Summary
Dit protocol beschrijft het oogsten en visualiseren van elasmoid schubben van zebravissen tijdens in vivo regeneratie. Bovendien wordt de ex vivo cultuur van deze schubben tot 7 dagen na de oogst gepresenteerd.
Abstract
Skeletaandoeningen zijn vaak complex in hun etiologie en treffen miljoenen mensen over de hele wereld. Door de vergrijzing van de bevolking is er behoefte aan nieuwe therapieën die de druk op de gezondheidszorgstelsels kunnen verlichten. Omdat deze ziekten complex zijn, is het moeilijk en duur om de pathofysiologie van botten nauwkeurig te modelleren in een laboratoriumomgeving. De uitdaging voor het veld is om een kosteneffectief, biologisch relevant platform op te zetten voor het modelleren van botziekten dat kan worden gebruikt om potentiële therapeutische verbindingen te testen. Een dergelijk platform zou idealiter dynamische visualisatie mogelijk moeten maken van het celgedrag van botopbouwende osteoblasten en botafbrekende osteoclasten die in hun gemineraliseerde matrixomgeving werken. Zebravissen worden steeds vaker als model gebruikt vanwege de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen, waaronder transgene reporterlijnen, en het feit dat sommige skeletweefsels (inclusief de schubben) doorschijnend blijven tot volwassenheid, waardoor dynamische beeldvormingsopties mogelijk zijn. Omdat zebravisschubben zowel osteoblasten als osteoclasten hebben en zeer overvloedig aanwezig zijn, bieden ze een gemakkelijk toegankelijke en overvloedig beschikbare bron van onafhankelijke boteenheden. Bovendien regenereren volwassen zebravisschubben, eenmaal verwijderd, volledig, waardoor het een manier biedt om de spatiotemporele groei van gemineraliseerd weefsel in vivo te bestuderen.Hier beschrijven we protocollen voor het oogsten en het volgen van de regeneratie van de weegschalen. Ten slotte wordt ook een protocol gepresenteerd voor een stabiele kweek van schubben ex vivo gedurende een week en na de genezingsreactie na gecontroleerde schade aan de gemineraliseerde matrix van de schaal in de loop van de tijd.
Introduction
Bot is een hard bindweefsel dat een belangrijk onderdeel van het skelet vormt, waardoor voortbeweging mogelijk is en als minerale reserve in het lichaam fungeert. Om het bot gezond te houden, is een voortreffelijk evenwicht tussen botvorming en -afbraak essentieel via de gekoppelde activiteit van osteoblasten (die anabool zijn) en osteoclasten (die bot resorberen). Dit evenwicht wordt verstoord door veroudering of hormonale onbalans, wat vaak leidt tot botfragiliteitsziekten zoals osteoporose. Hoewel bestaande geneesmiddelen zijn goedgekeurd om botfragiliteitsziekten aan te pakken, hebben veel medicijnen bijwerkingen; Daarom is er behoefte aan nieuwe therapieën1. Er blijft dus behoefte aan overvloedige bronnen van biologisch relevant botweefsel dat kan worden gebruikt om potentiële therapeutische verbindingen te testen.
Traditioneel worden knaagdiermodellen en celkweeksystemen gebruikt om de botbiologie te bestuderen. Zebravissen worden echter steeds meer een ander model bij uitstek. Hoewel het geen zoogdiersysteem is, bieden zebravissen bepaalde voordelen voor botonderzoek ten opzichte van knaagdieren; deze omvatten hun vruchtbaarheid en de doorschijnendheid van de larven; Zelfs op volwassen leeftijd blijven sommige skeletweefsels, waaronder de schubben en de vinnen, doorschijnend, waardoor in vivo beeldvorming met hoge resolutie en een verhoogde beschikbaarheid van skeletmutanten mogelijk zijn 2,3. Zowel de vinnen als de schubben van zebravissen zijn in staat om na verwijdering volledig te regenereren. Skeletregeneratie en herstel van verwondingen van zebravisvinnen zijn uitgebreid bestudeerd 4,5, terwijl zebravisschubben een nieuwer botmodel in het veld zijn, maar voordelen bieden voor ex vivo kweek6.
Schubben zijn zeer overvloedig, met minstens 300 schubben op elke vis die dienen als een beschermende bedekking voor de vis. Elke schaal is een kleine gemineraliseerde plaat die bestaat uit botvormende osteoblasten en botresorberende osteoclasten van een collageenrijke skeletmatrix7. Het ossificatieproces van zowel zebravisschubben als menselijke botten vereist de differentiatie van mesenchymale stamcellen in osteoblasten om de gemineraliseerde matrix te vormen. Zebravisschubben bieden een groot voordeel voor skeletonderzoek met hun sterke regeneratieve vermogen dat kan worden gebruikt om botregeneratie en -herstel te bestuderen. Ondanks de aanwezigheid van zowel osteoblasten als osteoclasten, missen zebravisschubben echter osteocyten die belangrijk zijn voor menselijke botremodellering en mechanosensatie; Door de oppervlakkige ligging van de schubben kunnen ze gemakkelijk met een pincet worden verwijderd. Bij het verwijderen van de schaal treedt een cascade van gebeurtenissen op en begint de regeneratie van de schaal 8,9. Er zijn verschillende kleurings- en beeldvormingsopties beschikbaar om de activiteit van osteoblasten en osteoclasten en de mineralisatie van de schubben te visualiseren, zoals weergegeven in figuur 1. Bovendien betekent de beschikbaarheid van veel relevante fluorescerende transgene reporterlijnen van zebravissen dat men de celdynamiek tijdens regeneratie kan visualiseren 7,10,11. Dit proces stelt iemand in staat om meer inzicht te krijgen in de novo botvorming door de vroege patronen van schaalregeneratie op de flank van de vis te observeren om morfologie, cellulaire activiteit en genetische profielen van deze geregenereerde schubben te bestuderen. De biologie van kalkvorming en regeneratie is goed gekarakteriseerd. Belangrijk is dat schubben een goed voorspellend vermogen kunnen vertonen voor therapeutisch relevante verbindingen12 en dat de behandeling van vissen met glucocorticoïden leidt tot een schaal die regenereert om osteoporotische fenotypes te vertonen13. Het transcriptoom van de regenererende schubben toont aan dat genen die worden geactiveerd bij schaalregeneratie verrijkt zijn voor genen die verband houden met menselijke skeletaandoeningen, wat hun relevantie als modelsysteem verder aantoont 6,14.
Ten slotte kunnen deze schubben tot 7 dagen ex vivo worden gekweekt. Vergeleken met cellijnculturen die doorgaans uit één celtype bestaan, biedt ex vivo schaalkweek in vitro botstudiemogelijkheden in zijn natuurlijke omgeving die zowel osteoblasten als osteoclasten bevat met zijn natuurlijke extracellulaire matrix 8,12,15,16.
Schaalcultuur stelt ons ook in staat om geneesmiddelenscreening uit te voeren voor nieuwe osteoanabole doelen. De overvloed aan schubben op de vis betekent dat men ten minste twee platen van de 96-wells plaat van slechts één vis kan vullen, waardoor samengestelde screening mogelijk is in een multiwell-formaat waarbij elk putje één schub bevat, samen met zijn natuurlijke niche van cellen. Bovendien, omdat de schubben dun zijn, is de absorptie van geneesmiddelen voorspelbaar12. Samenvattend hebben de elasmoid schubben van zebravissen een groot potentieel in skeletonderzoek en kunnen ze ons helpen meer inzicht te krijgen in de cellulaire gebeurtenissen tijdens botvorming en -herstel. Hier beschrijven we protocollen voor het oogsten van schubben om regeneratie in vivo te volgen en de schubben ex vivo te kweken.
Protocol
De University Animal Scientific Unit (ASU) is verantwoordelijk voor de verzorging van zebravissen onder begeleiding van de richtlijnen voor het houden van zebravissen. Alle procedures, waaronder het oogsten van kalkaanslag, het kleuren van levende botten en live beeldvorming, zijn goedgekeurd en uitgevoerd onder een UK Home Office Project License (PP4700996). Voor dit manuscript is gebruik gemaakt van jongvolwassen transgene zebravissen uit de sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] lijn17. De vissen omvatten zowel mannetjes als vrouwtjes van 4 maanden oud.
1. Regeneratie op in-vivoschaal
- Voordat u met het schaalregeneratie-experiment begint, brengt u zebravissen over van hun hoofdtanks naar individuele tanks (zie Tabel met materialen) en keert u terug naar deze individuele tanks na beeldvorming tijdens het experiment, zoals weergegeven in figuur 2. Dit is om ervoor te zorgen dat alle regenererende schubben de schubben zijn die voor het experiment zijn geoogst; Groepshuisvesting kan leiden tot sporadisch verlies van schubben als gevolg van verwondingen veroorzaakt door andere vissen.
OPMERKING: De vissen worden individueel geplaatst om gevechten en daaropvolgend schaalverlies tussen vissen te voorkomen. - Noteer informatie voor elke experimentvis (d.w.z. genotype, leeftijd en geslacht) volgens het ontwerp van het experiment. Gebruik een camera (smartphonecamera's werken prima) om een foto te maken van elke vis naast een liniaal om de grootte/lengte en gezondheidstoestand van de vis vast te leggen.
- Verdoof de zebravis op de dag van het experiment met 0,05% (v/v) tricaïne methaansulfonaat (MS222, zie Materiaaltabel) door onderdompeling, en plaats deze vervolgens op een petrischaal met een vochtig weefsel om beweging van de vis tijdens beeldvorming of oogsten te voorkomen.
- Leg de vis op zijn kant (meestal wordt hier de linkerflank gebruikt voor consistentie). Voer flankbeeldvorming uit met behulp van een stereomicroscoop met de juiste vergroting (meestal werden 2x, 4x en/of 6,3x en 8x gebruikt voor het huidige onderzoek om zowel het algehele regeneratiegebied als het ingezoomde gebied vast te leggen voor gedetailleerde observatie).
OPMERKING: De tijdstippen voor flankbeeldvorming zijn afhankelijk van het experimentele doel en de keuze van transgene verslaggevers. Om bijvoorbeeld osteoblasten te volgen tijdens de regeneratie van kalkaanslag, zijn de voorgestelde tijdstippen dag 0 (ontogetisch), 2 dagen na de oogst (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. Om de effecten van herhaalde anesthesie te verminderen, moet u de beeldvormingstijdstippen zo min mogelijk houden die nodig zijn voor het experiment. - Oogst schubben met een fijn pincet en een pincet onder de stereomicroscoop. Breng de geoogste schubben over in opvangbuizen om ze later te kleuren.
OPMERKING: Het maximale aantal schubben dat kan worden geoogst, hangt af van de lokale ethische goedkeuringen die van kracht zijn. We oogsten meestal ongeveer 20 tot 30 schubben en verzamelen ze in individuele opvangbuizen om later kalkvlekken te maken, zoals ALP, von Kossa14. - Vang de weegschaal op in een opvangbuisje van 1.5 ml of 2 ml. Dit is afhankelijk van de gebruikte kleurtechniek.
- Breng voor zowel ALP- als von Kossa-kleuring de schubben over in verzamelbuizen met gedeïoniseerd water, terwijl voor TRAP-kleuring of immunohistochemie de schubben overbrengen in verzamelbuizen die 4% PFA (fixeeroplossing) bevatten.
- Optioneel: Voordat u weegschalen in buizen overbrengt, moet u indien nodig beelden maken van individuele geoogste weegschalen.
OPMERKING: Voorgestelde tijdstippen voor het oogsten van weegschalen zijn dag 0 (ontogetisch), dag 10 en dag 21 (geregenereerde schubben).
2. Kleuring van levende botten
OPMERKING: Levende skeletkleuring kan worden uitgevoerd wanneer experimentele vissen niet transgeen zijn voor fluorescerende reporters of wanneer ze eenkleurige transgene reporters bij zich hebben. Levende kleuring kan worden gebruikt als aanvulling op transgenen; men kan bijvoorbeeld een osteoblastreporter zoals sp7/osx in één kleur (bijv. GFP) gebruiken en vervolgens bot in rood kleuren met Alizarinerood (AR). AR en calcein green kunnen samen voor dezelfde vis worden gebruikt; in dit scenario wordt AR gebruikt om origineel of ontogenetisch bot te labelen door zich te binden aan de gemineraliseerde matrix van verouderd bot, en calceïne bindt zich aan calciumionen die overvloedig aanwezig zijn in nieuw gevormd bot. Bij het kleuren van een ontogenetische schaal kan AR bijvoorbeeld worden gevisualiseerd, maar calceïnegroen kan afwezig of minimaal zijn, omdat ontogenetische schalen lage niveaus van nieuwe botvorming hebben.
- Voer live Alizarin Red (AR)-kleuring uit.
- Bereid een fles met 2x AR-kleuringsoplossing door 0,5% (w/v) voorraad Alizarine-oplossing (10 ml) te mengen met 10 ml 1 M voorraad HEPES (eindconcentratie, 10 mM) (zie materiaaltabel).
- Vul tot 1 L aan met 1x Danieau oplossing (zie Materiaaltabel). De oplossing moet in het donker worden bewaard of in folie worden omwikkeld.
- Breng op de dag van het experiment 500 ml 2x AR-oplossing naar de zebravisfaciliteit en voeg 500 ml systeemwater (uit het aquarium) toe om 1x werkende AR-oplossing te maken.
- Breng de vissen uit hun aquarium over in een 1x werkende AR-kleuringsoplossing en laat ze 15-20 minuten staan. Was de overtollige vlek op de vis af met 15 minuten 'wassen' in het systeemwater.
- Voer live Calcein Green-kleuring uit.
- Bereid een fles met 2x Calcein Green kleuringsoplossing door 45 mg Calceïnepoeder toe te voegen aan 900 ml 1x Danieau-oplossing (zie Materiaaltabel). Gebruik een magnetische roerder om het poeder volledig te laten oplossen.
- Stel de pH in op 8. Dit is de 2x voorraad Calcein Green oplossing. De oplossing kan maximaal 1 maand in het donker worden bewaard/in folie worden omwikkeld.
- Breng op de dag van het experiment 500 ml 2x Calcein Green-oplossing naar de zebravisfaciliteit en voeg 500 ml systeemwater toe om 1x werkende Calcein Green-oplossing te maken. Het wordt aanbevolen om vers gemaakte Calcein-kleuroplossing te gebruiken.
- Breng de vissen uit hun aquarium over in 1x werkende Calcein Green-kleuroplossing en laat ze 1-2 uur staan. Afhankelijk van de grootte van de vis kan een langere kleurtijd nodig zijn.
- Was de overtollige vlek op de vis af door 15 minuten te 'wassen' in het systeemwater.
OPMERKING: Afbeelding de Calcein Green bevlekte vis zo snel mogelijk, aangezien deze vlek binnen een paar uur zal vervagen.
3. Alkalische fosfatase (ALP) kleuring op schubben na de oogst
- Bereid de ALP-kleuroplossing door 100 mM Tris (pH 9,5 met HCl) te mengen met 100 mM NaCl en 50 mM MgCl2.
- Gebruik in de handel verkrijgbare NBT/BCIP-voorraadoplossing (zie Materiaaltabel).
- Breng de schubben over in buizen met gedeïoniseerd water.
- Spoel de schubben 5 minuten af in ALP-kleurstofoplossing.
- Bereid ondertussen een werkende kleuroplossing door 200 μL van de NBT/BCIP-oplossing toe te voegen aan 10 ml ALP-kleuringsbuffer. Dit moet vers worden bereid op het moment van kleuren.
- Kleur de schubben gedurende 15 minuten met de werkende ALP-kleurstofoplossing.
- Stop de reactie door de weegschaal te spoelen met gedeïoniseerd water.
4. Von KOSSA-kleuring op schubben na de oogst
- Bereid 5% (m/v) zilvernitraatoplossing.
- Bereid 5% (m/v) natriumthiosulfaatoplossing.
- Breng de geoogste schubben over in buizen met gedeïoniseerd water.
- Incubeer de schubben gedurende 40 minuten in de zilvernitraatoplossing onder sterk licht.
NOTITIE: Draag PBM's (persoonlijke beschermingsmiddelen) omdat zilvernitraat een vlek achterlaat die moeilijk te verwijderen is. - Was de weegschaal twee keer gedurende 5 minuten met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Zilvernitraatafval moet worden ingezameld en afgevoerd volgens de lokale richtlijnen. - Incubeer de schubben gedurende 5 minuten in natriumthiosulfaat.
- Was de weegschaal twee keer gedurende 5 minuten met gedeïoniseerd water.
5. Colorimetrische TRAP-kleuring
OPMERKING: Voor de gedetailleerde procedure verwijzen wij u naar eerder gepubliceerd werk18.
- Bereid de kleuroplossingen voor.
- Bereid 10 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaatoplossing.
- Weeg 5 mg naftolfosfaat AS-MX-fosfaat af (zie materiaaltabel).
- Maak in de zuurkast een buisje met 0,5 ml N'-dimethylformamide en los 5 mg Naftol-AS-MX-fosfaat op in 0,5 ml N'-dimethylformamide om een stockoplossing van 10 mg/ml Naftol-AS-MX-fosfaat te maken (voorzichtig schudden).
- Bereid 1,6 mM Fast Red Violet LB-bouillonoplossing in 50 mM natriumtartraat.
- Bereid 50 ml 0,1 M natriumacetaat bij pH 5 (voeg 0,41015 g natriumacetaat toe aan 50 ml gedeïoniseerd water en pas de pH aan op 5 met 100% azijnzuur).
- Los 0,575 g dibasisch natrium-L-tartraat (zie materiaaltabel) op in 50 ml 0,1 M natriumacetaatbuffer (pH = 5).
- Voeg 30 mg snel rood violet LB-zout toe.
- Bereid PBS-0.1Tx (los 500 μL Triton-X op in 500 ml PBS).
- Bereid PBS-0.1Tw (los 500 μL Tween-20 op in 500 ml PBS).
- Bereid 10 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaatoplossing.
- Bereid een werkende TRAP-oplossing voor.
- Meng beide stockoplossingen samen in de zuurkast (0,5 ml 10 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaatoplossing en 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-bouillonoplossing in 50 mM natriumtartraat).
NOTITIE: De werkoplossing kan nu buiten de zuurkast worden gebruikt. Het kan maximaal een maand in de koelkast worden bewaard (verpakt in folie). Bewaar in aparte containers van antilichamen of andere reagentia die gevoelig zijn voor fixeermiddelen. Blijf zoveel mogelijk uit de buurt van licht. - Optioneel: bereid bleekoplossing (op post-gefixeerde monsters die TRAP-gekleurd waren) in PBS en 0,1% Tween-20 (PBS-0,1%Tw).
- Maak een mengsel van 0,5% kaliumhydroxide (KOH) (van 10% stockoplossing (m/v)) en 3% waterstofperoxide (H2O2) (33% stockoplossing, bewaard in de koelkast).
- Meng beide stockoplossingen samen in de zuurkast (0,5 ml 10 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaatoplossing en 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-bouillonoplossing in 50 mM natriumtartraat).
- Voer monsterfixatie uit.
- Bevestig de weegschaal in 4% PFA in 1x PBS schommelen of draaien gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de 4% PFA en was met PBS-0.1Tx minstens 3 keer gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Ga direct over op TRAP-kleuring (de beste aanpak) of bewaar het een nacht in PBS-0.1 Tx.
- Voer TRAP-kleuring van de schubben uit.
- Verwijder de PBS-0.1 Tx-oplossing en voeg de colorimetrische TRAP-werkoplossing toe (stap 5.2.1) om de monsters volledig te bedekken (d.w.z. 1 ml in een microcentrifugebuis van 1.5 ml).
- Incubeer 1-2 uur bij RT, schommelend in het donker.
- Verwijder de kleuroplossing en was minstens 3 keer met PBS-0.1 Tw gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Fixeer de monsters in 4% PFA gedurende 30 minuten bij RT, zachtjes schommelend in het donker.
- Verwijder de PFA-oplossing door 3 keer te wassen met PBS-0.1 Tw gedurende 5 minuten per stap.
OPMERKING: De monsters kunnen voor onbepaalde tijd worden bewaard (in bewaaroplossingen/gemonteerd op microscoopglaasjes) bij 4 °C in het donker.
6. Montage van bevlekte schubben
- Bereid het montagemedium voor door 2,4 g Mowiol 4-88 kristallen toe te voegen aan 6 g glycerol (zie Materiaaltabel). Alle gewenste montagemedia kunnen worden gebruikt.
- Voeg 6 ml gedeïoniseerd water toe en laat een uur op een magneetroerder staan.
- Voeg 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) toe en incubeer bij ongeveer 53 ° C totdat de Mowiol-kristallen volledig zijn opgelost.
- Klameer de oplossing door 20 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 2000 x g .
- Breng de oplossing over in een opslagcontainer. Het montagemedium is ongeveer 12 maanden houdbaar in de vriezer. De ontdooide Mowiol-oplossing is tot 1 maand stabiel.
- Monteer de weegschaal op een microscoopglaasje in de montage van het medium, bedek ze met een dekglaasje en bekijk ze onder een microscoop.
7. Ex vivo cultuur van weegschalen
OPMERKING: Deze stap is overgenomen van de Vrieze et al.12.
- Voordat u de schubben in een steriele omgeving oogst, bereidt u het osteogene medium en de kweekplaat voor.
- Osteogeen kweekmedium (OCM): Maak in een steriele centrifugebuis 15 ml OCM in standaard celkweekmedium (hoge glucose, geen glutamine, geen fenolrood) in de uiteindelijke concentraties van 1% runderkalverserum, 1% (200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl), 1% antibiotische/antimycotische oplossing (100x) oplossing, 4 mM CaCl2, 10 mM β-glycerofosfaat, 1 nM natriumpyruvaat en 1% amfotericine B (optioneel) (zie materiaaltabel).
- Giet de OCM in een steriel reagensreservoir en voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes.
- Sluit de plaat met 96 putjes af en berg de plaat op. OCM kan voor een korte periode in de koelkast worden bewaard ('s nachts tot 1 week) en voor gebruik op 28 °C worden bewaard.
- Voer kalkoogst en PBS-wassen uit.
- Oogst de schubben met een steriel pincet en deponeer ze in een petrischaaltje met een steriele PBS-oplossing.
- Voer de plaatinstelling uit.
- Breng elke schaal van de petrischaal over naar elk putje op de plaat met 96 putjes met 100 μL OCM (opgewarmd tot 28 °C) met behulp van een steriele pincet.
- Zodra alle schubben op de plaat zijn overgebracht, brengt u de plaat onder een stereomicroscoop. Gebruik een fijne, steriele pipetpunt om elke schub voorzichtig naar de bodem van het putje te verplaatsen en houd ze uit de buurt van de zijkant van de putjes om lichtreflectie tijdens beeldacquisitie te voorkomen.
OPMERKING: Deze stap is alleen vereist als u live beeldvorming uitvoert. - Breng de plaat voorzichtig over naar de incubator of het Live Imaging System (LIS, zie Materiaaltabel) (ingesteld op 28 °C, 5% CO2), waar de weegschaal maximaal 7 dagen kan worden gekweekt.
- OCM vernieuwen (optioneel).
- Verwarm de OCM die in de koelkast is bewaard tot 28 °C.
- Breng de plaat met 96 putjes voorzichtig over naar een steriele omgeving. Zuig met een meerkanaalspipet 50 μl uit elk putje op. Druk hiervoor de punten tegen de wanden en dompel ze niet tot aan de onderkant om te voorkomen dat de schubben worden opgezogen/verplaatst/verwijderd. Gebruik nieuwe tips voor verschillende omstandigheden.
- Giet de OCM in een steriel reagensreservoir en voeg met behulp van de meerkanaalspipet 60 μL OCM toe aan elk putje.
- Plaats de plaat onder de stereomicroscoop en controleer op verkeerd geplaatste schubben (te dicht bij de wanden, zwevend of in een verticale positie in de media). Verplaats ze indien nodig met een fijne, steriele pipetpunt.
- Plaats de plaat terug in de couveuse/LIS.
OPMERKING: Ververs het medium niet als het experiment circadiaans ritme (CR) betreft, aangezien serumshock de biologische klok kan beïnvloeden. Let op: bij het bestuderen van CR merkt CR op dat lichtomstandigheden ook de klok resetten.
- Voer kleuring en beeldvorming na het kweken van schaal uit (optioneel).
- Na 6 dagen kweken, fixeer ze en richt ze op de juiste kleuring zoals von Kossa en ALP hierboven vermeld.
- Als alternatief, als de experimentele vissen een fluorescerend label hebben, plaatst u de plaat in een live beeldvormingssysteem.
NOTITIE: Als u een live beeldvormingssysteem gebruikt, zorg er dan voor dat dit is ingesteld op een temperatuur en CO2 -niveau dat geschikt is voor het experiment. In dit onderzoek werd doorgaans 28 °C en 5% CO2 gebruikt. Selecteer geschikte filters en beeldvormingstijdstippen (hier werd een interval van 2 of 4 uur gebruikt, dat voldoende is om de migratie van osteoblasten te volgen) en doelstellingen met een lage vergroting (d.w.z. 4x) om een gelijkmatige beeldvorming van de hele put te garanderen. Dit komt omdat de schubben de neiging hebben om in de putten te bewegen, vooral tijdens mediawisselingen.
Representative Results
Regeneratie van weegschalen
Schaalregeneratie kan worden gevolgd met een standaard fluorescerende stereomicroscoop door de flank van de zebravis in beeld te brengen. Figuur 3A toont veranderingen in sp7/osx-expressie van de schubben tijdens de regeneratie van de schubben in een 4 maanden oude zebravis. Tijdstippen voor flankbeeldvorming zoals weergegeven in figuur 3A zijn ontogenetisch (originele schalen, vóór de oogst), dag 2, dag 4 en dag 10 na de oogst. We gebruiken meestal osx (ook bekend als osterix of sp7) transgene lijnen (ofwel als een GFP (Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19 of mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17 om veranderingen in het skelet te volgen terwijl het botproducerende osteoblasten labelt. Vroege patronen van nieuw gevormde schubben zijn te zien op 2 dagen regeneratie. Dit vroege patroon van schaalregeneratie is in sommige gevallen verstoord, vooral bij skeletmutanten. Door de voortgang van de regeneratie te volgen, kan men de capaciteit en snelheid van regeneratie analyseren. Op de dag van de oogst van de schaal kunnen individuele beeldvorming van de geoogste schubben worden uitgevoerd na opname van de flank met dezelfde stereomicroscoop, zoals weergegeven in figuur 3B. Geregenereerde schubben hebben een veel hogere osx-expressie in vergelijking met ontogenetische schalen op dag 0, omdat osteoblasten nodig zijn voor de nieuwe botvorming.
Cultuur op ex vivoschaal
Hoewel men het de novo botvormingsproces kan bestuderen door het regeneratieproces op de flank van de vis te volgen, kunnen we dit model ook gebruiken om het herstel en de genezing van skeletletsels te bestuderen met ex vivo schaalkweek door met een scalpel een verwonding op de schubben te maken. Met behulp van een live beeldvormingssysteem kan de reparatie in realtime worden gevolgd. Figuur 4 toont een representatief resultaat van een genezingsreactie op een ontogenetische schaal in 3 dagen in een kweek waarbij de osteoblasten zijn gelabeld met osx: mCherry. De plaats van de verwonding die wordt aangegeven door de inzetstukken aan het begin van de kweek vertoont een duidelijke kloof tussen osteoblasten en schaalcirculi (figuur 4A). Men kan de migratie van osteoblasten naar de plaats van de verwonding volgen met time-lapse-beeldvorming. Na 3 dagen in kweek is de breedte van de spleet verkleind en is de expressie van deosx te zien tussen de spleet en de nieuw gevormde schaalcirculi (Figuur 4B). Bovendien is de morfologie in termen van de vorm van de osteoblasten meer cirkelvormig aan het begin van de kweek en na 3 dagen langwerpiger. Deze verandering in het uiterlijk van osteoblasten is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het in cultuur is en niet in zijn natuurlijke omgeving (gehecht aan de vis).
Afbeelding 1: Voorbeelden van beeldvormingsopties voor weegschalen. Osteoblasten kunnen worden gevisualiseerd met osx/sp7 transgene reporterlijnen (in GFP of mCherry). ALP-kleuring kan worden gebruikt om de osteoblastactiviteit aan te tonen. TRAP-kleuring kan de activiteit van osteoclasten aantonen. Alizarinerood (AR) en Calceïnegroen zijn beide kleurstoffen die in levende vissen kunnen worden gebruikt; AR labelt mineralisatie en Calceïne labelt nieuw gevormd bot. De mate van mineralisatie kan ook worden aangetoond met von Kossa-kleuring. Schaalbalken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van een schaalregeneratie-experiment. Generiek schema van een schaalregeneratie-experiment dat aantoont dat vissen vóór het experiment in individuele tanks worden gescheiden. Lengte, geslacht en gezondheid worden geregistreerd. Het schema toont ook het voorgestelde gebied op de flank van de vis om schubben te oogsten en voorgestelde beeldvormingstijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van osterix-expressie (om osteoblasten te visualiseren) tijdens schaalregeneratie genomen van een 4 maanden oude zebravis. (A) De flankbeelden vastgelegd op dag 0 (pre-oogst, ontogenetische schalen), 2 dph (dagen na de oogst) dag 2, 4 dph en 10 dph voor het volgen van veranderingen in osx-expressie . Schubben: 1 mm. (B) Representatieve beelden van een ontogenetische schaal en een schaal bij 10 dph, genomen van dezelfde vis als in paneel (A). Let op de verhoogde niveaus van osx-expressie zoals weergegeven in magenta in het midden van de regenererende schalen. Schaalbalken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van de herstelrespons op skeletletsel op een ontogenetische schaal, vastgelegd van een 4 maanden oude zebravis met behulp van een live beeldvormingssysteem. (A) Ontogenetische schubben met een verwonding met een scalpel op dezelfde dag als de oogst (tijdstip 0/dag0) van de cultuur. (B) Dezelfde schaal wordt 3 dagen na het letsel weergegeven. Inzet toont het gebied van de verwonding. Schaalbalken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De elasmoid schubben van zebravissen, als een nieuw model voor skeletonderzoek, hebben een groot potentieel om ons begrip van botonderhoud, regeneratie en letselherstel te helpen. De overvloed aan schubben op vissen maakt het mogelijk om samengestelde screening met een gemiddelde tot hoge doorvoer mogelijk te maken, terwijl het aantal gebruikte dieren wordt verminderd en de variatie binnen het individu wordt beperkt. Hier worden protocollen voor schaalregeneratie en ex vivo schaalcultuur gepresenteerd om regeneratie en reparatie te bestuderen.
Bij het volgen van dit protocol moeten enkele cruciale stappen worden overwogen. Zorgvuldige verwijdering van de schubben is essentieel, vooral bij het gebruik van een transgene reporterlijn om de verstoring van de celpopulatie door het oogsten te beperken. Als er vergelijkingen moeten worden gemaakt met ontogenetische schubben, zorg er dan voor dat het gebied geen spontaan regenererende schubben bevat (die van nature kunnen voorkomen tijdens de levensduur van de vis). Zorg ervoor dat de omgeving en apparatuur steriel zijn voor ex vivo kweek om een optimale celoverleving en minimale infectie in de kweek te bereiken.
Afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag kunnen aanpassingen aan het protocol worden gedaan, zoals het combineren van verschillende transgene reporterlijnen om andere celtypen van genexpressieprofielen tijdens regeneratie en reparatie te visualiseren11,14.
Het brede scala aan kleuringen dat men op de weegschaal kan uitvoeren, betekent dat men voor elke geteste verbinding of aandoening de effecten op het bot vanuit verschillende invalshoeken kan bekijken; terwijl sp7/osx-verslaggevers osteoblastnummers kunnen laten zien, kan ALP-kleuring de activiteit van osteoblasten visualiseren, TRAP-kleuring kan osteoclastactiviteit visualiseren, Calceïne groene levende kleuring kan nieuw vormend bot labelen en Alizarine-rode of von Kossa-kleuring kan schaalmineralisatie laten zien. Luciferase-activiteit om osteoblasten te kwantificeren kan ook worden gebruikt12. In combinatie met deze kleuringstechnieken kan men de relatieve bijdrage van osteoblasten en osteoclasten aan een bepaald boteffect leren kennen. Schubben missen osteocyten, die veel voorkomen in het bot van zoogdieren en de belangrijkste aanjagers zijn van de mechanosensorische respons van botten; Kalkherstel en -regeneratie in dit model worden voornamelijk aangedreven door osteoblasten met daaropvolgende remodellering door osteoclasten 8,9. Het is cruciaal op te merken dat er variatie optreedt tussen individuen en leeftijdsgroepen20. Om dit tot een minimum te beperken, moet het schaaloogstgebied constant zijn, aangezien verschillende locaties aanleiding kunnen geven tot verschillende schaalmorfologieën en vissen van dezelfde broers en zussen worden gebruikt, zodat leeftijd en grootte consistent zijn. Omdat er echter meerdere schubben per vis kunnen worden geoogst, kan men meer experimenten uitvoeren met minder vissen, waardoor de intra-individuele variabiliteit wordt verminderd.
Samengevat tonen deze protocollen experimentele technieken die kunnen worden toegepast op ontogenetische en regenererende schalen. Concluderend tonen elasmoïde schubben een groot potentieel als skeletmodel om het begrip van botvorming en -herstel te bevorderen; en zal helpen om het gebruik van dieren voor screening van osteoanabole verbindingen met hoge doorvoer te verminderen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We willen Mathew Green van de Animal Service Unit bedanken voor het kweken van vis en Katy Jepson van het Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB en QT werden gefinancierd door Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB en QT Intermediate Fellowship 22044), RR werd gefinancierd door (NHMRC APP1158758). Dit werk werd ook ondersteund door de BBSRC-subsidie (BB/T001984/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
- Tobias, J. H., et al. Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).
- Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. Zebrafish: An emerging model for orthopedic research. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).
- Dietrich, K., et al. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).
- McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish. JBMR Plus. 5 (3), 10461 (2021).
- Sehring, I., Weidinger, G. Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758 (2022).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).
- Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, 37001 (2018).
- Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).
- Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research. Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).
- Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone. Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
- De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales. PLoS One. 9 (2), 89347 (2014).
- Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biology. 20 (1), 21 (2022).
- Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. Journal of Bone and Mineral Research. , John Wiley and Sons Inc. (2022).
- Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).
- Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
- Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity. European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369 (2022).
- DeLaurier, A., et al. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505 (2010).
- Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates. Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).
