Summary

Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Abstract

La transcription des gènes spatio-temporels est étroitement régulée par des éléments régulateurs distaux, tels que les amplificateurs et les silencieux, qui s’appuient sur la proximité physique avec leurs promoteurs de gènes cibles pour contrôler la transcription. Bien que ces éléments régulateurs soient faciles à identifier, leurs gènes cibles sont difficiles à prédire, car la plupart d’entre eux sont spécifiques au type cellulaire et peuvent être séparés par des centaines de kilobases dans la séquence linéaire du génome, ignorant d’autres gènes non cibles. Depuis plusieurs années, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est l’étalon-or pour l’association d’éléments régulateurs distaux à leurs gènes cibles. Cependant, PCHi-C repose sur la disponibilité de millions de cellules, interdisant l’étude de populations de cellules rares telles que celles couramment obtenues à partir de tissus primaires. Pour surmonter cette limitation, une méthode de capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une méthode rentable et personnalisable pour identifier le répertoire d’éléments régulateurs distaux contrôlant chaque gène du génome, a été développée. liCHi-C s’appuie sur un cadre expérimental et informatique similaire à celui de PCHi-C, mais en utilisant des changements de tube minimes, en modifiant la concentration et les volumes de réactifs, et en échangeant ou en éliminant les étapes, il tient compte des pertes de matériaux minimales lors de la construction de la bibliothèque. Collectivement, liCHi-C permet l’étude de la régulation des gènes et de l’organisation spatio-temporelle du génome dans le contexte de la biologie du développement et de la fonction cellulaire.

Introduction

L’expression génique temporelle entraîne la différenciation cellulaire et, en fin de compte, le développement de l’organisme, et son altération est étroitement liée à une large pléthore de maladies 1,2,3,4,5. La transcription des gènes est finement régulée par l’action d’éléments régulateurs, qui peuvent être classés comme proximaux (promoteurs de gènes) et distaux (par exemple, amplificateurs ou silencieux), ces derniers étant fréquemment situés loin de leurs gènes cibles et interagissent physiquement avec eux par boucle de chromatine pour moduler l’expression des gènes 6,7,8.

L’identification des régions régulatrices distales dans le génome est une question qui fait l’objet d’un large consensus, puisque ces régions abritent des modifications spécifiques des histones 9,10,11 et contiennent des motifs spécifiques de reconnaissance des facteurs de transcription, agissant comme des plates-formes de recrutement pour eux12,13,14. En outre, dans le cas des amplificateurs et des super-amplificateurs 15,16, ils ont également une faible occupation des nucléosomes 17,18 et sont transcrits en ARNe non codants 19,20.

Néanmoins, les gènes cibles de chaque élément régulateur distal sont plus difficiles à prédire. Le plus souvent, les interactions entre les éléments régulateurs distaux et leurs cibles sont de type cellulaire et spécifiques au stimulus 21,22, couvrent des centaines de kilobases, reliant d’autres gènes dans n’importe quelle direction 23,24,25, et peuvent même être situées à l’intérieur des régions introniques de leur gène cible ou d’autres gènes non intermédiaires 26,27. De plus, les éléments régulateurs distaux peuvent également contrôler plus d’un gène à la fois, et vice versa28,29. Cette complexité positionnelle empêche de déterminer les associations régulatrices entre eux et, par conséquent, la plupart des cibles de chaque élément régulateur dans chaque type de cellule restent inconnues.

Au cours des dernières années, il y a eu un essor significatif dans le développement des techniques de capture de conformation chromosomique (3C) pour étudier les interactions de la chromatine. Le plus utilisé d’entre eux, Hi-C, permet de générer une carte de toutes les interactions entre chaque fragment du génome d’une cellule30. Cependant, pour détecter des interactions significatives au niveau des fragments de restriction, Hi-C s’appuie sur le séquençage ultra-profond, interdisant son utilisation pour étudier systématiquement le paysage régulateur des gènes individuels. Pour surmonter cette limitation économique, plusieurs techniques 3C basées sur l’enrichissement ont émergé, telles que-PET31, HiChIP 32 et son homologue à faible intrant HiCuT33. Ces techniques dépendent de l’utilisation d’anticorps pour enrichir les interactions à l’échelle du génome médiées par une protéine spécifique. Néanmoins, la caractéristique unique de ces techniques 3C est également le fléau de leur application; Les utilisateurs comptent sur la disponibilité d’anticorps de haute qualité pour la protéine d’intérêt et ne peuvent pas comparer les conditions dans lesquelles la liaison de la protéine est dynamique.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est une autre technique 3C basée sur l’enrichissement qui contourne ces limitations34,35. En utilisant un système d’enrichissement de sonde à ARN biotinylé, PCHi-C est capable de générer des bibliothèques à haute résolution à l’échelle du génome de régions génomiques interagissant avec 28 650 promoteurs de gènes annotés par des humains ou 27 595 souris, également connus sous le nom d’interactome promoteur. Cette approche permet de détecter des interactions significatives à longue distance à la résolution au niveau des fragments de restriction des promoteurs actifs et inactifs, et de comparer de manière robuste les interactomes promoteurs entre n’importe quelle condition, indépendamment de la dynamique des modifications des histones ou de la liaison aux protéines. Le PCHi-C a été largement utilisé ces dernières années pour identifier les réorganisations d’interactomes promoteurs au cours de la différenciation cellulaire 36,37, identifier le mécanisme d’action des facteurs de transcription38,39 et découvrir de nouveaux gènes et voies potentiels dérégulés dans la maladie par des variantes non codantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, aux côtés de nouvelles mutations non codantes49,50. En outre, en modifiant simplement le système de capture, cette technique peut être personnalisée en fonction de la question biologique pour interroger n’importe quel interactome (par exemple, l’interactome amplificateur 51 ou l’interactome d’une collection d’altérations non codantes41,52).

Cependant, PCHi-C s’appuie sur un minimum de 20 millions de cellules pour effectuer la technique, ce qui empêche l’étude de populations cellulaires rares telles que celles souvent utilisées en biologie du développement et dans les applications cliniques. Pour cette raison, nous avons développé le Capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une nouvelle méthode rentable et personnalisable basée sur le cadre expérimental de PCHi-C pour générer des interactomes promoteurs à haute résolution avec une entrée cellulaire faible. En effectuant l’expérience avec un minimum de changements de tube, en échangeant ou en éliminant des étapes du protocole PCHi-C original, en réduisant considérablement les volumes de réaction et en modifiant les concentrations de réactifs, la complexité de la bibliothèque est maximisée et il est possible de générer des bibliothèques de haute qualité avec aussi peu que 50 000 cellules53.

Le Hi-C à capture à faible entrée (liCHi-C) a été comparé au PCHi-C et utilisé pour élucider le recâblage de l’interactome promoteur au cours de la différenciation des cellules hématopoïétiques humaines, découvrir de nouveaux gènes et voies potentiellement associés à la maladie dérégulés par des altérations non codantes et détecter des anomalies chromosomiques53. Le protocole étape par étape et les différents contrôles de qualité à travers la technique sont détaillés ici jusqu’à la génération finale des bibliothèques et leur analyse informatique.

Protocol

Pour assurer une perte matérielle minimale, (1) travailler avec des tubes et des embouts à faible liaison d’ADN (voir le tableau des matériaux), (2) placer des réactifs sur la paroi du tube au lieu d’introduire l’embout à l’intérieur de l’échantillon et, (3) si possible, mélanger l’échantillon par inversion au lieu de pipeter l’échantillon de haut en bas, et tourner vers le bas par la suite pour récupérer l’échantillon. 1. Fixation cellulaire…

Representative Results

liCHi-C offre la possibilité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs de haute qualité et à résolution à l’échelle du génome avec aussi peu que 50 000 cellules53. Ceci est accompli en supprimant les étapes inutiles du protocole d’origine des volumes de réaction et l’utilisation de produits en plastique à faible liaison de l’ADN tout au long du protocole. Il s’agit notamment de la purification du phénol après réticulation, de l’élimination de la biotine,…

Discussion

liCHi-C offre la capacité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs haute résolution en utilisant un cadre expérimental similaire à celui de PCHi-C, mais avec un nombre de cellules considérablement réduit. Ceci est grandement réalisé en éliminant les étapes inutiles, telles que la purification du phénol et l’élimination de la biotine. Dans le protocole57 classique de ligature dans le noyau et sa technique dérivée ultérieure PCHi-C, la biotine est retirée des fra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les autres membres du laboratoire Javierre pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous remercions le programme CERCA, la Generalitat de Catalunya et la Fondation Josep Carreras pour leur soutien institutionnel. Ce travail a été financé par FEDER/Ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (RTI2018-094788-A-I00), l’Association européenne d’hématologie (4823998) et l’Association espagnole contre le cancer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ est financé par le projet Junior Leader de la Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR est financé par une bourse AGAUR FI (2019FI-B00017) et LT-D est financé par une bourse FPI (PRE2019-088005). Nous remercions le programme de doctorat en biochimie et biologie moléculaire de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour son soutien. Aucun des bailleurs de fonds n’a été impliqué à aucun moment dans la conception expérimentale ou la rédaction du manuscrit.

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

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