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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

一种可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

该协议描述了如何重建线粒体嵴以实现高精度，高分辨率和高通量的3D成像。

Abstract

了解细胞器超微结构的动态特征，不仅具有丰富的未知信息，而且从三维（3D）角度来看也很复杂，对于机制研究至关重要。电子显微镜（EM）具有良好的成像深度，并允许重建高分辨率图像堆栈，以研究细胞器的超微结构形态，即使在纳米尺度上也是如此;因此，3D重建因其无与伦比的优势而变得越来越重要。扫描电子显微镜（SEM）提供了一种高通量图像采集技术，允许在连续切片中从相同的感兴趣区域重建3D大型结构。因此，SEM在大规模三维重建中的应用，以恢复细胞器的真实三维超微结构变得越来越普遍。在该协议中，我们建议结合连续超薄切片和3D重建技术来研究胰腺癌细胞中的线粒体嵴。该协议以逐步的方式描述了如何执行这些技术的详细信息，包括锇 - 硫代碳酰肼 - 锇（OTO）方法，连续超薄切片成像和可视化显示。

Introduction

线粒体是细胞中最重要的细胞器之一。它们是细胞生物能量学和代谢的中心枢纽1,2，并在癌症中起着关键作用3。胰腺癌（PC）由于其快速扩散和高死亡率，是最难治疗的癌症之一4。线粒体功能障碍主要由线粒体形态变化3,5,6,7引起，与PC8的疾病机制有关。线粒体也是高度动态的，这反映在其网络连接和嵴结构的频繁和动态变化上9。嵴结构的重塑可直接影响线粒体功能和细胞状态10,11，在肿瘤细胞生长、转移和肿瘤微环境变化过程中发生显著改变12,13。

近年来，科学家们使用EM观察研究了这种细胞器14,15,16,17;例如，研究人员使用3D重建技术分析了线粒体动力学6,7,18,19。电子显微镜图像三维重建的一般概念和方法早在196820年就正式确立，涉及结合电子显微镜、电子衍射和计算机图像处理来重建T4噬菌体尾巴。到目前为止，电子显微镜3D成像技术在图像分辨率21、自动化程度22和处理体积23方面取得了重大进展，并且在生物学研究中的应用越来越广泛，从组织水平到纳米尺度的细胞器超微结构水平24。近年来，电子显微镜3D成像也成为一种前景广阔的技术25,26,27。

对线粒体嵴的日益关注特别说明了超微结构体积成像的基本要求。透射电子显微镜（TEM）已被用于可视化在铜网格（400目）28上收集的样品，电子束穿过该切片。然而，由于铜网格的范围有限，不可能对同一样品29的连续切片进行完全成像。这使得TEM成像过程中靶标结构的研究变得复杂。此外，TEM依赖于耗时且容易出错的手动任务，包括切割和收集多个切片并按顺序成像21，因此它不适用于大体积样品的超微结构重建23。目前，大体积样品成像的高分辨率重建是通过使用专用设备实现的，例如TEM相机阵列（TEMCA）30 或两个第二代TEMCA系统（TEMCA2）31，可以在短时间内实现自动化高通量成像。然而，由于需要定制设备，这种类型的成像不具有易于获得和通用的优点。

与TEM相比，基于SEM 32,33自动生成大面积连续体积图像的方法提高了串行成像的效率和可靠性，并提供了更高的z分辨率34。例如，连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）都使高速，高效和分辨率35,36的超微结构的3D重建成为可能。然而，不可避免地，通过SBF-SEM的金刚石刀或通过FIB-SEM33,37的聚焦离子束进行铣削，块表面被机械剃掉。由于两种方法对样品的破坏性，不可能再次重建相同的目标结构以进行进一步分析38,39,40。此外，很少有研究试图使用EM重建癌细胞的3D细胞器超微结构来观察病理变化12。基于这些原因，为了进一步阐明胰腺癌细胞等癌细胞的病理机制，我们提出了一种使用超薄切片机和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）在嵴水平分析线粒体超微结构的连续切片图像的3D重建新技术;通过这项技术，可以使用高效且可访问的方法获取高分辨率数据。使用超薄切片机制成的系列超薄切片可以半永久地存储在网格盒中，并在几年后多次重新成像41.FE-SEM因其能够提供高分辨率成像，高放大倍率和多功能性而作为各种研究领域的工具受到高度重视42。为了尝试以3D形式显示细胞器的精细结构，使用FE-SEM 43,44产生的背散射电子生成具有有用分辨率的串行2D图像堆栈的技术也可用于实现目标区域或其相关结构的高通量和多尺度成像，而无需特殊设备45.电荷伪影的产生直接影响采集图像的质量，因此保持较短的停留时间尤为重要。

因此，本研究详细阐述了该SEM技术中用于重建线粒体嵴46的3D结构的实验程序。具体来说，我们展示了使用Amira软件实现线粒体区域的半自动分割和数字化3D重建的过程，其中还包括使用传统的OTO标本制备方法44,47制作切片样品，使用超切片机切片完成切片收集，并通过FE-SEM获取顺序2D数据。

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Protocol

1. 材料准备

  1. 在12mL的DMEM培养基（10%胎牛血清和100U / mL青霉素 - 链霉素）中培养2 x 106 Panc02细胞，并在5%二氧化碳和95%空气的气氛中保持在37°C和95%湿度48小时。
  2. 收集Panc02细胞，以28× g 离心2分钟，然后弃去上清液。确保样品具有适当的大小（1 x 107 个细胞），否则，以下固定和脱水步骤将无法正常工作。
  3. 加入1mL的2.5%戊二醛作为固定剂，将新鲜的Panc02细胞固定在4°C的1.5mL微量离心管中过夜。
    注意：在以下每个步骤（步骤1.3-1.11）中，样品需要在1,006× g 下离心5分钟。
  4. 吸出固定剂，并用0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗样品两次，然后在室温下用双蒸水（ddH2O）冲洗两次，每次10分钟。
  5. 加入50μL含有1%四氧化锇（OsO 4）和1.5%亚铁氰化钾的溶液，比例为1：1，在4°C下1小时。然后，用0.1M PBS冲洗两次，每次10分钟，并用ddH2O冲洗10分钟。
  6. 加入 1 mL 的 1% 硫代碳酰肼 （TCH），在室温下孵育 30 分钟至 1 小时，然后用 ddH2O 冲洗四次，每次 10 分钟。
  7. 加入 50 μL 的 1% OsO4，在室温下固定 1 小时，然后用 ddH2O 冲洗四次，每次 10 分钟。
  8. 在4°C下加入1mL的2%乙酸铀酰过夜，然后用ddH2O冲洗四次，每次10分钟。
  9. 在60°C下加入1mL沃尔顿溶液（0.066g硝酸铅溶解在10mL的0.03mol/L天冬氨酸储备溶液中），再孵育1小时。
  10. 用ddH2O冲洗四次，每次10分钟，然后在分级酒精系列中脱水10分钟，每次：50%酒精，70%酒精，80%酒精和90%酒精1x和100%酒精2x。然后，在100%丙酮中脱水两次，每次10分钟。使用每种溶液 1 mL 进行脱水。
  11. 将 200 μL 丙酮与 Pon 812 环氧树脂以 3：1、1：1 和 1：3 的比例混合。将样品分别在室温下浸泡在树脂中2h，4h和4h，然后取100%Pon 812环氧树脂浸渍过夜。
    注意：执行染色和树脂包埋步骤时，重要的是在通风橱中操作，因为这些是有毒物质。此外，在实验过程中必须穿上实验室外套和耐溶剂手套。
  12. 将试样放入包埋模具中，然后置于60°C的烘箱中48小时聚合。使用平面包埋29 来减少样品周围树脂的外观。这简化了试样安装，并减少了充电伪影对后续图像分割的影响。
    注意： 为了随后生成水平切割表面，可以将少量树脂添加到模具孔中，注意不要过度填充。
  13. 首先清洗硅片，然后用浓缩的H2SO4 / H 2 O2溶液亲水30分钟来制备硅片。使用超薄切片机在亲水硅晶片上收集厚度为70nm的连续切片条，并在60°C烘箱中干燥10分钟。
    注意：当切片漂浮到晶圆表面时，请缓慢捕获切片，以防止切片丢失或变形。

2. 图像采集与三维重建

  1. 在将硅晶圆安装到载物台上之前，用蒸馏水清洗切片三次，然后风干。切割尺寸为1 cm x 0.5 cm的导电碳带，并将其粘贴在硅晶片和SEM样品台之间以完成样品设置（图2E）。
  2. 将 FE-SEM 加速电压参数设置为 2 kV，工作距离为 4 mm（图 3B 和 表 1）。
    注意：为了提高信噪比并减少图像中的噪声，请尽可能以低放大倍率进行观察。随着倍数的增加，SEM的扫描范围减小，导致图像上的电荷积累增加。
  3. 单击顶部菜单栏中的 H/L 图标 。首先，在低放大倍率下，定向目标切片条的第一部分，然后再次单击 H / L 选项（图3A）切换到高放大倍率模式;通过调整图像亮度、对比度和放大率，为感兴趣的结构收集适当的图像。
  4. 选择“ 项目视图”>“开放数据”，然后将要分析的图像文件导入软件。
  5. 通过单击对齐 切片>编辑 对齐图片（图 4B），并通过修改图像透明度来调整左下角菜单栏中的 强度范围 值。在这里，使用半自动对齐策略;具体来说，通过自动对齐，使图片与上一张图片重叠，然后进行手动微调。
    注意：在这项工作中，在对齐过程中，使用先前的图像作为参考，并利用移动和旋转操作来最大程度地重叠两个图像的目标结构。单击对齐 当前切片对 可以帮助自动对齐图像，但可能会出现错位。
  6. 选择 “提取子体积”模块，并裁剪对齐的数据集以适合整个堆栈重叠部分的大小。
  7. 在 分割 子部分（图 4C）下，选择重新 采样>分割>保存。选择 魔棒 的阈值和 画笔 工具的大小以选择正确的范围。这里再次采用半自动分割方法，首先使用 魔杖 自动选择合适的大面积区域，然后使用 画笔 准确描述细节。
    注意：通过更改遮罩值并使用绘制极限线，可以根据感兴趣结构与周围结构之间存在的像素强度的明显差异，将魔棒应用于分割图像。它无法区分图像采集过程中产生的充电伪影。因此，它可能会导致目标区域的分段不正确。画笔工具可用于手动分割以准确重建生物结构。
  8. 在 “分割>选择”下，单击 + 图标以添加所选区域（图 4C）。
  9. 重复上述步骤（2.8）以在不同的图像中选择相同的目标结构，直到选择完成以重建感兴趣的微观结构。
    注意：在线粒体重塑过程中，必须从一组连续图像中间的图片中执行目标对象的选择。如果从第一张或最后一张图片中选择所需区域，则重建结果将无法呈现完整的 3D 可视化。
  10. 完成区域分割后，根据对象大小和图片分辨率的最佳结果生成图像文件。单击 裁剪编辑器，然后在 虚拟滑块 框中输入数字 6（图 4C）。
  11. 在左侧的下拉菜单中，右键单击“ 项目 ”子部分下的灰色区域，然后选择“ 生成曲面>创建>应用”。在生成的文件中，使用曲面视图模块创建 曲面 结构和 3D 表示。

3. 量化

  1. 单击删除 小斑点>应用 （图 4D）。在 “项目 ”子部分下，右键单击灰色区域，然后选择 “标签分析”>“应用 ”（图 4D）。
  2. 自定义列的名称，然后选择度量值组。从“本机测量”框中选择“Volume3d 和 Length3d”。
  3. 单击屏幕左下角的 “应用 ”按钮。复制数据，并在统计软件（如GraphPad）中绘制图形。

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Representative Results

在细胞培养过程中（图1A），我们首先将胰腺癌细胞分为用完整培养基培养的对照组，（1S，3R）-RSL348（RSL3，铁死亡激活剂，100nM）组和RSL3（100nM）加铁抑素-149（Fer-1，铁死亡抑制剂，100nM）组。通过上述实验步骤，扫描电镜分别获取对照组、RSL3组和抑制剂组（RSL3+Fer-1组）的38张（补充图1）、43张（补充图2）和44张（补充图3）的连续图像。1,280 x 960像素的图像以8,000倍放大倍率（分辨率为12.40 nm /像素）捕获。在切片上方未观察到细胞区域的皱纹和污染。电子显微镜图片可以清楚地区分细胞中的细胞器，例如线粒体和内质网（图1E）。

FE-SEM对二维图像的观察表明，在癌细胞对照组（图5A）中，线粒体分布在整个细胞质中，并且大多数为球形或椭圆形，均匀丰满。此外，相对规则的细长嵴结构清晰可见。相反，在RSL3组中（图5D），大多数线粒体表现出收缩的形态，膜密度的增加和相对模糊的嵴结构。仔细检查SEM图片（图5E）发现并非所有线粒体嵴都退化或消失，因为相对较少的嵴保持完整。与RSL3组相比，抑制剂组大部分线粒体保持线粒体嵴的整体结构，只有少数线粒体嵴结构不明显（图5G）。

虽然2D信息显示线粒体形态的差异，但它有时会导致对详细和真实的3D结构的偏见理解50,51。3D条件下对照组的嵴结构（图5C）与2D图像一致，但RSL3组不同。对于该组，在2D图像中也可以观察到完整的线粒体嵴的存在（图5E），但是3D下的线粒体（图5F）是不规则的，通常在中间空泡。抑制剂组（图5I）表现出不同的嵴形状，只有一些线粒体嵴表现出局部塌陷。因此，从RSL3组的结果可以看出，仅使用2D分析可能会导致对结果的片面理解。与堆叠一组图像进行3D显示时显示的结果相比，2D图像的结果存在偏差，因此无法概括仅通过2D信息产生的结果。为了更客观地证明RSL3对线粒体的影响，使用3D重建数据来量化和测量线粒体改变52。与对照组相比，RSL3组3D线粒体的长度和体积明显降低，但抑制剂组的定量结果落在其他两组之间（图5J，K）。这些定量数据表明，RSL3产生更小和降解的线粒体，并且添加抑制剂会降低这种影响。

如图6B和图6C所示，确定铁死亡诱导剂RSL3通过改变线粒体形态53,54和引发铁死亡来引起线粒体功能障碍并影响细胞代谢，这可能代表RSL3诱导的癌症治疗中普遍存在的动态细胞死亡形式55。

Figure 1
图 1：胰腺癌细胞线粒体 3D 重建的一般工作流程。 演示了本协议中描述的3D重建实验的一般工作流程。（A）胰腺癌细胞的培养。（B）树脂块的制备。（C） 使用超薄切片机收集连续切片。（D） 使用场发射扫描电子显微镜采集二维图像。（E）在连续SEM图像中目标线粒体的定位。（F）3D线粒体分析。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：用于将连续切片安装到亲水硅晶片上的切片条的装置。 （A） 带镊子的可调节角度机械手，用于固定晶圆。（B） 放置在超薄切片机旁边的晶圆支架框架。（C） 将硅片定位在包含金刚石刀的蓝色槽中。（D）显示硅片和金刚石刀刀片之间位置关系的特写。（E） 带有切片条的硅片，用导电碳胶连接到 SEM 的样品台上。（F） 显示连续切片条总体概览的特写镜头。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3：设置参数和获取图像的过程。 （A） FE-SEM 的菜单栏（箭头指向 H/L 选项）。（二）成像参数和条件表。（C）三组连续二维图像的概述。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：使用 Amira 以 3D 方式可视化线粒体的分步指南。 （A） 从特定文件夹导入图像。（B）根据目标结构对齐图像堆栈。（C） 分割和添加感兴趣的区域。（D）重建3D结构并添加量化数据。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：每组中线粒体的 2D 和 3D 形态。 对照组在（A）8,000倍放大倍数和（B）15,000倍放大倍率下的2D癌细胞形态。（C）对照组线粒体形态的3D表示。RSL3组在（D）8,000倍放大倍数和（E）15,000倍放大倍率下的2D癌细胞形态。（F）RSL3组线粒体形态的3D表示。RSL3 + Fer-1（抑制剂）组在（G）8,000倍放大倍数和（H）15,000倍放大倍率下的2D癌细胞形态。（I）RSL3 + Fer-1（抑制剂）组线粒体形态的3D表示。每组中线粒体的（J）长度和（K）平均体积的定量数据。显著差异用星号表示，并使用学生的t检验（与对照组相比，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001）计算。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图 6：2D 和 3D 水平上癌细胞线粒体形态的差异。 （A）RSL3组在8,000倍放大倍率下的2D癌细胞形态。（B）较高放大倍率下的2D线粒体形态。（C）特定线粒体的3D表示。请点击此处查看此图的大图。

成像参数 条件
数据大小 1280×960
像素大小 12.40234
加速电压 2000 伏
工作距离 3700微米
发射电流 13700 nA
光束电流 10μA
限流孔径 FE-SEM 的 2 号光栅
停留时间 32 微秒/像素
单元格数 107
映像卷 10×8×2.66微米， 212.8微米立方米
10×8×3.01微米， 240.8微米立方米
10×8×3.08微米， 246.4微米立方米

表1：图像采集的记录条件和数据集参数摘要。

补充图1： 对照组38个癌细胞微切片的图像概述。 每个微切片的图像编号从上到下排列。 请点击此处下载此文件。

补充图2： 来自RSL3组的43个癌细胞微切片的图像概述。 每个微切片的图像编号从上到下排列。 请点击此处下载此文件。

补充图3：来自RSL3 + Fer-1（抑制剂）组的44个癌细胞微切片的图像的O视图。 每个微切片的图像编号从上到下排列。 请点击此处下载此文件。

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Discussion

这里介绍的方法是一个有用的分步指南，用于应用3D重建技术，该技术涉及将电子显微镜和图像处理技术应用于从连续超薄切片生成的2D断层扫描图像的堆叠和分割。该协议强调了可以通过细胞器超微结构的3D可视化来解决的2D图像的局限性，该图像具有高分辨率水平上结构的强可重复性和更高的精度的优点。更重要的是，这种3D可视化可以应用于肿瘤细胞，使病理机制的研究更加直接可靠。在这项工作中，通过比较不同条件下的三组连续切片来可视化线粒体嵴的立体结构，从而验证了RSL3诱导的癌细胞中发生的线粒体嵴膜降解56。这些结果为RSL3作为抗胰腺癌药物的作用机制提供了见解。

高分辨率2D图像的采集在线粒体嵴57的3D重建过程中起着重要作用，图像质量直接影响重建结果22,58。因此，该方法还具有一些局限性，例如在SEM图像59中产生的电荷伪影，这反过来又可能导致目标结构的错误分割。这个问题可以通过缩短切片扫描时间，为SEM配备焦点电荷补偿器34,60并使用OTO方法来解决，为此使用TCH可以通过用额外的金属染色使样品对电子更具导电性61。依靠自动图像分割在确定结构范围方面往往不准确，而手动分割则耗时58。因此，在SEM实现图像采集62的快速扫描优势的基础上，可以使用Amira软件中的半自动分割来实现高效的成像和重建;与使用斐济和 MIB63 相比，使用 Amira 软件还可以使结果更加准确和精确。3D成像的关键步骤是获取超薄切片。在剖面收集过程中，经常会出现影响图像连续性的遗漏、断裂和失真等问题。为了解决切片丢失和破损等问题，我们使用亲水硅片作为切片条收集的支撑。

尽管SBF-SEM和FIB-SEM可以减少切片的变形或缺陷，但这些技术成像速度慢，需要昂贵的仪器，并且无法对感兴趣的结构进行重新成像64,65,66。FIB-SEM在成像过程中缺乏系统稳定性，而SBF-SEM受到复杂的样品制备步骤和繁琐的工作流程的阻碍34。近年来，受激发射耗竭（STED）显微成像已逐渐应用于线粒体结构的研究。该方法通过构建用于线粒体标记的探针来监测活细胞中线粒体嵴的3D实时图像67。荧光染料标记可以揭示线粒体融合和裂变过程中嵴的变化过程68。然而，活细胞对强光的耐受性有限，因此很难在长期STED成像中使用该技术68。此外，STED 还受到其分辨率、成像深度和像素数69 的限制。

与其他技术相比，使用连续超薄切片结合3D重建技术从宽视野观察细胞器超微结构，不仅可以在短时间内进行高通量成像，还可以在离散时间检查目标结构的高分辨率图像21，从而提高成像速率和重建灵活性。此外，可以进一步检查细胞器形态变化和与其他细胞器的空间联系。这些方面可以量化，并且可以通过重建相邻细胞器来更准确地揭示变化机制以显示它们的位置关系70,71。这种使用Amira58的3D重建和连续切片成像技术揭示了疾病与细胞器超微结构变化在纳米尺度上的相关性72，已广泛应用于医学、生物学等领域，并为开发有效的新疗法73,74铺平了道路。

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Disclosures

作者声明不存在利益冲突。

Acknowledgments

本研究得到了浙江省自然科学基金资助（Z23H290001，LY19H280001）;国家自然科学基金（82274364、81673607、81774011）;以及湖州市科技基金公益研究项目（2021GY49,2018GZ24）。感谢浙江中医药大学中医科学院医学研究中心公共平台的大力帮助、技术支持和实验支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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癌症研究，第196期，胰腺癌细胞，线粒体，超微结构，3D重建，扫描电子显微镜（SEM），OTO标本制备
一种可视化胰腺癌细胞线粒体超微结构变化的三维技术
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

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