ومستويات الكورتيكوستيرون في الدم في الفئران. (أ) رسم تخطيطي يوضح تسجيل تخطيط كهربية الدماغ / تخطيط كهربية المزاج في الفئران أثناء الحرمان من النوم. (ب) تسجيلات EEG / EMG التمثيلية التي تم تتبعها في الفئران. (ج) الأشكال الموجية التمثيلية EEG / EMG في الفئران أثناء اليقظة ، NREM ، و REM. (د) النسبة المئوية لمدة اليقظة ، ومدة حركة العين غير السريعة ، ومدة حركة العين السريعة المسجلة في الفئران التي اضطربت النوم والفئران الضابطة (n = 4 فئران / مجموعة). * P < 0.05 ، ** P < 0.001. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ NREM ، حركة العين غير السريعة ؛ حركة العين السريعة ، حركة العين السريعة. SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (ه) مستويات mRNA من Homer1a في أنسجة المخ المقاسة في الفئران التي اضطربت النوم والفئران الضابطة (ن = 4 فئران / مجموعة). * P < 0.05 ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ Homer1a ، بروتين سقالات هوميروس 1 أ ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (F) محتوى الأدينوزين في أنسجة المخ يقاس في الفئران التي اضطربت في النوم والفئران الضابطة (ن = 4 فئران / مجموعة) باستخدام مجموعة ELISA. * P < 0.05 ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المزاوج في كل نقطة زمنية. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (ز) قياس تركيز الكورتيكوستيرون في المصل في الفئران التي اضطربت في النوم والفئران الضابطة (ن = 4 فئران لكل نقطة زمنية / مجموعة). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التغيرات الفيزيولوجية المرضية بعد الحرمان من النوم في الفئران. (أ) صور تمثيلية توضح أحجام الفئران في المجموعات المشار إليها. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (ب) التغيرات في وزن الجسم بعد بدء الحرمان من النوم في المجموعات المشار إليها (ن = 24 فأرا لكل مجموعة). ** P < 0.001 ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. ج: صور تمثيلية توضح أحجام الغدة الصعترية في المجموعات المشار إليها. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (د) مقارنة نسب وزن الغدة الصعترية إلى وزن الجسم بين المجموعتين (ن = 24 فأرا لكل مجموعة). ** P < 0.001 ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (ه) نتائج اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق في المجموعات المشار إليها (ن = 5 لكل مجموعة). *P < 0.01; ** P < 0.001 ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (F) مقارنة المنطقة تحت المنحنى (AUC) لاختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق بين مجموعة الحرمان من النوم والمجموعة الضابطة (ن = 5 لكل مجموعة). ** P < 0.001 ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مزاوج. الاختصارات: نسبة النقر إلى الظهور ، المجموعة الضابطة ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. (ز) تم قياس أنماط التعبير اليومي لجينات الساعة (Bmal1 و Dbp و Cry1 و Cry2 و Nr1d1 و Nr1d2 و Per1 و Per2) في أنسجة المخ في مجموعة الحرمان من النوم والمجموعة الضابطة (n = 4 فئران لكل نقطة / مجموعة زمنية). تمت مقارنة البيانات باستخدام انحدار جيب التمام غير الخطي ، وتم تركيب منحنيات التعبير لجينات الساعة باستخدام حزمة R CircaCompare. يتم توفير قيم P كما هو موضح. الاختصارات: أ ، السعة. Bmal1 ، الدماغ والعضلات مثل أرنت 1 ؛ Cry1 ، منظم الساعة البيولوجية المشفرة 1 ؛ Cry2 ، منظم الساعة البيولوجية المشفرة 2 ؛ CTR ، مجموعة التحكم ؛ Dbp ، بروتين ملزم لموقع D ؛ م ، ميسور ؛ Nr1d1 ، فصيلة المستقبلات النووية 1 عضو المجموعة D 1 ؛ Nr1d2 ، فصيلة المستقبلات النووية 1 عضو المجموعة D 2 ؛ P ، المرحلة ؛ Per1 ، منظم الساعة البيولوجية 1 ؛ Per2 ، منظم الساعة البيولوجية للفترة 2 ؛ SD ، مجموعة الحرمان من النوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| جينات الساعة | بمال | دب | صرخة 1 | صرخة 2 | Nr1d1 | Nr1d2 | لكل1 | لكل2 | |
| الإيقاع | تحكم | ف < 0.05 | ف < 0.01 | ف < 0.001 | ف < 0.05 | ف < 0.001 | ف < 0.01 | ف < 0.001 | ف < 0.001 |
| الحرمان من النوم | ف < 0.05 | ف < 0.001 | ف < 0.001 | ف < 0.001 | ف < 0.001 | ف < 0.001 | ف < 0.001 | ف < 0.001 | |
| أكروفايز (وقت تسايتجيبر) | تحكم | 22 | 12 | 17 | 15 | 11 | 14 | 14 | 16 |
| الحرمان من النوم | 10 | 24 | 4 | 3 | 22 | 0 | 1 | 1 | |
| تقدير الميزور | تحكم | 0.933 | 2.242 | 1.136 | 1.171 | 1.799 | 1.41 | 1.289 | 1.033 |
| الحرمان من النوم | 0.826 | 2.101 | 1.094 | 1.155 | 1.756 | 1.399 | 0.999 | 0.888 | |
| تقدير السعة | تحكم | 0.099 | 0.746 | 0.305 | 0.131 | 0.494 | 0.314 | 0.294 | 0.341 |
| الحرمان من النوم | 0.108 | 0.866 | 0.342 | 0.168 | 0.503 | 0.323 | 0.388 | 0.305 | |
الجدول 1: وجود الإيقاع ، وتقدير الميزور ، وتقدير السعة ، والطور الأكروبي لجينات الساعة المختبرة في كل مجموعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد نماذج الفئران للحرمان من النوم ضرورية لدراسة آثار اضطراب النوم على الأمراض المختلفة ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية21 ، والحالات النفسية22 ، والاضطرابات العصبية23. من بين استراتيجيات الحرمان من النوم الحالية في الفئران ، فإن الأساليب الجسدية التي تنطوي على انقطاع متكرر للنوم على المدى القصير هي الأكثر استخداما5،7،12. تشمل هذه الأساليب الفيزيائية استخدام منصات المياه4 ، والمناولة اللطيفة5 ، وغرف القضبان المنزلقة6،24 ، والبراميل الدوارة7 ، أو الهزازات المدارية8،9،25،26.
للحث على الحرمان من النوم في الفئران بشكل فعال ، يجب أن توقظ الطرق المثالية الفئران بحافز غير مرهق. يجب أيضا أن يكون الجهاز المختار آليا ويمكن التحكم فيه بسهولة لضبط دورات الحرمان والراحة. من بين الطرق المذكورة ، تلبي غرفة الشريط المنزلقة معظم هذه المتطلبات. ومع ذلك ، فهي مكلفة وقد تضر الفئران في بعض الأحيان. طريقة أخرى فعالة ومرهقة إلى الحد الأدنى هي البروتوكول القائم على الهزاز المداري7،8،9،25 ، حيث يتم وضع قفص على شاكر مداري مختبري قياسي متصل بوحدة تحكم الوقت ، مما يؤدي إلى انقطاع النوم المتكرر. ومع ذلك ، عندما تتطلب تصميمات دراسة محددة تشغيل هزازات مدارية متعددة بالتوازي ، فقد تصبح التكلفة باهظة بالنسبة لبعض مجموعات البحث.
مستوحاة من طرق الاهتزاز المداري ، تقدم الدراسة الحالية بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لإنشاء معدات الحرمان من النوم القائمة على منصة الروك. تبلغ تكلفته حوالي عشر الهزازات المدارية المختبرية ، مما يجعل الوصول إليه أكثر سهولة. تم التحقق من صحة الجهاز الذي تم إدخاله ليكون فعالا في الحرمان من النوم في الفئران ، كما هو موضح في بيانات مراقبة EEG / EMG التي أظهرت تقصيرا كبيرا في مدة النوم وزيادة علامات الحرمان من النوم. بالإضافة إلى ذلك ، لم يغير هذا الجهاز القائم على منصة الروك بشكل كبير مستويات الكورتيكوستيرون في الدم في الفئران. بشكل عام ، قدمنا جهازا آليا جديدا للحرمان من النوم غير مكلف وفعال ومرهق للغاية ويمكن التحكم فيه.
على الرغم من مزاياه ، فإن البروتوكول الحالي له بعض القيود. أولا ، على عكس الأجهزة الجاهزة للاستخدام المتاحة تجاريا ، يتطلب جهاز الحرمان من النوم المقدم هنا تجميعا من قبل المجربين. ومع ذلك ، تم توفير بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة ورسوم توضيحية لتبسيط العملية. ثانيا ، ليست كل المواد المطلوبة لإنشاء الجهاز متاحة تجاريا ، وقد يكون من الضروري تخصيص بعض المواد بناء على المواصفات الواردة في هذا العمل. ثالثا ، قد تتعرض زجاجات المياه التقليدية المستخدمة مع منصة الروك للتسرب ، مما يستلزم استخدام زجاجات مياه مخصصة لمنع هذه المشكلة.
في الختام ، تقدم هذه الدراسة طريقة فعالة من حيث التكلفة وفعالة لإنشاء جهاز بديل للحث على الحرمان من النوم في الفئران الجماعية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين في التحقيق في الآثار والآليات الأساسية للحرمان من النوم على مجموعة واسعة من الحالات الصحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82230014 ، 81930007 ، 82270342) ، وبرنامج شنغهاي للقادة الأكاديميين المتميزين (18XD1402400) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (22QA1405400 ، 201409005200 ، 20YF1426100) ، برنامج شنغهاي بوجيانغ للمواهب (2020PJD030) ، SHWSRS (2023-62) ، مركز شنغهاي للبحوث السريرية للشيخوخة والطب (19MC1910500) ، وبرنامج الابتكار للدراسات العليا في كلية بنغبو الطبية (Byycxz21075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602002 | |
| Adenosine ELISA kit | Ruifan technology | RF8885 | |
| Animal cage | ZeYa tech | MJ2 | |
| Blood glucose meter | YuYue | 580 | |
| C57BL/6J Mice | JieSiJie Laboratory Animal | N/A | Age: 8-10 weeks |
| Connecting rod | ShengXiang Tech | N/A | Length: 20 cm |
| Cooling fan | LiMing | EFB0805VH | Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm |
| Corticosterone ELISA kit | Elabscience | E-OSEL-M0001 | |
| EEG/EMG recording and analysis system | Pinnacle Technology | 8200-K1-iSE3 | |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | |
| mosquito hemostats | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Motor and motor mount | MingYang | MY36GP-555 | Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Power brick adapter | MingYang | QiYe-0243 | Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m |
| qPCR commercial kit | Vazyme | Q711-02 | |
| qPCR measurement equipment | Roche | 480 | |
| Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm |
| Reverse RNA to cDNA commercial kit | Vazyme | R323-01 | |
| Screw and nut | Guwanji | N/A | Inner diameter: 6 mm, 12 mm |
| Screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Length: 300 mm |
| Slotted steel channels | Customized | N/A | Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm |
| Time contactor | LiXiang | DH48S-S | Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT |
| TRIzol | Vazyme | R401-01 |
References
- Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292 (2023).
- Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
- Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
- Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
- Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90 (2019).
- Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
- Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
- Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35 (2022).
- Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
- Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
- Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559 (2016).
- Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
- Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
- Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
- Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
- Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
- Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
- Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430 (2014).
- Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017 (2020).
- Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
- Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
- Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).
