Summary
Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.
Abstract
Het begrijpen van de dynamische kenmerken van de ultrastructuur van het celorganel, die niet alleen rijk is aan onbekende informatie, maar ook geavanceerd vanuit een driedimensionaal (3D) perspectief, is van cruciaal belang voor mechanistische studies. Elektronenmicroscopie (EM) biedt een goede beelddiepte en maakt de reconstructie van beeldstapels met hoge resolutie mogelijk om de ultrastructurele morfologie van cellulaire organellen te onderzoeken, zelfs op nanometerschaal; daarom wint 3D-reconstructie aan belang vanwege de onvergelijkbare voordelen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) biedt een high-throughput beeldacquisitietechnologie die het mogelijk maakt om grote structuren in 3D te reconstrueren vanuit hetzelfde interessegebied in opeenvolgende segmenten. Daarom wordt de toepassing van SEM in grootschalige 3D-reconstructie om de echte 3D-ultrastructuur van organellen te herstellen steeds gebruikelijker. In dit protocol stellen we een combinatie van seriële ultradunne sectie en 3D-reconstructietechnieken voor om mitochondriale cristae in pancreaskankercellen te bestuderen. De details van hoe deze technieken worden uitgevoerd, worden in dit protocol stapsgewijs beschreven, inclusief de osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) -methode, de seriële ultradunne sectiebeeldvorming en de visualisatieweergave.
Introduction
Mitochondriën zijn een van de belangrijkste organellen in de cel. Ze dienen als de centrale hub van cellulaire bio-energetica en metabolisme 1,2 en spelen een cruciale rol bij kanker3. Alvleesklierkanker (PC) is een van de moeilijkste kankers4 om te behandelen vanwege de snelle verspreiding en het hoge sterftecijfer. Mitochondriale disfunctie, die voornamelijk wordt veroorzaakt door veranderingen in de mitochondriale morfologie 3,5,6,7, is in verband gebracht met de ziektemechanismen die ten grondslag liggen aan PC8. Mitochondriën zijn ook zeer dynamisch, wat wordt weerspiegeld door de frequente en dynamische veranderingen in hun netwerkconnectiviteit en cristae-structuur9. De hervorm van de cristae-structuur kan rechtstreeks van invloed zijn op de mitochondriale functie en cellulaire toestand 10,11, die aanzienlijk worden veranderd tijdens tumorcelgroei, metastase en tumormicro-omgevingsveranderingen 12,13.
In de afgelopen jaren hebben wetenschappers dit organel bestudeerd met behulp van EM-observatie14,15,16,17; onderzoekers hebben bijvoorbeeld de mitochondriale dynamiek geanalyseerd met behulp van 3D-reconstructietechnieken 6,7,18,19. Het algemene concept en de methode voor de 3D-reconstructie van elektronenmicroscopiebeelden werden al in 1968 formeel vastgesteld20 en omvatten het combineren van elektronenmicroscopie, elektronendiffractie en computerbeeldverwerking om de T4-faagstaart te reconstrueren. Tot nu toe heeft de 3D-beeldvormingstechnologie voor elektronenmicroscopie aanzienlijke vooruitgang geboekt in termen van beeldresolutie 21, mate van automatisering 22 en verwerkingsvolume23 en is het op steeds grotere schaal gebruikt in biologisch onderzoek, van weefselniveau tot organel ultrastructuurniveau op nanometerschaal24. In de afgelopen jaren is elektronenmicroscopie 3D-beeldvorming ook een veelbelovende technologie geworden voor een breed scala aan toepassingen25,26,27.
De groeiende aandacht voor mitochondriale cristae illustreert vooral de essentiële vereisten voor ultrastructurele volumebeeldvorming. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is gebruikt om monsters te visualiseren die zijn verzameld op een koperen rooster (400 mesh)28, waarbij de elektronenbundel door de sectie gaat. Vanwege het beperkte bereik van het koperen rooster is het echter onmogelijk om continue segmenten van hetzelfde monster volledig in beeld te brengen29. Dit bemoeilijkt de studie van doelstructuren tijdens TEM-beeldvorming. Bovendien vertrouwt TEM op tijdrovende en foutgevoelige handmatige taken, waaronder het snijden en verzamelen van meerdere plakjes en deze sequentieel in beeld brengen21, zodat het niet is aangepast voor ultrastructurele reconstructies van monsters met een groot volume23. Op dit moment wordt de reconstructie met hoge resolutie van grootvolume-beeldvorming bereikt door het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, zoals de TEM-camera-array (TEMCA)30 of twee TEMCA-systemen van de tweede generatie (TEMCA2)31, die geautomatiseerde high-throughput imaging in korte tijd mogelijk maken. Dit type beeldvorming heeft echter niet het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en universeel is vanwege de vereiste voor aangepaste apparatuur.
In vergelijking met TEM verbetert de methode voor het automatisch genereren van duizenden seriële volumetrische beelden voor grote gebieden op basis van SEM 32,33 de efficiëntie en betrouwbaarheid van seriële beeldvorming en levert hogere z-resoluties34. Bijvoorbeeld, seriële block-face scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) en gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) hebben het beide mogelijk gemaakt om de 3D-reconstructie van ultrastructuur te bereiken met hoge snelheid, efficiëntie en resolutie35,36. Het is echter onvermijdelijk dat het blokoppervlak mechanisch wordt afgeschoren door het diamantmes van de SBF-SEM of door te frezen met de gefocusseerde ionenbundel van FIB-SEM33,37. Vanwege de destructiviteit van de twee methoden voor de monsters, is het niet mogelijk om dezelfde doelstructuur opnieuw te reconstrueren voor verdere analyse38,39,40. Bovendien hebben weinig studies geprobeerd om de 3D-organel-ultrastructuur van kankercellen te reconstrueren met behulp van EM om pathologische veranderingen te observeren12. Om deze redenen, om de pathologische mechanismen van kankercellen, zoals alvleesklierkankercellen, verder op te helderen, stellen we een nieuwe technologie voor voor de 3D-reconstructie van seriële sectiebeelden met behulp van een ultramicrotoom en een veldemissiescanning elektronenmicroscoop (FE-SEM) om de mitochondriale ultrastructuur op cristae-niveau te analyseren; Met deze technologie kunnen gegevens met een hoge resolutie worden verkregen met behulp van een efficiënte en toegankelijke methode. De seriële ultradunne secties gemaakt met behulp van een ultramicrotoom kunnen semi-permanent worden opgeslagen in een rasterbehuizing en meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, zelfs na enkele jaren41. FE-SEM wordt zeer gewaardeerd als een hulpmiddel in verschillende onderzoeksgebieden vanwege het vermogen om beeldvorming met hoge resolutie, hoge vergroting en veelzijdigheid te bieden42. In een poging om de fijne structuur van organellen in 3D weer te geven, kan de techniek voor het produceren van seriële 2D-beeldstapels met nuttige resolutie met behulp van terugverstrooide elektronen geproduceerd door FE-SEM 43,44 ook worden gebruikt om hoge doorvoer en multi-scale beeldvorming van doelgebieden of hun bijbehorende structuren te bereiken zonder speciale apparatuur 45. Het genereren van ladingartefacten heeft direct invloed op de kwaliteit van de verkregen afbeeldingen, dus het is vooral belangrijk om de verblijftijd kort te houden.
De huidige studie gaat dus dieper in op de experimentele procedures die in deze SEM-techniek worden gebruikt om de 3D-structuur van mitochondriale cristae46 te reconstrueren. In het bijzonder tonen we het proces dat is ontwikkeld om de semi-automatische segmentatie van mitochondriale regio's te bereiken en de 3D-reconstructie te digitaliseren met behulp van Amira-software, waarbij ook slice-monsters worden gemaakt met behulp van de conventionele OTO-monstervoorbereidingsmethode44,47, de sectieverzameling wordt voltooid met behulp van ultramicrotoomsegmentering en sequentiële 2D-gegevens worden verkregen door FE-SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materiaalvoorbereiding
- Kweek 2 x 106 Panc02-cellen in 12 ml DMEM-medium (10% foetaal runderserum en 100 U / ml penicilline-streptomycine) en houd gedurende 48 uur op 37 °C en 95% vochtigheid in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 95% lucht.
- Verzamel Panc02-cellen, centrifugeer gedurende 2 minuten op 28 x g en gooi het supernatant vervolgens weg. Zorg ervoor dat het monster de juiste grootte heeft (1 x 107 cellen), omdat anders de volgende fixatie- en uitdrogingsstappen niet goed werken.
- Voeg 1 ml 2,5% glutaaraldehyde toe als fixeermiddel om de verse Panc02-cellen in de 1,5 ml microcentrifugebuizen 's nachts bij 4 °C te fixeren.
OPMERKING: De monsters moeten gedurende 5 minuten bij 1.006 x g worden gecentrifugeerd in elk van de volgende stappen (stappen 1.3-1.11). - Zuig het fixeermiddel op en spoel de monsters tweemaal met 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en spoel vervolgens tweemaal met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk.
- Voeg 50 μL van een oplossing toe die 1% osmiumtetroxide (OsO 4) en 1,5% kaliumferrocyanide bevat in een verhouding van 1:1 bij4 °C gedurende 1 uur. Spoel vervolgens twee keer met 0,1 M PBS gedurende 10 minuten elke keer en spoel met ddH2O gedurende nog eens 10 minuten.
- Voeg 1 ml 1% thiocarbohydrazide (TCH) toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot 1 uur en spoel vervolgens vier keer gedurende 10 minuten af met ddH2O.
- Voeg 50 μL 1% OsO4 toe, fixeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel vervolgens vier keer gedurende 10 minuten met ddH2O.
- Voeg 's nachts 1 ml 2% uranylacetaat bij 4 °C toe en spoel vervolgens vier keer gedurende 10 minuten af met ddH2O.
- Voeg 1 ml Walton-oplossing (0,066 g loodnitraat opgelost in 10 ml 0,03 mol/l asparaginezuur-stockoplossing) toe bij 60 °C voor nog eens 1 uur incubatie.
- Spoel met ddH2O vier keer gedurende 10 minuten elke keer, en droog vervolgens uit in een gegradeerde alcoholreeks gedurende 10 minuten elke keer: 50% alcohol, 70% alcohol, 80% alcohol en 90% alcohol 1x, en 100% alcohol 2x. Droog vervolgens twee keer uit in 100% aceton gedurende 10 minuten elke keer. Gebruik 1 ml van elke oplossing voor de uitdroging.
- Meng 200 μL aceton met Pon 812 epoxyhars in een verhouding van 3:1, 1:1 en 1:3. Week het monster in hars bij kamertemperatuur gedurende respectievelijk 2 uur, 4 uur en 4 uur en neem vervolgens de 100% Pon 812 epoxyhars om 's nachts te impregneren.
OPMERKING: Bij het uitvoeren van de kleurings- en harsinbeddingsstappen is het belangrijk om in een zuurkast te werken, omdat dit giftige stoffen zijn. Bovendien moeten laboratoriumjassen en oplosmiddelbestendige handschoenen worden gedragen tijdens het experiment. - Plaats de monsters in een insluitvorm en plaats ze vervolgens gedurende 48 uur in een oven bij 60 °C om te polymeriseren. Gebruik een vlakke inbedding29 om het uiterlijk van hars rond het monster te verminderen. Dit vereenvoudigt de monsterinstallatie en vermindert de impact van het opladen van artefacten op de daaropvolgende beeldsegmentatie.
OPMERKING: Om vervolgens een horizontaal snijoppervlak te genereren, kan een kleine hoeveelheid hars in het malgat worden toegevoegd, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat het niet te vol raakt. - Bereid siliciumwafers door ze eerst te wassen en vervolgens gedurende 30 minuten te hydrofieliseren met een geconcentreerde H 2 SO4/H 2 O2-oplossing. Verzamel serieel gesneden reepjes met een dikte van 70 nm op de gehydrofileerde siliciumwafers met behulp van een ultramicrotoom en droog ze gedurende 10 minuten in een oven van 60 °C.
OPMERKING: Leg het plakje langzaam vast terwijl het plakje naar het oppervlak van de wafers drijft om verlies of vervorming van de plak te voorkomen.
2. Beeldacquisitie en driedimensionale reconstructie
- Voordat u een siliconen wafer op het podium monteert, wast u de secties drie keer met gedestilleerd water en droogt u ze aan de lucht. Knip een geleidende koolstoftape met de grootte van 1 cm x 0,5 cm en plak deze tussen de siliciumwafer en de SEM-monsterfase om de monsteropstelling te voltooien (figuur 2E).
- Stel de FE-SEM-versnellingsspanningsparameter in op 2 kV met een werkafstand van 4 mm (figuur 3B en tabel 1).
OPMERKING: Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en de ruis in het beeld te verminderen, moet u waar mogelijk bij lage vergrotingen observeren. Naarmate het veelvoud toeneemt, neemt het scanbereik van de SEM af, wat leidt tot een toename van de ladingaccumulatie op de afbeeldingen. - Klik op het H/L-pictogram in de bovenste menubalk. Oriënteer eerst bij lage vergroting het eerste gedeelte van de doelsegmentstroken en klik vervolgens nogmaals op de H / L-optie (afbeelding 3A) om over te schakelen naar de modus met hoge vergroting; Verzamel een geschikte afbeelding voor de structuur van belang door de helderheid, het contrast en de vergroting van de afbeelding aan te passen.
- Selecteer Projectweergave > Open Data en importeer de te analyseren afbeeldingsbestanden in de software.
- Lijn de afbeeldingen uit door te klikken op Segmenten uitlijnen > bewerken (afbeelding 4B) en pas de waarde van het intensiteitsbereik in de menubalk linksonder aan door de afbeeldingstransparantie te wijzigen. Gebruik hier een semi-automatische uitlijningsstrategie; Met name door middel van automatische uitlijning kunt u de foto's laten overlappen met een vorige afbeelding en vervolgens handmatige fijnafstelling uitvoeren.
OPMERKING: In dit werk werd tijdens het uitlijningsproces de vorige afbeelding als referentie gebruikt en werden de verplaatsings- en roteerbewerkingen gebruikt om de doelstructuur van de twee afbeeldingen maximaal te overlappen. Als u op Huidig segmentpaar uitlijnen klikt, kunt u de afbeeldingen automatisch uitlijnen, maar er kunnen misplaatsingen optreden. - Selecteer de module Subvolume extraheren en knip de uitgelijnde gegevenssets zodat ze passen bij de grootte van het overlappende gedeelte van de hele stapel.
- Selecteer onder de subsectie Segmentatie (afbeelding 4C) de optie Resample > Segmentation > Save. Kies de drempel van de toverstaf en de grootte van het penseel om het juiste bereik te selecteren. Gebruik ook hier een semi-automatische segmentatiemethode door eerst de Toverstaf te gebruiken om automatisch een geschikt groot gebied te selecteren en vervolgens het penseel te gebruiken om de details nauwkeurig te beschrijven.
OPMERKING: De toverstaf kan worden toegepast op segmentafbeeldingen op basis van de duidelijke verschillen in de pixelintensiteit tussen de structuur van belang en de omliggende structuren door de maskeringswaarde te wijzigen en de tekenlimietlijn te gebruiken. Het is niet in staat om de oplaadartefacten te onderscheiden die tijdens de beeldacquisitie worden gegenereerd. Daarom kan dit leiden tot onjuiste segmentatie voor de doelregio's. Het penseel kan worden gebruikt om handmatig te segmenteren om de biologische structuren nauwkeurig te reconstrueren. - Klik onder Segmentatie > selectie op het pictogram + om het geselecteerde gebied toe te voegen (Afbeelding 4C).
- Herhaal de bovenstaande stap (2.8) om dezelfde doelstructuur in verschillende afbeeldingen te selecteren totdat de selectie is voltooid voor het reconstrueren van de microstructuren van belang.
OPMERKING: Tijdens de mitochondriale remodelleringsprocessen moet de selectie van het doelobject worden uitgevoerd uit de afbeelding in het midden van een groep opeenvolgende afbeeldingen. Als het gewenste gebied is geselecteerd uit de eerste of laatste afbeelding, kan het reconstructieresultaat geen volledige 3D-visualisatie weergeven. - Nadat u de regionale segmentatie hebt voltooid, genereert u het afbeeldingsbestand volgens de beste resultaten voor de grootte van het object en de afbeeldingsresolutie. Klik op Crop Editor en voer vervolgens het nummer 6 in het vak Virtual Slider (Figuur 4C) in.
- Klik in het vervolgkeuzemenu aan de linkerkant met de rechtermuisknop op het grijze gebied onder de subsectie Project en selecteer Oppervlak genereren > Maken > Toepassen. Gebruik in het gegenereerde bestand de Surface View-module om de oppervlaktestructuur en 3D-weergave te maken.
3. Kwantificering
- Klik op Kleine vlekjes verwijderen > aanbrengen (Figuur 4D). Klik onder de subsectie Project met de rechtermuisknop op het grijze gebied en selecteer Labelanalyse > Toepassen (Afbeelding 4D).
- Pas de naam van de kolom aan en kies een metingsgroep. Selecteer Volume3d en Length3d in het vak Native Measurements.
- Klik op de knop Toepassen in de linkerbenedenhoek van het scherm. Kopieer de gegevens en grafiek in de statistische software, zoals GraphPad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens de celkweek (figuur 1A) verdeelden we de alvleesklierkankercellen eerst in een controlegroep gekweekt met volledig kweekmedium, een (1S,3R)-RSL348 (RSL3, een ferroptose-activator, 100 nM) groep, en een RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, een ferroptoseremmer, 100 nM) groep. Door de bovenstaande experimentele stappen verkreeg de scanning elektronenmicroscoop 38 (aanvullende figuur 1), 43 (aanvullende figuur 2) en 44 (aanvullende figuur 3) sequentiële beelden voor respectievelijk de controlegroep, RSL3-groep en remmergroep (RSL3 + Fer-1-groep). De beelden van 1.280 x 960 pixels zijn gemaakt met een 8.000-voudige vergroting (met een resolutie van 12,40 nm/pixel). Zowel rimpels als vervuiling in het celgebied werden niet waargenomen boven de secties. De elektronenmicroscoopfoto's konden de organellen, zoals de mitochondriën en het endoplasmatisch reticulum, in de cellen duidelijk onderscheiden (figuur 1E).
De observatie van de 2D-beelden door FE-SEM toonde aan dat in de controlegroep van kankercellen (figuur 5A) de mitochondriën over het cytoplasma waren verdeeld en dat de meeste bolvormig of ovaal en gelijkmatig mollig waren. Daarnaast was de relatief regelmatige, langgerekte cristae-architectuur duidelijk zichtbaar. Omgekeerd vertoonde in de RSL3-groep (figuur 5D) de meerderheid van de mitochondriën een krimpende morfologie, een toename van de membraandichtheid en een relatief vage cristaestructuur. Nadere inspectie van de SEM-foto's (figuur 5E) onthulde dat niet alle mitochondriale cristae degenereerden of verdwenen, omdat een relatief klein aantal cristae intact bleef. Vergeleken met de RSL3-groep, in de remmergroep, behielden de meeste mitochondriën de integrale structuur van mitochondriale cristae, en slechts een minderheid van de mitochondriale cristae-structuren was niet zichtbaar (figuur 5G).
Hoewel 2D-informatie verschillen in mitochondriale morfologie laat zien, kan het soms resulteren in een bevooroordeeld begrip van de gedetailleerde en echte 3D-structuur50,51. De cristae-structuren van de controlegroep onder de 3D-conditie (figuur 5C) waren consistent met de 2D-beelden, maar ze waren verschillend voor de RSL3-groep. Voor deze groep kon de aanwezigheid van complete mitochondriale cristae ook worden waargenomen in de 2D-beelden (figuur 5E), maar de mitochondriën onder 3D (figuur 5F) waren onregelmatig en over het algemeen vacuóloog in het midden. De remmergroep (figuur 5I) vertoonde diverse cristaevormen, waarbij slechts enkele mitochondriale cristae gelokaliseerde collaps vertoonden. Uit de resultaten van de RSL3-groep kan dus worden afgeleid dat alleen het gebruik van 2D-analyse kan leiden tot een eenzijdig begrip van de resultaten. De resultaten van 2D-afbeeldingen zijn bevooroordeeld in vergelijking met de resultaten die worden gepresenteerd bij het stapelen van een reeks afbeeldingen voor 3D-weergave, dus het is niet mogelijk om resultaten te generaliseren die alleen door 2D-informatie zijn geproduceerd. Om de effecten van RSL3 op mitochondriën objectiever aan te tonen, werden 3D-reconstructiegegevens gebruikt om mitochondriale veranderingen te kwantificeren en te meten52. Vergeleken met de controlegroep waren de lengte en het volume van de 3D-mitochondriën in de RSL3-groep significant afgenomen, maar de kwantificeringsresultaten van de remmergroep vielen tussen de resultaten van de andere twee groepen (figuur 5J,K). Deze kwantitatieve gegevens suggereren dat RSL3 kleinere en afgebroken mitochondriën produceert, en de toevoeging van remmers vermindert dit effect.
Zoals te zien is in figuur 6B en figuur 6C, werd vastgesteld dat de ferroptose-inductor RSL3 mitochondriale disfunctie veroorzaakte en het cellulaire metabolisme beïnvloedde door de mitochondriale morfologie 53,54 te veranderen en ferroptose uit te lokken, wat een alomtegenwoordige vorm van dynamische celdood kan vertegenwoordigen bij kankertherapie geïnduceerd doorRSL3 55.
Figuur 1: Algemene workflow voor de 3D-reconstructie van mitochondriën van alvleesklierkankercellen. Een algemene workflow voor de 3D-reconstructie-experimenten die in dit protocol worden beschreven, wordt gedemonstreerd. (A) Kweek van alvleesklierkankercellen. (B) Bereiding van het harsblok. (C) Verzameling van seriële secties met behulp van een ultramicrotoom. (D) Verwerving van 2D-beelden met behulp van een veldemissiescanning elektronenmicroscoop. (E) Positionering van de beoogde mitochondriën in de sequentiële SEM-beelden. (F) Analyse van de mitochondriën in 3D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een apparaat voor de plakstrips die doorlopende plakken op een gehydrofileerde siliciumwafer monteren. (A) Een verstelbare hoekmanipulator met tang voor het vasthouden van de wafer. (B) Frame van de waferhouder die naast het ultramicrotoom is geplaatst. (C) Plaatsing van de siliciumwafer in de blauwe sleuf met het diamantmes. (D) Een close-up die de positionele relatie tussen de siliciumwafer en het lemmet van het diamantmes laat zien. E) Een siliciumwafer met plakstroken die met geleidende koollijm aan het monsterstadium van de SEM zijn bevestigd. (F) Een close-up met het algemene overzicht van de seriële plakstroken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het proces van het instellen van de parameters en het verkrijgen van de afbeeldingen. (A) De menubalk van de FE-SEM (de pijl wijst naar de optie H/L). (B) Tabel met beeldvormingsparameters en -omstandigheden. (C) Overzicht van opeenvolgende 2D-beelden in drie groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Een stapsgewijze handleiding om mitochondriën in 3D te visualiseren met behulp van Amira. (A) Afbeeldingen importeren uit een specifieke map. (B) Afbeeldingsstapels uitlijnen volgens de doelstructuur. (C) Segmenteren en toevoegen van het interessegebied. (D) Het reconstrueren van de 3D-structuur en het toevoegen van de kwantificeringsgegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De 2D- en 3D-morfologie van mitochondriën in elke groep. De 2D-kankercelmorfologie van de controlegroep bij (A) 8.000-voudige vergroting en (B) 15.000-voudige vergroting. (C) Een 3D-weergave van de mitochondriale morfologie van de controlegroep. De 2D-kankercelmorfologie van de RSL3-groep bij (D) 8.000-voudige vergroting en (E) 15.000-voudige vergroting. (F) Een 3D-weergave van de mitochondriale morfologie van de RSL3-groep. De 2D-kankercelmorfologie van de RSL3 + Fer-1 (remmer) groep bij (G) 8.000-voudige vergroting en (H) 15.000-voudige vergroting. (I) Een 3D-weergave van de mitochondriale morfologie van de RSL3 + Fer-1 (remmer) groep. De kwantitatieve gegevens voor de (J) lengte en (K) het gemiddelde volume van de mitochondriën in elke groep. Significante verschillen worden aangegeven met sterretjes en werden berekend met behulp van de Student t-test (vs. controlegroep, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Verschillen in de mitochondriale morfologie van kankercellen op 2D- en 3D-niveaus. (A) De 2D-kankercelmorfologie van de RSL3-groep bij 8.000-voudige vergroting. (B) De 2D mitochondriale morfologie bij een hogere vergroting. (C) Een 3D-weergave van specifieke mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Beeldverwerkingsparameters | Voorwaarden |
| DataGrootte | 1280 × 960 |
| Pixelgrootte | 12.40234 |
| Versnellingsspanning | 2000 Volt |
| WorkingDistance | 3700μm |
| Emissiestroom | 13700 nA |
| Bundelstroom | 10μA |
| Stroombegrenzend diafragma | Nr. 2 rooster van FE-SEM |
| Verblijftijd | 32 μs/px |
| Aantal cellen | 107 |
| Afbeeldingsvolumes | 10×8×2,66μm, 212,8μm³ |
| 10×8×3,01μm, 240,8μm³ | |
| 10×8×3,08μm, 246,4μm³ |
Tabel 1: Samenvatting van de opnamecondities en de datasetparameters voor de beeldacquisitie.
Aanvullende figuur 1: Overzicht van beelden van 38 kankercelmicrosecties uit de controlegroep. Het afbeeldingsnummer van elke microsectie is van boven naar beneden gerangschikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Overzicht van beelden van 43 kankercelmicrosecties uit de RSL3-groep. Het afbeeldingsnummer van elke microsectie is van boven naar beneden gerangschikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Oweergave van beelden van 44 kankercelmicrosecties uit de RSL3 + Fer-1 (remmer) groep. Het afbeeldingsnummer van elke microsectie is van boven naar beneden gerangschikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode is een nuttige stapsgewijze handleiding voor het toepassen van de 3D-reconstructietechniek, waarbij elektronenmicroscopie en beeldverwerkingstechnologie worden toegepast op het stapelen en segmenteren van 2D-tomografische beelden die zijn gegenereerd uit seriële ultradunne secties. Dit protocol benadrukt een beperking van 2D-beelden die kunnen worden aangepakt door 3D-visualisatie van de organel-ultrastructuur, wat de voordelen heeft van een sterke reproduceerbaarheid van de structuren op een hoog resolutieniveau en een hogere nauwkeurigheid. Wat nog belangrijker is, deze 3D-visualisatie kan worden toegepast op tumorcellen om de studie van pathologische mechanismen eenvoudiger en betrouwbaarder te maken. Deze techniek werd in dit werk onderzocht voor het visualiseren van de stereoscopische structuren van mitochondriale cristae door drie sets seriële secties onder verschillende omstandigheden te vergelijken, waardoor de RSL3-geïnduceerde mitochondriale cristae-membraanafbraak die optreedt in kankercellen wordt gevalideerd56. Deze resultaten geven inzicht in het werkingsmechanisme van RSL3 als medicijn tegen alvleesklierkanker.
De verwerving van hoge resolutie 2D-beelden speelt een belangrijke rol in het proces van de 3D-reconstructie57 van mitochondriale cristae, en de beeldkwaliteit heeft direct invloed op de reconstructieresultaten 22,58. Daarom heeft deze methode ook enkele beperkingen, zoals de oplaadartefacten die worden gegenereerd in SEM-afbeeldingen59, wat op zijn beurt kan leiden tot onjuiste segmentatie van de doelstructuren. Dit probleem kan worden opgelost door de scantijd van de plak te verkorten, SEM uit te rusten met een brandpuntsladingscompensator34,60 en de OTO-methode te gebruiken, waarvoor het gebruik van TCH het monster geleidender kan maken voor elektronen door te kleuren met extra metalen 61. Vertrouwen op automatische beeldsegmentatie is meestal onnauwkeurig in termen van het bepalen van de reikwijdte van de structuur, terwijl handmatige segmentatie tijdrovend is58. Daarom kan, op basis van het snelle scanvoordeel van SEM om beeldverzameling te realiseren62, de semi-geautomatiseerde segmentatie in Amira-software worden gebruikt om efficiënte beeldvorming en reconstructie mogelijk te maken; het gebruik van Amira-software kan het resultaat ook nauwkeuriger en nauwkeuriger maken dan het gebruik van FIJI en MIB63. De belangrijkste stap in 3D-beeldvorming is het verkrijgen van ultradunne secties. Problemen zoals weglating, breuk en vervorming, die de beeldcontinuïteit beïnvloeden, treden vaak op tijdens het verzamelen van secties. Om problemen zoals het verlies en breken van plakjes op te lossen, gebruikten we gehydrofileerde siliciumwafers als ondersteuning voor het verzamelen van de plakstroken.
Hoewel SBF-SEM en FIB-SEM de vervorming van of defecten in de secties kunnen verminderen, hebben deze technieken een lage beeldsnelheid, vereisen ze dure instrumenten en zijn ze niet in staat om de structuur van belang opnieuw uit te vinden64,65,66. FIB-SEM mist systeemstabiliteit tijdens beeldvorming, terwijl SBF-SEM wordt gehinderd door gecompliceerde monstervoorbereidingsstappen en een vervelende workflow34. Onlangs is gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopische beeldvorming geleidelijk toegepast op de studie van de mitochondriale structuur. Deze methode monitort 3D real-time beelden van mitochondriale cristae in levende cellen door de constructie van sondes voor mitochondriale etikettering67. Fluorescerende kleurstofetikettering kan de veranderingsprocessen in cristaeduring mitochondriale fusie en splijting onthullen68. Levende cellen hebben echter een beperkte tolerantie voor intens licht, dus het is moeilijk om deze techniek te gebruiken in langdurige SOA-beeldvorming68. Bovendien wordt STED beperkt door de resolutie, beelddiepte en pixelnummer69.
In vergelijking met andere technieken maakt het gebruik van continue ultradunne secties in combinatie met 3D-reconstructietechnologie om organel-ultrastructuur vanuit een breed gezichtsveld te observeren niet alleen een beeldvorming met hoge doorvoer in korte tijd mogelijk, maar maakt het ook mogelijk om beelden met hoge resolutie van doelstructuren op discrete tijdente onderzoeken 21, waardoor de beeldvormingssnelheid en de reconstructieflexibiliteit worden verbeterd. Bovendien kunnen organelmorfologische veranderingen en ruimtelijke verbindingen met andere organellen verder worden onderzocht. Deze aspecten kunnen worden gekwantificeerd en de mechanismen van verandering kunnen nauwkeuriger worden onthuld door aangrenzende organellen te reconstrueren om hun positionele relaties weer te geven70,71. Deze technologie van 3D-reconstructie en seriële beeldvorming met behulp van Amira58 onthult de correlatie tussen ziekten en organel ultrastructurele veranderingen op nanoschaal72, is op grote schaal gebruikt in de geneeskunde, biologie en andere gebieden, en maakt de weg vrij voor de ontwikkeling van effectieve nieuwe therapieën73,74.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China subsidies (82274364, 81673607 en 81774011); evenals het Public Welfare Research Project van Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). We waarderen de geweldige hulp, technische ondersteuning en experimentele ondersteuning van het Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
References
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
- Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
- Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
- Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
- Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
- Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
- Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
- Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
- Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
- Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
- Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L.
- Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
- Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
- Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
- Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
- Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Kittelmann, M.
- Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
- Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
- Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
- Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
- Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
- Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
- Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
- Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
- Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
- Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
- Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
- Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
- Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
- Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
- Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
- Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
- Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
- Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
- Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
- Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
- Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
- Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
- Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
- Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
- Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
- Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
- Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
- Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
- Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A.
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
- Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
- Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
- Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
- Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).
