JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/65316
, , , ,
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

Summary

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C’nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Abstract

Spatiotemporal gen transkripsiyonu, transkripsiyonu kontrol etmek için hedef gen promotörleriyle fiziksel yakınlığa dayanan arttırıcılar ve susturucular gibi distal düzenleyici unsurlar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu düzenleyici elementlerin tanımlanması kolay olsa da, hedef genlerinin tahmin edilmesi zordur, çünkü çoğu hücre tipine özgüdür ve doğrusal genom dizisinde yüzlerce kilobaz ile ayrılabilir, diğer hedef olmayan genleri atlayabilir. Birkaç yıldır, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), distal düzenleyici elementlerin hedef genleriyle ilişkilendirilmesinde altın standart olmuştur. Bununla birlikte, PCHi-C, milyonlarca hücrenin mevcudiyetine dayanır ve birincil dokulardan yaygın olarak elde edilenler gibi nadir hücre popülasyonlarının incelenmesini yasaklar. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, genomun her genini kontrol eden distal düzenleyici elemanların repertuarını tanımlamak için uygun maliyetli ve özelleştirilebilir bir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C (liCHi-C) geliştirilmiştir. liCHi-C, PCHi-C ile benzer bir deneysel ve hesaplamalı çerçeveye dayanır, ancak minimum tüp değişiklikleri kullanarak, reaktif konsantrasyonunu ve hacimlerini değiştirerek ve adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, kütüphane inşaatı sırasında minimum malzeme kaybını hesaba katar. Toplu olarak, liCHi-C, gelişimsel biyoloji ve hücresel fonksiyon bağlamında gen regülasyonu ve mekansal temporal genom organizasyonunun incelenmesini sağlar.

Introduction

Zamansal gen ekspresyonu, hücre farklılaşmasını ve nihayetinde organizma gelişimini yönlendirir ve değişimi, çok sayıda hastalıkla yakından ilişkilidir 1,2,3,4,5. Gen transkripsiyonu, proksimal (yani gen promotörleri) ve distal (örneğin, arttırıcılar veya susturucular) olarak sınıflandırılabilen düzenleyici elementlerin etkisiyle ince bir şekilde düzenlenir, ikincisi sıklıkla hedef genlerinden uzakta bulunur ve gen ekspresyonunu modüle etmek için kromatin döngüsü yoluyla fiziksel olarak onlarla etkileşime girer 6,7,8.

Genomdaki distal düzenleyici bölgelerin tanımlanması üzerinde yaygın olarak anlaşmaya varılan bir konudur, çünkü bu bölgeler spesifik histon modifikasyonları 9,10,11 barındırır ve spesifik transkripsiyon faktörü tanıma motifleri içerir ve bunlar için işe alım platformları görevi görür12,13,14. Ayrıca, arttırıcılar ve süper arttırıcılar15,16 durumunda, aynı zamanda düşük nükleozom doluluk 17,18’e sahiptirler ve kodlamayan eRNA’lara 19,20’ye kopyalanırlar.

Bununla birlikte, her distal düzenleyici elementin hedef genlerini tahmin etmek daha zordur. Çoğu zaman, distal düzenleyici elementler ve hedefleri arasındaki etkileşimler hücre tipi ve uyarana özgü 21,22’dir, yüzlerce kilobaza yayılır, diğer genler üzerinde herhangi bir yönde köprü oluşturur 23,24,25 ve hatta hedef genlerinin veya diğer müdahale etmeyen genlerin intronik bölgelerinde bile bulunabilir26,27. Ayrıca, distal düzenleyici elementler aynı anda birden fazla geni kontrol edebilir ve bunun tersi de 28,29’dur. Bu konumsal karmaşıklık, aralarındaki düzenleyici ilişkileri belirlemeyi engeller ve bu nedenle, her düzenleyici elemanın her hücre tipindeki hedeflerinin çoğu bilinmemektedir.

Son yıllarda, kromatin etkileşimlerini incelemek için kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniklerinin geliştirilmesinde önemli bir patlama olmuştur. Bunlardan en yaygın kullanılanı olan Hi-C, bir hücrenin genomunun her bir parçası arasındaki tüm etkileşimlerin bir haritasını oluşturmaya izin verir30. Bununla birlikte, kısıtlama parçası düzeyinde önemli etkileşimleri tespit etmek için Hi-C, ultra derin dizilemeye dayanır ve bireysel genlerin düzenleyici manzarasını rutin olarak incelemek için kullanımını yasaklar. Bu ekonomik sınırlamanın üstesinden gelmek için, ChIA-PET 31, HiChIP32 ve düşük girdili muadili HiCuT33 gibi çeşitli zenginleştirme tabanlı3C teknikleri ortaya çıkmıştır. Bu teknikler, belirli bir proteinin aracılık ettiği genom çapında etkileşimleri zenginleştirmek için antikorların kullanılmasına bağlıdır. Bununla birlikte, bu 3C tekniklerinin benzersiz özelliği aynı zamanda uygulamalarının felaketidir; Kullanıcılar, ilgilendikleri protein için yüksek kaliteli antikorların mevcudiyetine güvenir ve proteinin bağlanmasının dinamik olduğu koşulları karşılaştıramazlar.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), bu sınırlamaları aşan başka bir zenginleştirme tabanlı 3C tekniğidir34,35. PCHi-C, biyotinillenmiş bir RNA probu zenginleştirme sistemi kullanarak, promotör interaktom olarak da bilinen 28.650 insan veya 27.595 fare açıklamalı gen promotörü ile etkileşime giren genomik bölgelerin genom çapında yüksek çözünürlüklü kütüphanelerini üretebilir. Bu yaklaşım, hem aktif hem de inaktif promotörlerin kısıtlama fragmanı seviyesi çözünürlüğünde önemli uzun menzilli etkileşimleri tespit etmeyi ve histon modifikasyonlarının veya protein bağlanmasının dinamiklerinden bağımsız olarak herhangi bir durum arasındaki promotör etkileşimlerini sağlam bir şekilde karşılaştırmayı sağlar. PCHi-C, hücre farklılaşması sırasında promotör interaktom reorganizasyonlarını tanımlamak için son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır 36,37, transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizmasını tanımlamak38,39 ve kodlamayan varyantlar tarafından hastalıkta deregüle edilmiş yeni potansiyel genler ve yollar keşfetmek 40,41,42,43,44,45,46,47,48, yeni sürücü kodlamayan mutasyonlarla birlikte49,50. Ayrıca, sadece yakalama sistemini değiştirerek, bu teknik herhangi bir interaktomu sorgulamak için biyolojik soruya göre özelleştirilebilir (örneğin, arttırıcı interaktom 51 veya kodlamayan değişiklikler koleksiyonunun interaktomu41,52).

Bununla birlikte, PCHi-C, tekniği gerçekleştirmek için en az 20 milyon hücreye dayanır, bu da gelişimsel biyoloji ve klinik uygulamalarda sıklıkla kullanılanlar gibi kıt hücre popülasyonlarının incelenmesini önler. Bu nedenle, düşük hücre girdili yüksek çözünürlüklü promotör etkileşimleri oluşturmak için PCHi-C’nin deneysel çerçevesine dayanan yeni bir uygun maliyetli ve özelleştirilebilir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C’yi (liCHi-C) geliştirdik. Deneyi minimum tüp değişiklikleriyle gerçekleştirerek, orijinal PCHi-C protokolünden adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, reaksiyon hacimlerini önemli ölçüde azaltarak ve reaktif konsantrasyonlarını değiştirerek, kütüphane karmaşıklığı en üst düzeye çıkarılır ve 50.000 hücreye kadar yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturmak mümkündür53.

Düşük girdili Yakalama Hi-C (liCHi-C), PCHi-C ile karşılaştırılmıştır ve insan hematopoetik hücre farklılaşması sırasında promotör interaktom yeniden kablolamasını aydınlatmak, kodlamayan değişikliklerle deregüle edilen potansiyel yeni hastalıkla ilişkili genleri ve yolları keşfetmek ve kromozomal anormallikleri tespit etmek için kullanılmıştır53. Adım adım protokol ve teknik aracılığıyla farklı kalite kontrolleri, kütüphanelerin son nesline ve hesaplamalı analizlerine kadar burada detaylandırılmıştır.

Protocol

Minimum malzeme kaybını sağlamak için, (1) DNA düşük bağlayıcı tüpler ve uçlarla çalışın (bakınız Malzeme Tablosu), (2) ucu numunenin içine sokmak yerine tüp duvarına reaktifler yerleştirin ve (3) mümkünse, numuneyi yukarı ve aşağı pipetlemek yerine ters çevirerek numuneyi karıştırın ve numuneyi geri kazanmak için daha sonra aşağı doğru döndürün. 1. Hücre fiksasyonu Süspansiyonda büyüyen hücreler5…

Representative Results

liCHi-C, 50.000 hücreye kadar yüksek kaliteli ve çözünürlüklü genom çapında promotör interaktom kütüphaneleri üretme imkanı sunar53. Bu, reaksiyon hacimlerinin ciddi şekilde azaltılması ve protokol boyunca DNA düşük bağlayıcı plastik eşyaların kullanılmasının yanı sıra, önemli malzeme kayıplarının meydana geldiği orijinal protokolden gereksiz adımların kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. Bunlar, çapraz bağlamadan sonra fenol saflaştırma, biyotin giderim…

Discussion

liCHi-C, PCHi-C’lerden benzer bir deneysel çerçeve kullanarak yüksek çözünürlüklü promotör interaktom kütüphaneleri oluşturma yeteneği sunar, ancak büyük ölçüde azaltılmış hücre sayısına sahiptir. Bu, fenol saflaştırma ve biyotin giderimi gibi gereksiz adımları ortadan kaldırarak büyük ölçüde elde edilir. Klasik çekirdek içi ligasyon Hi-C protokolü57 ve sonraki türev tekniği PCHi-C’de, biyotin, daha sonra bilgilendirici olmayan DNA parçalarının aşağı ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Javierre laboratuvarından diğer üyelere makale hakkındaki geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Kurumsal destek için CERCA Programı’na, Generalitat de Catalunya’ya ve Josep Carreras Vakfı’na teşekkür ederiz. Bu çalışma FEDER/İspanya Bilim ve İnovasyon Bakanlığı (RTI2018-094788-A-I00), Avrupa Hematoloji Derneği (4823998) ve İspanyol Kansere Karşı Birliği (AECC) LABAE21981JAVI tarafından finanse edilmiştir. BMJ, La Caixa Bankacılık Vakfı Genç Lider projesi (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR bir AGAUR FI bursu (2019FI-B00017) ve LT-D bir FPI Bursu (PRE2019-088005) tarafından finanse edilmektedir. Universitat Autònoma de Barcelona biyokimya ve moleküler biyoloji doktora programına destekleri için teşekkür ederiz. Fon verenlerin hiçbiri deneysel tasarımın veya el yazması yazımının herhangi bir noktasında yer almadı.

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies – Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies –
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Tags

Keywords: LiCHi-CChromatin InteractionsGenome OrganizationGene RegulationRegulatory ElementsPromoter-centricSpatiotemporalRare Cell PopulationsLow InputCapture Hi-C
check_url/65316?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image