Summary
O presente protocolo descreve um método para a criação de um dispositivo baseado em plataforma rocker de baixo custo, usado para induzir privação de sono em camundongos. Esse dispositivo tem se mostrado eficaz em causar interrupções nos padrões de sono evidenciados pelo eletroencefalograma (EEG), bem como induzir alterações metabólicas e moleculares associadas à privação de sono.
Abstract
A ruptura do ritmo circadiano refere-se à dessincronização entre o ambiente ou comportamento externo e o relógio molecular endógeno, que prejudica significativamente a saúde. A privação do sono é uma das causas mais comuns de interrupção do ritmo circadiano. Várias modalidades (por exemplo, plataformas na água, manuseio suave, câmaras de barra deslizante, tambores giratórios, agitadores orbitais, etc.) foram relatadas para induzir privação de sono em camundongos para investigar seus efeitos na saúde. O presente estudo introduz um método alternativo para a privação de sono em camundongos. Um dispositivo automatizado baseado em plataforma rocker foi projetado que é econômico e interrompe eficientemente o sono em ratos alojados em grupo em intervalos de tempo ajustáveis. Esse dispositivo induz alterações características de privação de sono com mínima resposta ao estresse. Consequentemente, este método pode ser útil para investigadores interessados em estudar os efeitos e mecanismos subjacentes da privação de sono na patogênese de múltiplas doenças. Além disso, oferece uma solução econômica, particularmente quando vários dispositivos de privação de sono são necessários para funcionar em paralelo.
Introduction
A ruptura do ritmo circadiano refere-se à dessincronização entre o ambiente ou comportamento externo e o relógio biológico endógeno. Uma das causas mais comuns de perturbação do ritmo circadiano é a privação de sono1. A privação do sono não só afeta negativamente a saúde humana, mas também aumenta significativamente o risco de muitas doenças, incluindo câncer2 e doenças cardiovasculares3. No entanto, os mecanismos subjacentes aos efeitos prejudiciais da privação de sono permanecem em grande parte desconhecidos, e o estabelecimento de modelos de privação de sono é essencial para melhorar nossa compreensão a esse respeito.
Vários métodos para privação de sono em camundongos têm sido relatados, como o uso de plataformas de água4, manuseio suave5, câmaras de barra deslizante6, tambores rotativos7 e protocolos de agitação em gaiola 5,8,9. As câmaras de barras deslizantes varrem automaticamente as barras pelo fundo da gaiola, forçando os ratos a caminhar sobre elas e permanecer acordados. Os protocolos de agitação da gaiola envolvem a colocação de gaiolas em agitadores orbitais de laboratório, resultando em uma interrupção eficiente do sono. Embora esses métodos sejam automáticos e eficazes, eles podem ser caros quando vários dispositivos são necessários para funcionar em paralelo, especialmente para desenhos de estudo específicos que envolvem um grande número de camundongos privados de sono necessários para o perfil genético circadiano. Por outro lado, plataformas de água e protocolos de manuseio suave são métodos mais baratos e simples comumente usados para induzir a privação de sono. No entanto, a plataforma de água não permite o controle automático de ciclos de privação-repouso pré-especificados10,11, e o manuseio suave requer vigilância contínua dos pesquisadores para perturbar o sono. Além disso, outras modalidades, como tambores rotativos, podem ser confundidas pelo isolamento social ou estresse12.
Inspirados no método baseado em agitador orbital, pretendemos introduzir um protocolo para estabelecer um dispositivo baseado em plataforma rocker para privação de sono em camundongos. Este método é barato, eficaz, minimamente estressante, controlável e automatizado. O protocolo atual nos permite criar um dispositivo baseado em plataforma rocker a um custo aproximadamente dez vezes mais barato do que o de agitadores orbitais, com base em nossa acessibilidade. Este dispositivo efetivamente interrompeu o sono em camundongos alojados em grupo e induziu mudanças características de privação de sono com resposta mínima ao estresse. Será especialmente útil para pesquisadores interessados em investigar os efeitos e mecanismos subjacentes da privação de sono na patogênese de múltiplas doenças, particularmente quando o estudo envolve privação de sono em múltiplos grupos em paralelo.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética de Bem-Estar Animal de Laboratório do Hospital Renji, Faculdade de Medicina, Shanghai Jiao Tong University. Camundongos C57BL/6J machos, com idade entre 8 e 10 semanas, foram utilizados no estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). As principais partes necessárias para estabelecer o dispositivo estão listadas na Figura 1A.
1. Preparo do dispositivo de privação de sono
- Fixe uma extremidade de um canal de aço ranhurado de 50 cm no meio de um canal de aço ranhurado de 40 cm com parafusos (ver Tabela de Materiais) para fazer uma estrutura em forma de T; repetir o processo e fazer duas dessas estruturas em forma de T (Figura 1B-a).
- Faça com que as duas estruturas em forma de T fiquem para cima paralelamente a 30 cm de distância e conecte os fundos das duas estruturas em forma de T com um cilindro de aço compatível com parafusos de 30 cm (consulte a Tabela de Materiais) usando parafusos (Figura 1B-b).
- Coloque uma plataforma retangular de aço (20 × 25 cm) (ver Tabela de Materiais) entre as duas estruturas em forma de T (Figura 1B-c).
NOTA: Se plataformas de retângulo de aço prontas para uso do tamanho especificado não estiverem disponíveis, pode-se fazer uma soldando aços planos de 2 mm de espessura. - Fixe cada extremidade de um cilindro de aço compatível com parafuso de 30 cm fixado na plataforma a dois rolamentos fixados em cada uma das estruturas em forma de T a 10 cm abaixo do topo (Figura 1B-d).
- Fixe um suporte de motor (ver Tabela de Materiais) em uma das estruturas em forma de T a 25 cm para baixo do topo usando parafusos (Figura 1B-e).
NOTA: Alternativamente, o adesivo de construção pode ser usado para fixar a montagem do motor na estrutura em forma de T em vez de tripulações. - Instale um motor (consulte Tabela de Materiais) no suporte do motor com parafusos (Figura 1B-f).
- Fixe um ventilador de resfriamento (consulte a Tabela de Materiais) com bandas autotravantes na estrutura em forma de T abaixo do motor (Figura 1B-g).
- Fixe a extremidade do rolamento de uma biela em um canto da plataforma voltado para o motor usando parafusos (Figura 1B-h).
- Fixe outra extremidade da biela no eixo do motor com parafusos (Figura 1B-i).
- Faça dois furos de 4 mm em cada um dos quatro cantos de um recipiente plástico ou gaiola de animais padrão (ver Tabela de Materiais) usando uma furadeira elétrica e faça dois furos de 4 mm e um furo inferior de 6 mm no lado esquerdo da gaiola (Figura 1B-j).
- Fixe a gaiola na plataforma do retângulo com bandas autotravantes através dos orifícios de canto (Figura 1B-k).
- Faça um furo de 5 mm na tampa de um tubo centrífugo de 50 mL com uma furadeira elétrica e pampe o orifício com um bocal longo equipado com uma válvula de esfera para evitar vazamento de água.
NOTA: O hidrogel seria uma opção alternativa para o abastecimento de água se a personalização de garrafas de água for difícil. - Fixe a garrafa de água personalizada no lado esquerdo da gaiola usando faixas autoblocantes através dos dois orifícios de 4 mm, com o bocal passando pelo orifício de 6 mm (Figura 1B-l).
- Conecte os fios elétricos de saída do adaptador de bloco de alimentação aos dois terminais do motor (Figura 1B-l).
NOTA: Não há nenhum requisito específico de polaridade para conectar os fios aos terminais do motor. - Conecte os fios elétricos de entrada do adaptador de bloco de alimentação ao contator de tempo (Figura 1B-m).
2. Indução da privação de sono
- Pressione os botões de sinal de mais à direita nas metades esquerda e direita do contator de tempo (consulte Tabela de Materiais), respectivamente, até que "M" apareça nos contadores mecânicos de ambos os lados (Figura 1C-a).
- Pressione os botões de sinal de adição do meio nas metades esquerda e direita do contator de tempo até que "5M" apareça nos contadores mecânicos de ambos os lados (Figura 1C-b).
- Pressione o botão de sinal de adição mais à esquerda na metade esquerda do contator de tempo até que "15M" apareça no contador mecânico esquerdo (Figura 1C-c).
NOTA: O contator de tempo ficará ligado por 15 min e desligado por 5 min em um modo cíclico. - Coloque ratos na gaiola com água e comida ad libitum.
- Forneça energia ao contator de tempo e ao ventilador de resfriamento.
NOTA: A plataforma agora estará balançando a 10 rpm. - Pese cada rato no Zeitgeber time 0 (ZT0) todos os dias.
NOTA: A luz está acesa das 8h (ZT0) às 20h (ZT12).
3. Teste oral de tolerância à glicose
- Medir os níveis de glicose em jejum em camundongos em jejum coletando sangue das veias da cauda.
- Injetar solução de glicose em cada rato (2 g/kg de peso corporal) por via intraperitoneal utilizando seringas de 1 ml.
- Coletar amostras de sangue através da veia da cauda e testar a glicose no sangue em 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a injeção de glicose, respectivamente.
- Coloque os ratos de volta na gaiola com a comida e água ad libitum após o teste.
4. Colheita dos tecidos cerebrais
- Decapitar os camundongos após anestesia adequada, expondo-os ao isoflurano (2%) por 3-5 min.
- Expor o crânio e fazer um corte vertical de 1 cm no crânio usando tesoura cirúrgica.
- Remova o crânio usando hemostáticos de mosquito (ver Tabela de Materiais) para expor o tecido cerebral.
- Mova suavemente todo o cérebro para fora da cavidade craniana usando pinças curvas.
NOTA: O tecido cerebral deve ser removido de acordo com as políticas locais. - Lavar o tecido cerebral com solução salina tamponada com fosfato frio (1x PBS, 4 °C).
- Congelar rapidamente o tecido cerebral intacto em nitrogênio líquido e transferir o tecido para -80 °C para armazenamento a longo prazo.
NOTA: Quando armazenado a -80°C, o tecido cerebral congelado pelo flash é estável por pelo menos 6 meses.
5. Detecção da expressão gênica pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
- Descongelar os tecidos cerebrais a 4 °C ou no gelo.
- Transferir o tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e extrair o RNA total usando o método baseado em TRIzol13.
- Medir a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais) após a extração de RNA.
- Realizar a transcrição reversa do RNA total (1 μg) em DNA complementar (cDNA) utilizando um kit comercial14.
- Medir os níveis de expressão gênica por meio da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real15.
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Representative Results
O dispositivo estabelecido para privação de sono em camundongos é mostrado na Figura 1D. No 7º dia após o início da privação de sono, a monitorização com eletroencefalograma (EEG) e eletromiografia (EMG)16 indicou que o dispositivo reduziu significativamente a duração do sono e aumentou a duração da vigília em camundongos (Figura 2A-D). Enquanto isso, o protocolo atual aumentou significativamente o acúmulo de adenosina e os níveis de RNAm de Homer1a no cérebro (Figura 2E,F), que são marcadores de privação de sono bem-sucedida17. Utilizando um kit de ELISA18, observamos que os níveis séricos de corticosterona não foram significativamente alterados pelo protocolo atual de privação de sono (Figura 2G). Após a privação de sono por 7 dias, o peso corporal e do timo diminuiu significativamente (Figura 3A-D), consistente com relatos anteriores19. Além disso, a tolerância à glicose foi significativamente prejudicada em camundongos após a privação de sono (Figura 3E,F). Para investigar as alterações na expressão do gene do relógio, tecidos cerebrais foram coletados a cada 4 h ao longo de um dia. Observamos que os padrões de expressão dos genes do relógio no cérebro foram significativamente alterados após a privação de sono (Figura 3G e Tabela 1), sugerindo ruptura do relógio molecular20.
Figura 1: Estabelecimento do dispositivo baseado na plataforma rocker. (A) Ilustrações retratando as principais peças necessárias para a montagem do dispositivo baseado em plataforma rocker. (B) Passos detalhados que demonstram a montagem do dispositivo de privação de sono. (C) Imagens exibindo configurações de parâmetros no contator de tempo. (D) Fotografia da câmara de agitação totalmente montada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação dos distúrbios do sono e dos níveis séricos de corticosterona em camundongos. (A) Diagrama esquemático ilustrando o registro de EEG/EMG em camundongos durante a privação de sono. (B) Registros representativos de EEG/EMG rastreados em camundongos. (C) Formas de onda representativas de EEG/EMG em camundongos durante a vigília, NREM e REM. (D) Porcentagem de duração de vigília, duração NREM e duração REM registradas em camundongos com interrupção do sono e camundongos controle (n = 4 camundongos/grupo). *P < 0,05, ***P < 0,001. A análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. Abreviações: CTR, grupo controle; NREM, Movimento ocular não rápido; REM, Movimento rápido dos olhos; DS, grupo privação de sono. (E) Níveis de RNAm de Homer1a em tecidos cerebrais medidos em camundongos com interrupção do sono e camundongos controle (n=4 camundongos/grupo). *P < 0,05, A análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. Abreviações: CTR, grupo controle; Homer1a, proteína de andaime Homer 1a; DS, grupo privação de sono. (F) Conteúdo de adenosina no tecido cerebral medido em camundongos com distúrbios do sono e camundongos controle (n=4 camundongos/grupo) usando um kit ELISA. *P < 0,05, A análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado em cada momento. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (G) Concentração sérica de corticosterona medida em camundongos com interrupção do sono e camundongos controle (n = 4 camundongos por ponto de tempo/grupo). A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância two-way. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Alterações fisiopatológicas após privação de sono em camundongos. (A) Imagens representativas mostrando os tamanhos dos camundongos nos grupos indicados. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (B) Mudanças no peso corporal após o início da privação de sono nos grupos indicados (n = 24 camundongos por grupo). **P < 0,001, a análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (C) Imagens representativas mostrando os tamanhos do timo nos grupos indicados. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (D) Comparação das relações entre peso do timo e peso corporal entre os dois grupos (n = 24 camundongos por grupo). **P < 0,001, a análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (E) Resultados do teste de tolerância à glicose intraperitoneal nos grupos indicados (n = 5 por grupo). *P < 0,01; **P < 0,001, a análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (F) Comparação da área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose intraperitoneal entre o grupo privação de sono e o grupo controle (n = 5 por grupo). **P < 0,001, a análise estatística foi realizada por meio do teste t não pareado. Abreviações: CTR, grupo controle; DS, grupo privação de sono. (G) Os padrões circadianos de expressão dos genes do relógio (Bmal1, Dbp, Cry1, Cry2, Nr1d1, Nr1d2, Per1 e Per2) nos tecidos cerebrais foram medidos no grupo privação de sono e no grupo controle (n = 4 camundongos por ponto/grupo de tempo). Os dados foram comparados usando regressão cossenórica não-linear, e as curvas de expressão dos genes do relógio foram ajustadas usando o pacote R CircaCompare. Os valores de p são fornecidos conforme indicado. Abreviaturas: A, amplitude; Bmal1, cérebro e músculo Arnt-like 1; Cry1, regulador circadiano criptocrômico 1; Cry2, regulador circadiano criptocrômico 2; CTR, grupo controle; Dbp, proteína ligadora do sítio D; M, mesor; Nr1d1, receptor nuclear subfamília 1 grupo D membro 1; Nr1d2, receptor nuclear subfamília 1 grupo D membro 2; P, fase; Per1, regulador circadiano de período 1; Per2, regulador circadiano de período 2; DS, grupo privação de sono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Genes do relógio | Bmal | PAD | Choro1 | Choro2 | Nr1d1 | Nr1d2 | Per1 | Per2 | |
| Ritmicidade | Controle | P < 0,05 | P < 0,01 | P < 0,001 | P < 0,05 | P < 0,001 | P < 0,01 | P < 0,001 | P < 0,001 |
| Privação de sono | P < 0,05 | P < 0,001 | P < 0,001 | P < 0,001 | P < 0,001 | P < 0,001 | P < 0,001 | P < 0,001 | |
| Acrofase (tempo Zeitgeber) | Controle | 22 | 12 | 17 | 15 | 11 | 14 | 14 | 16 |
| Privação de sono | 10 | 24 | 4 | 3 | 22 | 0 | 1 | 1 | |
| Estimativa de mesor | Controle | 0.933 | 2.242 | 1.136 | 1.171 | 1.799 | 1.41 | 1.289 | 1.033 |
| Privação de sono | 0.826 | 2.101 | 1.094 | 1.155 | 1.756 | 1.399 | 0.999 | 0.888 | |
| Estimativa de amplitude | Controle | 0.099 | 0.746 | 0.305 | 0.131 | 0.494 | 0.314 | 0.294 | 0.341 |
| Privação de sono | 0.108 | 0.866 | 0.342 | 0.168 | 0.503 | 0.323 | 0.388 | 0.305 | |
Tabela 1: Presença da ritmicidade, estimativa do mesor, estimativa da amplitude e acrofase para os genes do relógio testados em cada grupo.
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Discussion
Modelos murinos de privação de sono são essenciais para estudar os efeitos da interrupção do sono em várias doenças, incluindo doenças cardiovasculares21, condições psiquiátricas22 e distúrbios neurológicos23. Dentre as estratégias de privação de sono existentes em camundongos, as abordagens físicas que envolvem interrupção repetitiva do sono em curto prazo são as mais comumenteutilizadas5,7,12. Essas abordagens físicas incluem o uso de plataformas de água4, manuseio suave5, câmaras de barra deslizante 6,24, tambores rotativos7 ou agitadores orbitais 8,9,25,26.
Para induzir a privação de sono em camundongos de forma eficaz, métodos ideais devem despertar os camundongos com um estímulo não estressante. O dispositivo escolhido também deve ser automatizado e facilmente controlável para ajustar os ciclos privação-descanso. Dentre os métodos citados, a câmara de barra deslizante atende à maioria desses requisitos. No entanto, é caro e pode ocasionalmente prejudicar os ratos. Outro método eficaz e minimamente estressante é o protocolo baseado em agitador orbital 7,8,9,25, onde uma gaiola é colocada em um agitador orbital de laboratório padrão conectado a um controlador de tempo, levando à interrupção repetitiva do sono. No entanto, quando desenhos de estudo específicos exigem que vários agitadores orbitais funcionem em paralelo, o custo pode se tornar proibitivo para alguns grupos de pesquisa.
Inspirado nos métodos de agitação orbital, o presente estudo apresenta um protocolo passo-a-passo detalhado para o estabelecimento de um equipamento de privação de sono baseado em plataforma rocker. Seu custo é de aproximadamente um décimo dos agitadores orbitais de laboratório, tornando-o mais acessível. O dispositivo introduzido foi validado para ser eficaz na privação de sono em camundongos, como indicado por dados de monitoramento de EEG/EMG que mostraram duração do sono significativamente encurtada e marcadores de privação de sono aumentados. Além disso, esse dispositivo baseado em plataforma rocker não alterou significativamente os níveis séricos de corticosterona em camundongos. No geral, introduzimos um novo dispositivo automatizado de privação de sono que é barato, eficaz, minimamente estressante e controlável.
Apesar de suas vantagens, o protocolo atual apresenta algumas limitações. Em primeiro lugar, ao contrário dos dispositivos disponíveis comercialmente prontos para uso, o dispositivo de privação de sono aqui introduzido requer montagem pelos experimentadores. No entanto, foram fornecidos protocolos e ilustrações passo a passo detalhados para simplificar o processo. Em segundo lugar, nem todos os materiais necessários para o estabelecimento do dispositivo estão disponíveis comercialmente, e alguma personalização de materiais pode ser necessária com base nas especificações fornecidas neste trabalho. Em terceiro lugar, as garrafas de água convencionais usadas com a plataforma basculante podem sofrer vazamentos, exigindo o uso de garrafas de água personalizadas para evitar esse problema.
Em conclusão, este estudo apresenta um método custo-efetivo e eficiente para estabelecer um dispositivo alternativo para induzir privação de sono em camundongos alojados em grupo. Este protocolo pode ajudar os pesquisadores a investigar os efeitos e mecanismos subjacentes da privação de sono em uma ampla gama de condições de saúde.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82230014, 81930007, 82270342), do Programa de Líderes Acadêmicos Excepcionais de Xangai (18XD1402400), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), do Programa de Talentos de Xangai Pujiang (2020PJD030), SHWSRS (2023-62), do Centro de Pesquisa Clínica de Xangai para Envelhecimento e Medicina (19MC1910500) e do Programa de Inovação de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Bengbu (Byycxz21075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602002 | |
| Adenosine ELISA kit | Ruifan technology | RF8885 | |
| Animal cage | ZeYa tech | MJ2 | |
| Blood glucose meter | YuYue | 580 | |
| C57BL/6J Mice | JieSiJie Laboratory Animal | N/A | Age: 8-10 weeks |
| Connecting rod | ShengXiang Tech | N/A | Length: 20 cm |
| Cooling fan | LiMing | EFB0805VH | Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm |
| Corticosterone ELISA kit | Elabscience | E-OSEL-M0001 | |
| EEG/EMG recording and analysis system | Pinnacle Technology | 8200-K1-iSE3 | |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | |
| mosquito hemostats | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Motor and motor mount | MingYang | MY36GP-555 | Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Power brick adapter | MingYang | QiYe-0243 | Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m |
| qPCR commercial kit | Vazyme | Q711-02 | |
| qPCR measurement equipment | Roche | 480 | |
| Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm |
| Reverse RNA to cDNA commercial kit | Vazyme | R323-01 | |
| Screw and nut | Guwanji | N/A | Inner diameter: 6 mm, 12 mm |
| Screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Length: 300 mm |
| Slotted steel channels | Customized | N/A | Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm |
| Time contactor | LiXiang | DH48S-S | Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT |
| TRIzol | Vazyme | R401-01 |
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