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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe cómo reconstruir las crestas mitocondriales para lograr imágenes 3D con alta precisión, alta resolución y alto rendimiento.

Abstract

Comprender las características dinámicas de la ultraestructura del orgánulo celular, que no solo es rica en información desconocida sino también sofisticada desde una perspectiva tridimensional (3D), es fundamental para los estudios mecanicistas. La microscopía electrónica (EM) ofrece una buena profundidad de imagen y permite la reconstrucción de pilas de imágenes de alta resolución para investigar la morfología ultraestructural de los orgánulos celulares incluso a escala nanométrica; por lo tanto, la reconstrucción 3D está ganando importancia debido a sus ventajas incomparables. La microscopía electrónica de barrido (SEM) proporciona una tecnología de adquisición de imágenes de alto rendimiento que permite reconstruir grandes estructuras en 3D a partir de la misma región de interés en cortes consecutivos. Por lo tanto, la aplicación de SEM en la reconstrucción 3D a gran escala para restaurar la verdadera ultraestructura 3D de los orgánulos es cada vez más común. En este protocolo, sugerimos una combinación de técnicas seriadas de corte ultrafino y reconstrucción 3D para estudiar las crestas mitocondriales en células de cáncer de páncreas. Los detalles de cómo se realizan estas técnicas se describen en este protocolo paso a paso, incluido el método de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (OTO), la obtención de imágenes de sección ultrafina en serie y la visualización de la pantalla.

Introduction

Las mitocondrias son uno de los orgánulos más importantes de la célula. Sirven como eje central de la bioenergética celular y el metabolismo 1,2 y desempeñan un papel fundamental en el cáncer3. El cáncer de páncreas (CP) es unode los cánceres más difíciles de tratar debido a su rápida propagación y alta tasa de mortalidad. La disfunción mitocondrial, que es causada principalmente por cambios en la morfología mitocondrial 3,5,6,7, se ha relacionado con los mecanismos de enfermedad subyacentes al PC8. Las mitocondrias también son altamente dinámicas, lo que se refleja en los cambios frecuentes y dinámicos en su conectividad de red y estructura de crestas9. La remodelación de la estructura de las crestas puede afectar directamente la función mitocondrial y el estado celular 10,11, que se alteran significativamente durante el crecimiento de las células tumorales, la metástasis y los cambios en el microambientetumoral 12,13.

En los últimos años, los científicos han estudiado este orgánulo mediante la observación EM14,15,16,17; por ejemplo, los investigadores han analizado la dinámica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrucción 3D 6,7,18,19. El concepto general y el método para la reconstrucción 3D de imágenes de microscopía electrónica se establecieron formalmente ya en 196820 e implicaron la combinación de microscopía electrónica, difracción de electrones y procesamiento de imágenes por computadora para reconstruir la cola del fago T4. Hasta ahora, la tecnología de imágenes 3D de microscopía electrónica ha logrado avances significativos en términos de resolución de imagen 21, grado de automatización22 y volumen de procesamiento 23 y se ha utilizado a una escala cada vez más amplia en la investigación biológica, desde el nivel de tejido hasta el nivel de ultraestructura de orgánulos a escala nanométrica24. En los últimos años, la microscopía electrónica en 3D también se ha convertido en una tecnología prometedora para una amplia gama de aplicaciones25,26,27.

La creciente atención a las crestas mitocondriales ilustra particularmente los requisitos esenciales para la obtención de imágenes de volumen ultraestructural. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se ha utilizado para visualizar muestras recogidas en una rejilla de cobre (malla 400)28, con el haz de electrones pasando a través de la sección. Sin embargo, debido al alcance limitado de la rejilla de cobre, es imposible obtener imágenes completas de cortes continuos de la misma muestra29. Esto complica el estudio de las estructuras diana durante la obtención de imágenes TEM. Además, la TEM se basa en tareas manuales que consumen mucho tiempo y son propensas a errores, como cortar y recoger múltiples cortes y obtener imágenes de ellas secuencialmente21, por lo que no está adaptado para reconstrucciones ultraestructurales de muestras de gran volumen23. En la actualidad, la reconstrucción de alta resolución de imágenes de muestras de gran volumen se logra mediante el uso de equipos especializados, como el conjunto de cámaras TEM (TEMCA)30 o dos sistemas TEMCA de segunda generación (TEMCA2)31, que permiten obtener imágenes automatizadas de alto rendimiento en poco tiempo. Sin embargo, este tipo de imágenes no tiene la ventaja de ser fácil de obtener y universal debido a la necesidad de equipos personalizados.

En comparación con TEM, el método para generar automáticamente miles de imágenes volumétricas en serie para grandes áreas basado en SEM 32,33 mejora la eficiencia y la fiabilidad de las imágenes en serie y ofrece resoluciones z más altas34. Por ejemplo, la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) y la microscopía electrónica de barrido por haz de iones focalizado (FIB-SEM) han hecho posible lograr la reconstrucción 3D de la ultraestructura con alta velocidad, eficiencia y resolución35,36. Sin embargo, es inevitable que la superficie del bloque se corte mecánicamente con la cuchilla de diamante del SBF-SEM o con el fresado con el haz de iones enfocado del FIB-SEM33,37. Debido a la destructividad de los dos métodos para las muestras, no es posible reconstruir la misma estructura objetivo para su posterior análisis38,39,40. Además, pocos estudios han intentado reconstruir la ultraestructura de orgánulos 3D de las células cancerosas utilizando EM para observar cambios patológicos12. Por estas razones, con el fin de dilucidar aún más los mecanismos patológicos de las células cancerosas, como las células de cáncer de páncreas, proponemos una tecnología novedosa para la reconstrucción 3D de imágenes de sección seriada utilizando un ultramicrótomo y un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (FE-SEM) para analizar la ultraestructura mitocondrial a nivel de crestas; Con esta tecnología, se pueden adquirir datos de alta resolución utilizando un método eficiente y accesible. Las secciones ultrafinas en serie realizadas con un ultramicrótomo pueden almacenarse de forma semipermanente en una caja de rejilla y volver a crear imágenes varias veces, incluso después de varios años41. FE-SEM es muy valorada como herramienta en diversos campos de investigación debido a su capacidad para proporcionar imágenes de alta resolución, gran aumento y versatilidad42. En un intento de mostrar la estructura fina de los orgánulos en 3D, la técnica para producir pilas de imágenes 2D en serie con una resolución útil utilizando electrones retrodispersados producidos por FE-SEM 43,44 también se puede utilizar para lograr imágenes de alto rendimiento y multiescala de las regiones objetivo o sus estructuras asociadas sin equipo especial 45. La generación de artefactos de carga afecta directamente a la calidad de las imágenes adquiridas, por lo que es especialmente importante que el tiempo de permanencia sea corto.

Por lo tanto, el presente estudio profundiza en los procedimientos experimentales empleados en esta técnica SEM para reconstruir la estructura 3D de las crestas mitocondriales46. En concreto, mostramos el proceso desarrollado para conseguir la segmentación semiautomática de las regiones mitocondriales y digitalizar la reconstrucción 3D mediante el software Amira, que también implica la realización de muestras de corte mediante el método convencional de preparación de muestras OTO44,47, la finalización de la recogida de cortes mediante corte ultramicroscópico y la adquisición de datos secuenciales 2D mediante FE-SEM.

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Protocol

1. Preparación del material

  1. Cultivar 2 x 106 células Panc02 en 12 mL de medio DMEM (10% de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), y mantener a 37 °C y 95% de humedad en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 48 h.
  2. Recoja las células de Panc02, centrifugue a 28 x g durante 2 minutos y luego deseche el sobrenadante. Asegúrese de que la muestra tenga un tamaño adecuado (1 x 107 células), ya que de lo contrario, los siguientes pasos de fijación y deshidratación no funcionarán bien.
  3. Añadir 1 mL de glutaraldehído al 2,5% como fijador para fijar las células frescas de Panc02 en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante la noche a 4 °C.
    NOTA: Las muestras deben centrifugarse a 1.006 x g durante 5 min en cada uno de los pasos siguientes (pasos 1.3-1.11).
  4. Aspire el fijador y enjuague las muestras dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M y, a continuación, enjuague dos veces con agua bidestilada (ddH2O) a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una.
  5. Añadir 50 μl de una solución que contenga tetróxido de osmio al 1% (OsO 4) y ferrocianuro potásico al 1,5% en una proporción de 1:1 a4 °C durante 1 h. A continuación, enjuague dos veces con 0,1 M PBS durante 10 minutos cada vez y enjuague con ddH2O durante otros 10 minutos.
  6. Agregue 1 ml de tiocarbohidrazida (TCH) al 1%, incube a temperatura ambiente durante 30 min a 1 h, y luego enjuague con ddH2O cuatro veces durante 10 min cada vez.
  7. Añadir 50 μL de OsO4 al 1%, fijar a temperatura ambiente durante 1 h y, a continuación, enjuagar con ddH2O cuatro veces durante 10 min cada vez.
  8. Añadir 1 ml de acetato de uranilo al 2% a 4 °C durante la noche y, a continuación, enjuagar con ddH2O cuatro veces durante 10 min cada vez.
  9. Añadir 1 ml de solución Walton (0,066 g de nitrato de plomo disuelto en 10 ml de solución madre de ácido aspártico 0,03 mol/L) a 60 °C durante 1 h adicional de incubación.
  10. Enjuague con ddH 2 O cuatro veces durante 10 minutos cada vez, y luego deshidrate en una serie de alcohol graduado durante 10 minutos cada vez: 50% de alcohol, 70% de alcohol, 80% de alcohol y 90% de alcohol 1 vez, y 100 % de alcohol2veces. Luego, deshidrata en acetona al 100% dos veces durante 10 minutos cada vez. Use 1 ml de cada solución para la deshidratación.
  11. Mezcle 200 μL de acetona con resina epoxi Pon 812 en una proporción de 3:1, 1:1 y 1:3. Remojar la muestra en resina a temperatura ambiente durante 2 h, 4 h y 4 h, respectivamente, y luego tomar la resina epoxi 100% Pon 812 para impregnar durante la noche.
    NOTA: Al realizar los pasos de tinción e inclusión de resina, es importante operar en una campana extractora, ya que se trata de sustancias tóxicas. Además, se deben usar batas de laboratorio y guantes resistentes a los solventes durante el experimento.
  12. Coloque las muestras en un molde de inclusión y luego colóquelas en un horno a 60 °C durante 48 h para polimerizar. Utilice la incrustación plana29 para reducir la apariencia de resina alrededor de la muestra. Esto simplifica la instalación de la muestra y disminuye el impacto de los artefactos de carga en la segmentación posterior de la imagen.
    NOTA: Para generar posteriormente una superficie de corte horizontal, se puede agregar una pequeña cantidad de resina en el orificio del molde, teniendo cuidado de no llenarlo en exceso.
  13. Prepare las obleas de silicio lavándolas primero y luego hidrófilándolas con una solución concentrada de H 2 SO4 / H 2 O2durante 30 min. Recoja tiras en rodajas en serie con un grosor de 70 nm en las obleas de silicio hidrofilizado utilizando un ultramicrótomo y séquelas en un horno a 60 °C durante 10 min.
    NOTA: Capture lentamente la rebanada a medida que la rebanada flota hacia la superficie de las obleas para evitar la pérdida o deformación de la rebanada.

2. Adquisición de imágenes y reconstrucción tridimensional

  1. Antes de montar una oblea de silicona en el escenario, lave las secciones con agua destilada tres veces y séquelas al aire. Corte una cinta de carbón conductora con un tamaño de 1 cm x 0,5 cm y péguela entre la oblea de silicio y la etapa de muestra SEM para completar la configuración de la muestra (Figura 2E).
  2. Ajuste el parámetro de tensión de aceleración FE-SEM a 2 kV con una distancia de trabajo de 4 mm (Figura 3B y Tabla 1).
    NOTA: Para mejorar la relación señal-ruido y reducir el ruido en la imagen, observe con aumentos bajos siempre que sea posible. A medida que aumenta el múltiplo, el rango de escaneo del SEM disminuye, lo que lleva a un aumento en la acumulación de carga en las imágenes.
  3. Haga clic en el icono H/L en la barra de menú superior. En primer lugar, con un aumento bajo, oriente la primera sección de las tiras de corte de destino y, a continuación, haga clic de nuevo en la opción H/L (Figura 3A) para cambiar al modo de aumento alto; Recopile una imagen adecuada para la estructura de interés ajustando el brillo, el contraste y la ampliación de la imagen.
  4. Seleccione Vista de proyecto > Datos abiertos e importe los archivos de imagen que se analizarán en el software.
  5. Alinee las imágenes haciendo clic en Alinear sectores > Editar (Figura 4B) y ajuste el valor de Rango de intensidad en la barra de menú inferior izquierda modificando la transparencia de la imagen. En este caso, utilice una estrategia de alineación semiautomática; Específicamente, a través de la alineación automática, haga que las imágenes se superpongan con una imagen anterior y, a continuación, realice un ajuste fino manual.
    NOTA: En este trabajo, durante el proceso de alineación, se utilizó la imagen anterior como referencia, y se utilizaron las operaciones de movimiento y rotación para superponer al máximo la estructura objetivo de las dos imágenes. Hacer clic en Alinear par de sectores actual puede ayudar a alinear las imágenes automáticamente, pero puede producirse un mal desplazamiento.
  6. Seleccione el módulo Extraer subvolumen y recorte los conjuntos de datos alineados para que se ajusten al tamaño de la parte superpuesta de toda la pila.
  7. En la subsección Segmentación (Figura 4C), seleccione Remuestrear > Segmentación > Guardar. Elija el umbral de la Varita mágica y el tamaño de la herramienta Pincel para seleccionar el rango correcto. Una vez más, adopte un método de segmentación semiautomático usando primero la Varita mágica para seleccionar automáticamente un área grande adecuada y luego use el Pincel para describir con precisión los detalles.
    NOTA: La varita mágica se puede aplicar para segmentar imágenes en función de las diferencias obvias en la intensidad de píxeles existentes entre la estructura de interés y las estructuras circundantes alterando el valor de Enmascaramiento y utilizando la Línea de límite de dibujo. Es incapaz de distinguir los artefactos de carga generados durante la adquisición de imágenes. Por lo tanto, puede dar lugar a una segmentación incorrecta para las regiones de destino. La herramienta Pincel se puede utilizar para segmentar manualmente y reconstruir con precisión las estructuras biológicas.
  8. En Segmentación > selección, haga clic en el icono + para agregar el área seleccionada (Figura 4C).
  9. Repita el paso anterior (2.8) para seleccionar la misma estructura objetivo en diferentes imágenes hasta que se complete la selección para reconstruir las microestructuras de interés.
    NOTA: Durante los procesos de remodelación mitocondrial, la selección del objeto objetivo debe realizarse a partir de la imagen en medio de un grupo de imágenes secuenciales. Si se selecciona el área requerida de la primera o la última imagen, el resultado de la reconstrucción no podrá presentar una visualización 3D completa.
  10. Después de completar la segmentación regional, genere el archivo de imagen de acuerdo con los mejores resultados para el tamaño del objeto y la resolución de la imagen. Haga clic en Editor de recorte y, a continuación, introduzca el número 6 en el cuadro Control deslizante virtual (Figura 4C).
  11. En el menú desplegable de la izquierda, haga clic con el botón derecho en el área gris de la subsección Proyecto y seleccione Generar superficie > Crear > Aplicar. En el archivo generado, utilice el módulo Vista de superficie para crear la estructura de superficie y la representación 3D.

3. Cuantificación

  1. Haga clic en Eliminar pequeñas manchas > aplicar (Figura 4D). En la subsección Proyecto , haga clic con el botón derecho en el área gris y seleccione Análisis de etiquetas > Aplicar (Figura 4D).
  2. Personalice el nombre de la columna y elija un grupo de medida. Seleccione Volume3d y Length3d en el cuadro Medidas nativas.
  3. Haga clic en el botón Aplicar en la esquina inferior izquierda de la pantalla. Copie los datos y grafique en el software estadístico, como GraphPad.

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Representative Results

Durante el cultivo celular (Figura 1A), primero dividimos las células de cáncer de páncreas en un grupo control cultivado con medio de cultivo completo, un grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activador de la ferroptosis, 100 nM) y un grupo RSL3 (100 nM) más ferrostatina-149 (Fer-1, un inhibidor de la ferroptosis, 100 nM). A través de los pasos experimentales anteriores, el microscopio electrónico de barrido adquirió 38 (Figura suplementaria 1), 43 (figura suplementaria 2) y 44 (figura suplementaria 3) imágenes secuenciales para el grupo de control, el grupo RSL3 y el grupo inhibidor (grupo RSL3 + Fer-1), respectivamente. Las imágenes de 1.280 x 960 píxeles se capturaron con un aumento de 8.000 veces (con una resolución de 12,40 nm/píxel). Tanto las arrugas como la contaminación en el área celular no se observaron por encima de las secciones. Las imágenes de microscopio electrónico pudieron distinguir claramente los orgánulos, como las mitocondrias y el retículo endoplásmico, en las células (Figura 1E).

La observación de las imágenes 2D por FE-SEM mostró que, en el grupo control de células cancerosas (Figura 5A), las mitocondrias estaban distribuidas por todo el citoplasma, y la mayoría de ellas eran esféricas u ovaladas y uniformemente regordetas. Además, la arquitectura de crestas alargadas y relativamente regulares era claramente visible. Por el contrario, en el grupo RSL3 (Figura 5D), la mayoría de las mitocondrias exhibieron una morfología cada vez más pequeña, un aumento en la densidad de la membrana y una estructura de crestas comparativamente vaga. Una inspección más detallada de las imágenes SEM (Figura 5E) reveló que no todas las crestas mitocondriales degeneraron o desaparecieron, ya que un número relativamente pequeño de crestas permaneció intacto. En comparación con el grupo RSL3, en el grupo inhibidor, la mayoría de las mitocondrias mantuvieron la estructura integral de las crestas mitocondriales, y solo una minoría de las estructuras de las crestas mitocondriales no fueron evidentes (Figura 5G).

Si bien la información 2D muestra diferencias en la morfología mitocondrial, a veces puede resultar en una comprensión sesgada de la estructura 3D detallada y real50,51. Las estructuras de crestas del grupo de control bajo la condición 3D (Figura 5C) fueron consistentes con las imágenes 2D, pero fueron diferentes para el grupo RSL3. Para este grupo, la presencia de crestas mitocondriales completas también se pudo observar en las imágenes 2D (Figura 5E), pero las mitocondrias en 3D (Figura 5F) eran irregulares y generalmente vacuoladas en el medio. El grupo inhibidor (Figura 5I) mostró diversas formas de crestas, con solo algunas crestas mitocondriales exhibiendo colapso localizado. Por lo tanto, a partir de los resultados del grupo RSL3, se puede ver que solo el uso del análisis 2D puede conducir a una comprensión unilateral de los resultados. Los resultados de las imágenes 2D están sesgados en comparación con los resultados presentados al apilar un conjunto de imágenes para su visualización en 3D, por lo que no es posible generalizar los resultados producidos solo a través de la información 2D. Para demostrar de manera más objetiva los efectos de RSL3 en las mitocondrias, se utilizaron datos de reconstrucción 3D para cuantificar y medir las alteraciones mitocondriales52. En comparación con el grupo control, la longitud y el volumen de las mitocondrias 3D en el grupo RSL3 disminuyeron significativamente, pero los resultados de cuantificación del grupo inhibidor se situaron entre los resultados de los otros dos grupos (Figura 5J,K). Estos datos cuantitativos sugieren que RSL3 produce mitocondrias más pequeñas y degradadas, y la adición de inhibidores reduce este efecto.

Como se muestra en la Figura 6B y la Figura 6C, se determinó que el inductor de ferroptosis RSL3 causó disfunción mitocondrial y afectó el metabolismo celular alterando la morfología mitocondrial 53,54 y provocando ferroptosis, lo que puede representar una forma ubicua de muerte celular dinámica en la terapia del cáncer inducida porRSL3 55.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo general para la reconstrucción 3D de mitocondrias de células de cáncer de páncreas. Se muestra un flujo de trabajo general para los experimentos de reconstrucción 3D descritos en este protocolo. (A) Cultivo de células de cáncer de páncreas. (B) Preparación del bloque de resina. (C) Recogida de secciones seriadas utilizando un ultramicrótomo. (D) Adquisición de imágenes 2D utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo. (E) Posicionamiento de las mitocondrias objetivo en las imágenes secuenciales SEM. (F) Análisis de las mitocondrias en 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Un dispositivo para el montaje de tiras de rebanadas de rebanadas continuas en una oblea de silicio hidrofilizado. (A) Un manipulador de ángulo ajustable con pinzas para sujetar la oblea. (B) Marco del soporte de la oblea colocado junto al ultramicrótomo. (C) Colocación de la oblea de silicio en la ranura azul que contiene el cuchillo de diamante. (D) Un primer plano que muestra la relación posicional entre la oblea de silicio y la hoja del cuchillo de diamante. (E) Una oblea de silicio con tiras de rodajas unidas a la etapa de muestra del SEM con pegamento de carbono conductor. (F) Un primer plano que muestra la descripción general de las tiras de corte en serie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Proceso de ajuste de los parámetros y adquisición de las imágenes. (A) La barra de menú del FE-SEM (la flecha apunta a la opción H/L). (B) Tabla de parámetros y condiciones de imagen. (C) Visión general de imágenes 2D consecutivas en tres grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Una guía paso a paso para visualizar mitocondrias en 3D usando Amira. (A) Importación de imágenes desde una carpeta específica. (B) Alinear las pilas de imágenes de acuerdo con la estructura de destino. (C) Segmentar y agregar la región de interés. (D) Reconstruir la estructura 3D y agregar los datos de cuantificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Morfología 2D y 3D de las mitocondrias en cada grupo. La morfología de las células cancerosas 2D del grupo de control con (A) un aumento de 8.000 veces y (B) un aumento de 15.000 veces. (C) Una representación en 3D de la morfología mitocondrial del grupo de control. La morfología de las células cancerosas 2D del grupo RSL3 con un aumento de (D) 8.000 veces y (E) un aumento de 15.000 veces. (F) Una representación en 3D de la morfología mitocondrial del grupo RSL3. La morfología de las células cancerosas 2D del grupo RSL3 + Fer-1 (inhibidor) con un aumento de (G) de 8.000 veces y (H) de 15.000 veces. (I) Una representación en 3D de la morfología mitocondrial del grupo RSL3 + Fer-1 (inhibidor). Los datos cuantitativos para la (J) longitud y (K) el volumen promedio de las mitocondrias en cada grupo. Las diferencias significativas se indican con asteriscos y se calcularon mediante la prueba t de Student (vs. grupo control, *p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Diferencias en la morfología mitocondrial de las células cancerosas a nivel 2D y 3D. (A) La morfología de las células cancerosas 2D del grupo RSL3 con un aumento de 8.000 veces. (B) La morfología mitocondrial 2D a un aumento mayor. (C) Una representación en 3D de mitocondrias específicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetros de imagen Condiciones
DataSize (Tamaño de datos) 1280 × 960
Tamaño de píxel 12.40234
AceleraciónVoltaje 2000 voltios
Distancia de trabajo 3700μm
EmisiónCorriente 13700 nA
Corriente del haz 10μA
Apertura limitadora de corriente Rejilla n.º 2 de FE-SEM
Tiempo de permanencia 32 μs/px
Número de celdas 107
Volúmenes con imágenes 10×8×2,66 μm, 212,8 μm³
10×8×3,01 μm, 240,8 μm³
10×8×3,08 μm, 246,4 μm³

Tabla 1: Resumen de las condiciones de grabación y los parámetros del conjunto de datos para la adquisición de imágenes.

Figura complementaria 1: Resumen de las imágenes de 38 microsecciones de células cancerosas del grupo de control. El número de imagen de cada microsección está ordenado de arriba a abajo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Resumen de las imágenes de 43 microsecciones de células cancerosas del grupo RSL3. El número de imagen de cada microsección está ordenado de arriba a abajo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Resumende imágenes de 44 microsecciones de células cancerosas del grupo RSL3 + Fer-1 (inhibidor). El número de imagen de cada microsección está ordenado de arriba a abajo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El método que aquí se presenta es una guía útil paso a paso para aplicar la técnica de reconstrucción 3D, que implica la aplicación de microscopía electrónica y tecnología de procesamiento de imágenes al apilamiento y segmentación de imágenes tomográficas 2D generadas a partir de secciones ultrafinas en serie. Este protocolo pone de relieve una limitación de las imágenes 2D que puede abordarse mediante la visualización en 3D de la ultraestructura del orgánulo, que tiene las ventajas de una fuerte reproducibilidad de las estructuras a un nivel de alta resolución y una mayor precisión. Y lo que es más importante, esta visualización en 3D puede aplicarse a las células tumorales para que el estudio de los mecanismos patológicos sea más sencillo y fiable. Esta técnica fue examinada en este trabajo para visualizar las estructuras estereoscópicas de las crestas mitocondriales mediante la comparación de tres conjuntos de secciones seriadas en diferentes condiciones, validando así la degradación de la membrana de las crestas mitocondriales inducida por RSL3 que ocurre en las células cancerosas56. Estos resultados proporcionan información sobre el mecanismo de acción de RSL3 como fármaco anticáncer de páncreas.

La adquisición de imágenes 2D de alta resolución juega un papel importante en el proceso de reconstrucción 3D57 de las crestas mitocondriales, y la calidad de la imagen afecta directamente a los resultados de la reconstrucción 22,58. Por lo tanto, este método también tiene algunas limitaciones, como los artefactos de carga generados en las imágenes SEM59, que, a su vez, pueden conducir a una segmentación incorrecta de las estructuras objetivo. Este problema puede resolverse acortando el tiempo de escaneo del corte, equipando a SEM con un compensador de carga focal34,60 y utilizando el método OTO, para el cual el uso de TCH puede hacer que la muestra sea más conductora de los electrones mediante la tinción con metales adicionales 61. Confiar en la segmentación automática de imágenes tiende a ser inexacto en términos de determinar el alcance de la estructura, mientras que la segmentación manual requiere mucho tiempo58. Por lo tanto, sobre la base de la ventaja de escaneo rápido de SEM para realizar la recopilación de imágenes62, la segmentación semiautomatizada en el software Amira se puede utilizar para permitir imágenes y reconstrucción eficientes; El uso del software Amira también puede hacer que el resultado sea más exacto y preciso que el uso de FIJI y MIB63. El paso clave en la obtención de imágenes 3D es la adquisición de secciones ultrafinas. Problemas como la omisión, la fractura y la distorsión, que afectan a la continuidad de la imagen, suelen producirse durante la recopilación de secciones. Con el fin de resolver problemas como la pérdida y rotura de lonchas, utilizamos obleas de silicio hidrofilizado como soporte para la recogida de las tiras de lonchas.

A pesar de que SBF-SEM y FIB-SEM podrían reducir la deformación o defectos en las secciones, estas técnicas tienen una velocidad de imagen lenta, requieren instrumentos costosos y son incapaces de recrear la estructura de interés64,65,66. El FIB-SEM carece de estabilidad del sistema durante la obtención de imágenes, mientras que el SBF-SEM se ve obstaculizado por complicados pasos de preparación de muestras y un tedioso flujo de trabajo34. Recientemente, las imágenes microscópicas de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) se han aplicado gradualmente al estudio de la estructura mitocondrial. Este método monitorea imágenes 3D en tiempo real de las crestas mitocondriales en células vivas a través de la construcción de sondas para el marcaje mitocondrial67. El marcaje con colorantes fluorescentes puede revelar los procesos de cambio en la cristae durante la fusión mitocondrial y la fisión68. Sin embargo, las células vivas tienen una tolerancia limitada a la luz intensa, por lo que es difícil utilizar esta técnica en la obtención de imágenes de ETS a largo plazo68. Además, STED está restringido por su resolución, profundidad de imagen y número de píxel69.

En comparación con otras técnicas, el uso de secciones ultrafinas continuas combinadas con la tecnología de reconstrucción 3D para observar la ultraestructura de los orgánulos desde un amplio campo de visión no solo permite obtener imágenes de alto rendimiento en un corto período de tiempo, sino que también permite el examen de imágenes de alta resolución de las estructuras diana en momentos discretos21, mejorando así la velocidad de obtención de imágenes y la flexibilidad de la reconstrucción. Además, los cambios morfológicos de los orgánulos y las conexiones espaciales con otros orgánulos pueden examinarse más a fondo. Estos aspectos pueden ser cuantificados, y los mecanismos de cambio pueden ser revelados con mayor precisión mediante la reconstrucción de orgánulos adyacentes para mostrar sus relaciones posicionales70,71. Esta tecnología de reconstrucción 3D e imágenes en serie utilizando Amira58 revela la correlación entre las enfermedades y los cambios ultraestructurales de los orgánulos a nanoescala72, ha sido ampliamente utilizada en medicina, biología y otros campos, y allana el camino para el desarrollo de nuevas terapias efectivas73,74.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274364, 81673607 y 81774011); así como el Proyecto de Investigación de Bienestar Público de la Subvención de Ciencia y Tecnología de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos la gran ayuda, el soporte técnico y el apoyo experimental de la Plataforma Pública del Centro de Investigación Médica, la Academia de Ciencias Médicas Chinas, la Universidad Médica China de Zhejiang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

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Cancer Research Número 196 Células de cáncer de páncreas mitocondrias ultraestructura reconstrucción 3D microscopía electrónica de barrido (SEM) preparación de muestras OTO
Una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong,… More

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

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