Summary
Detta protokoll beskriver skörd och visualisering av elasmoidfjäll hos zebrafiskar under in vivo-regenerering . Dessutom presenteras ex vivo-odlingen av dessa skalor i upp till 7 dagar efter skörden.
Abstract
Skelettsjukdomar är ofta komplexa i sin etiologi och drabbar miljontals människor världen över. På grund av den åldrande befolkningen finns det ett behov av nya behandlingar som kan minska belastningen på hälso- och sjukvårdssystemen. Eftersom dessa sjukdomar är komplexa är det svårt och dyrt att exakt modellera benpatofysiologin i en laboratoriemiljö. Utmaningen för fältet är att etablera en kostnadseffektiv, biologiskt relevant plattform för modellering av bensjukdomar som kan användas för att testa potentiella terapeutiska substanser. En sådan plattform bör helst möjliggöra dynamisk visualisering av cellbeteenden hos benbyggande osteoblaster och bennedbrytande osteoklaster som verkar i sin mineraliserade matrismiljö. Zebrafiskar används i allt högre grad som modeller på grund av tillgången till genetiska verktyg, inklusive transgena reporterlinjer, och det faktum att vissa skelettvävnader (inklusive fjällen) förblir genomskinliga till vuxen ålder, vilket möjliggör dynamiska avbildningsalternativ. Eftersom zebrafiskfjäll har både osteoblaster och osteoklaster och är mycket rikliga, ger de en lättillgänglig och rikligt tillgänglig resurs av oberoende benenheter. Dessutom, när de väl har tagits bort, regenereras vuxna zebrafiskfjäll helt, vilket erbjuder ett sätt att studera den spatiotemporala tillväxten av mineraliserad vävnad in vivo. Här beskriver vi protokoll för skörd och spårning av fjällens regenerering. Slutligen presenteras också ett protokoll för stabil odling av skalor ex vivo under en vecka och efter läkningsresponsen efter kontrollerad skada på den mineraliserade matrisen i skalan över tid.
Introduction
Ben är en hård bindväv som utgör en stor del av skelettet, vilket möjliggör förflyttning och fungerar som en mineralreserv i kroppen. För att bibehålla ett friskt ben är en utsökt balans mellan benbildning och nedbrytning nödvändig via den kopplade aktiviteten hos osteoblaster (som är anabola) och osteoklaster (som resorberar ben). Denna balans störs av åldrande eller hormonell obalans, vilket ofta leder till benskörhetssjukdomar som osteoporos1. Även om befintliga läkemedel har godkänts för att rikta in sig på benskörhetssjukdomar, har många biverkningar; Därför finns det ett behov av nya terapier1. Således finns det fortfarande ett behov av rikliga källor till biologiskt relevant benvävnad som kan användas för att testa potentiella terapeutiska föreningar.
Traditionellt har gnagarmodeller och cellodlingssystem använts för att studera benbiologi. Zebrafiskar blir dock i allt högre grad en annan förebild. Även om zebrafiskar inte är ett däggdjurssystem erbjuder de vissa fördelar för benforskning jämfört med gnagare. Dessa inkluderar deras fruktsamhet och larvernas genomskinlighet; Även i vuxen ålder förblir vissa skelettvävnader, inklusive fjäll och fenor, genomskinliga, vilket möjliggör högupplöst in vivo-avbildning och ökad tillgänglighet av skelettmutanter 2,3. Både zebrafiskens fenor och fjäll kan regenerera sig helt efter att de tagits bort. Skelettregenerering och skadereparation av zebrafiskfenor har studerats utförligt 4,5, medan zebrafiskfjäll är en nyare benmodell i fält men erbjuder fördelar för ex vivo-odling 6.
Fjällen är mycket rikliga, med minst 300 fjäll på varje fisk som fungerar som ett skyddande hölje för fisken. Varje fjäll är en liten mineraliserad platta bestående av benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster av en kollagenrik skelettmatris7. Förbeningsprocessen hos både zebrafiskfjäll och mänskliga ben kräver differentiering av mesenkymala stamceller till osteoblaster för att bilda den mineraliserade matrisen. Zebrafiskfjäll erbjuder en stor fördel för skelettforskning med sin starka regenerativa förmåga som kan användas för att studera benregenerering och reparation. Men trots närvaron av både osteoblaster och osteoklaster saknar zebrafiskfjäll osteocyter som är viktiga för mänsklig benombyggnad och mekanosensation; Fjällens ytliga placering gör att de enkelt kan tas bort med en pincett. När skalan tas bort inträffar en kaskad av händelser och skalregenerering börjar 8,9. Det finns olika färgnings- och avbildningsalternativ tillgängliga för att visualisera aktiviteten hos osteoblaster och osteoklaster och mineraliseringen av skalorna, som visas i figur 1. Dessutom innebär tillgången på många relevanta fluorescerande transgena reporterlinjer av zebrafiskar att man kan visualisera celldynamik under regenerering 7,10,11. Denna process gör det möjligt att få mer förståelse för de novo-benbildning genom att observera det tidiga mönstret av fjällregenerering på fiskens flank för att studera morfologi, cellulär aktivitet och genetiska profiler hos dessa regenererade fjäll. Skalbildningens och regenereringens biologi har karakteriserats väl. Det är viktigt att notera att fjäll kan visa en god prediktiv förmåga för terapeutiskt relevanta föreningar12 och behandling av fisk med glukokortikoider leder till en skala som regenereras för att visa osteoporotiska fenotyper13. Transkriptomet av de regenererande skalorna visar att gener som aktiveras vid skalregenerering är anrikade för de som är kopplade till mänskliga skelettsjukdomar, vilket ytterligare visar deras relevans som modellsystem 6,14.
Slutligen kan dessa fjäll odlas ex vivo i upp till 7 dagar. Jämfört med cellinjekulturer som vanligtvis består av en enda celltyp, ger odling i ex vivo-skala in vitro-benstudiemöjligheter i sin naturliga miljö som innehåller både osteoblaster och osteoklaster med sin naturliga extracellulära matris 8,12,15,16.
Skalkultur gör det också möjligt för oss att utföra drogscreening för nya osteoanabola mål. Överflödet av fjäll på fisken innebär att man kan fylla minst två plattor av 96-brunnsplattan från bara en enda fisk, vilket möjliggör sammansatt screening i ett multibrunnsformat där varje enskild brunn innehåller en skala tillsammans med dess naturliga nisch av celler. Dessutom, eftersom skalorna är tunna, är läkemedelsabsorptionen förutsägbar12. Sammanfattningsvis har zebrafiskens elasmoidfjäll stor potential inom skelettforskning och kan hjälpa oss att få mer insikt i de cellulära händelserna under benbildning och reparation. Här beskriver vi protokoll för skörd av skalor för att följa föryngring in vivo och odla skalorna ex vivo.
Protocol
University Animal Scientific Unit (ASU) ansvarar för zebrafiskvård enligt riktlinjer för zebrafiskhållning. Alla procedurer, inklusive avverkning av kalkavlagringar, färgning av levande ben och avbildning av levande djur, godkändes och utfördes under en projektlicens från det brittiska inrikesministeriet (PP4700996). För detta manuskript användes unga vuxna transgena zebrafiskar från sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46]-linjen17. Fisken bestod av både hanar och honor som var 4 månader gamla.
1. Storskalig regenerering in vivo
- Innan försöket med regenerering av skalan påbörjas ska zebrafiskar överföras från sina huvudbassänger till enskilda bassänger (se materialtabell) och återföras till dessa enskilda bassänger efter avbildning under hela försöket, som visas i figur 2. Detta för att säkerställa att alla regenererande skalor är de som skördas för experimentet; Grupphållning kan leda till sporadisk förlust av fjäll på grund av skador orsakade av andra fiskar.
OBS: Fisken placeras individuellt för att undvika slagsmål och efterföljande skalförlust mellan fiskarna. - Registrera information för varje experimentfisk (dvs. genotyp, ålder och kön) enligt försöksdesignen. Använd en kamera (smartphonekameror fungerar bra) för att ta en bild av varje fisk bredvid en linjal för att registrera fiskens storlek/längd och hälsotillstånd.
- På dagen för experimentet bedövas zebrafisken med 0,05 % (v/v) tricainmetansulfonat (MS222, se materialtabell) genom nedsänkning och placeras sedan på en petriskål med fuktig vävnad för att undvika att fisken rör sig under avbildning eller skörd.
- Lägg fisken på sidan (vanligtvis används vänster flank här för konsekvensens skull). Utför flankavbildning med hjälp av ett stereomikroskop med lämplig förstoring (vanligtvis användes 2x, 4x och/eller 6,3x och 8x för den aktuella studien för att fånga både det övergripande regenererande området och det inzoomade området för detaljerad observation).
OBS: Tidpunkterna för flankavbildning beror på det experimentella syftet och valet av transgena rapportörer. Till exempel, för att spåra osteoblaster under skalregenerering, är de föreslagna tidpunkterna dag 0 (ontogenetisk), 2 dagar efter skörd (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. För att minska effekterna av upprepad anestesi, håll avbildningstidpunkterna till det minsta som krävs för experimentet. - Skörda skalor med en fin pincett och pincett under stereomikroskopet. Överför de skördade fjällen till uppsamlingsrör för färgning av kalkavlagringar senare.
OBS: Det maximala antalet skalor som kan skördas beror på lokala etiska godkännanden som finns på plats. Vi skördar vanligtvis cirka 20 till 30 fjäll och samlar dem i enskilda uppsamlingsrör för färgning av kalk senare, till exempel ALP, von Kossa14. - Samla upp vågen i antingen ett 1,5 ml eller 2 ml uppsamlingsrör. Detta beror på vilken färgningsteknik som används.
- För både ALP- och von Kossa-färgning, överför skalorna till uppsamlingsrör som innehåller avjoniserat vatten, medan för TRAP-färgning eller immunhistokemi, överför skalorna till uppsamlingsrör som innehåller 4 % PFA (fixeringslösning).
- Valfritt: Innan du överför fjäll till rör, ta bilder av enskilda skördade fjäll om det behövs.
OBS: Föreslagna tidpunkter för skörd av skalor är dag 0 (ontogenetisk), dag 10 och dag 21 (regenererade skalor).
2. Färgning av levande ben
OBS: Levande skelettfärgning kan utföras antingen när försöksfiskar inte är genetiskt modifierade för fluorescerande rapportörer eller när de bär enfärgade transgena rapportörer. Levande färgning kan användas för att komplettera transgena ämnen; till exempel kan man använda en osteoblastreporter som sp7/osx i en färg (t.ex. GFP) och sedan färga ben i rött med Alizarinrött (AR). AR och calcein green kan användas för samma fisk tillsammans; i detta scenario används AR för att märka ursprungligt eller ontogenetiskt ben genom att binda till den mineraliserade matrisen av åldrat ben, och calcein binder till kalciumjoner som finns rikligt i nybildat ben. Till exempel, vid färgning av en ontogenetisk skala, kan AR visualiseras, men calceingrönt kan vara frånvarande eller minimalt eftersom ontogenetiska skalor har låga nivåer av nybildning av ben.
- Utför Alizarin Red (AR) färgning live.
- Förbered en flaska med 2x AR-färgningslösning genom att blanda 0,5 % (vikt/volym) buljonglösning (10 ml) med 10 ml 1 M stam HEPES (slutkoncentration, 10 mM) (se materialtabell).
- Fyll på upp till 1 l med 1x Danieau lösning (se Materialförteckning). Lösningen måste förvaras mörkt eller förpackas med folie.
- På dagen för experimentet, ta med 500 ml 2x AR-lösning till zebrafiskanläggningen och tillsätt 500 ml systemvatten (från akvariet) för att göra 1x fungerande AR-lösning.
- Överför fisk från deras akvarier till en 1x fungerande AR-färgningslösning och låt stå i 15-20 minuter. Tvätta bort överflödig fläck på fisken med 15 minuters "tvätt" i systemvattnet.
- Utför levande Calcein Green-färgning.
- Förbered en flaska med 2x Calcein Green-färgningslösning genom att tillsätta 45 mg Calcein-pulver till 900 ml 1x Danieau-lösning (se Materialtabell). Använd en magnetomrörare för att låta pulvret lösas upp helt.
- Justera pH-värdet till 8. Detta är Calcein Green-lösningen med 2x lager. Lösningen kan förvaras mörkt/förpackad med folie i upp till 1 månad.
- På dagen för experimentet, ta med 500 ml 2x Calcein Green-lösning till zebrafiskanläggningen och tillsätt 500 mL systemvatten för att göra 1x fungerande Calcein Green-lösning. Det rekommenderas att använda nygjord Calcein-färgningslösning.
- Överför fisken från akvariet till 1x fungerande Calcein Green-färgningslösning och låt stå i 1-2 timmar. Beroende på fiskens storlek kan det krävas en längre färgningstid.
- Tvätta bort överflödig fläck på fisken genom 15 minuters "tvätt" i systemvattnet.
OBS: Avbilda den Calcein Green-färgade fisken så snart som möjligt eftersom denna fläck kommer att blekna inom några timmar.
3. Färgning av alkaliskt fosfatas (ALP) på fjäll efter skörd
- Bered ALP-färgningslösningen genom att blanda 100 mM Tris (pH 9,5 med HCl) med 100 mM NaCl och 50 mM MgCl2.
- Använd kommersiellt tillgänglig stamlösning av NBT/BCIP (se materialförteckning).
- Överför vågen till rör som innehåller avjoniserat vatten.
- Skölj fjällen i ALP-färgningslösning i 5 min.
- Under tiden bereds en fungerande färgningslösning genom att tillsätta 200 μL NBT/BCIP-lösningen till 10 ml ALP-färgningsbuffert. Detta måste vara nyförberett vid tidpunkten för färgning.
- Fläcka fjällen med den fungerande ALP-färgningslösningen i 15 minuter.
- Stoppa reaktionen genom att skölja fjällen med avjoniserat vatten.
4. Von KOSSA färgning på fjäll efter skörd
- Bered 5 % (vikt/volym) silvernitratlösning.
- Bered 5 % (vikt/volym) natriumtiosulfatlösning.
- Överför skördade fjäll till rör som innehåller avjoniserat vatten.
- Inkubera fjällen i silvernitratlösningen i 40 minuter under starkt ljus.
OBS: Använd PPE (personlig skyddsutrustning) eftersom silvernitrat lämnar en fläck som är svår att ta bort. - Tvätta vågen två gånger i 5 minuter med avjoniserat vatten.
OBS: Silvernitratavfall måste samlas in och kasseras enligt lokala riktlinjer. - Inkubera fjällen i natriumtiosulfat i 5 min.
- Tvätta vågen två gånger i 5 minuter med avjoniserat vatten.
5. Kolorimetrisk TRAP-färgning
OBS: För den detaljerade proceduren, se tidigare publicerat arbete18.
- Förbered färgningslösningarna.
- Bered 10 mg/ml naftol AS-MX fosfatlösning.
- Väg upp 5 mg naftol AS-MX-fosfat (se materialförteckning).
- I dragskåpet, förbered ett rör med 0,5 ml N, N'-dimetylformamid och lös upp 5 mg naftol AS-MX-fosfat i 0,5 ml N, N'-dimetylformamid för att göra en stamlösning av 10 mg/ml naftol AS-MX-fosfat (skaka försiktigt).
- Bered 1,6 mM stamlösning av Fast Red Violet LB i 50 mM natriumtartrat.
- Förbered 50 ml 0,1 M natriumacetat vid pH 5 (tillsätt 0,41015 g natriumacetat i 50 ml avjoniserat vatten och justera pH till 5 med 100 % ättiksyra).
- Lös 0,575 g dibasiskt natrium-L-tartrat dihydrat (se materialtabell) i 50 ml 0,1 M natriumacetatbuffert (pH = 5).
- Tillsätt 30 mg snabbviolett LB-salt.
- Bered PBS-0.1Tx (lös upp 500 μL Triton-X i 500 ml PBS).
- Bered PBS-0.1Tw (lös upp 500 μl Tween-20 i 500 ml PBS).
- Bered 10 mg/ml naftol AS-MX fosfatlösning.
- Förbered en fungerande TRAP-lösning.
- Blanda båda stamlösningarna i dragskåpet (0,5 ml 10 mg/ml naftol AS-MX-fosfatlösning och 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-stamlösning i 50 mM natriumtartrat).
OBS: Arbetslösningen kan nu användas utanför dragskåpet. Den kan förvaras i kylen (insvept i folie) i upp till en månad. Förvaras i separata behållare från antikroppar eller andra reagenser som är känsliga för fixeringsmedel. Håll dig borta från ljus så mycket som möjligt. - Valfritt: förbered blekningslösning (på efterfixerade prover som var TRAP-färgade) i PBS och 0,1 % Tween-20 (PBS-0,1 % Tw).
- Bered en slutlig koncentrationsblandning av 0,5 % kaliumhydroxid (KOH) (från 10 % stamlösning (vikt/volym)) och 3 % väteperoxid (H2O2) (33 % stamlösning, förvaras i kylskåp).
- Blanda båda stamlösningarna i dragskåpet (0,5 ml 10 mg/ml naftol AS-MX-fosfatlösning och 50 ml 1,6 mM Fast Red Violet LB-stamlösning i 50 mM natriumtartrat).
- Utför provfixering.
- Fixera skalor i 4 % PFA i 1x PBS och gunga eller rotera i 40 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort 4% PFA och tvätta med PBS-0.1Tx minst 3 gånger i 5 minuter varje tvätt.
- Gå direkt till TRAP-färgning (det bästa tillvägagångssättet) eller förvara i PBS-0.1 Tx över natten.
- Utför TRAP-färgning av fjällen.
- Ta bort PBS-0.1 Tx-lösningen och tillsätt den kolorimetriska TRAP-arbetslösningen (steg 5.2.1) för att täcka proverna helt (dvs. 1 ml i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör).
- Inkubera i 1-2 h vid RT, gunga i mörkret.
- Ta bort färglösningen och tvätta minst 3 gånger med PBS-0.1 Tw i 5 min varje tvätt.
- Efterfixera proverna i 4% PFA i 30 minuter vid RT, gunga försiktigt i mörkret.
- Ta bort PFA-lösningen genom att tvätta 3 gånger med PBS-0.1 Tw i 5 minuter varje steg.
OBS: Proverna kan förvaras (i förvaringslösningar/monterade på objektglas) vid 4 °C i mörker på obestämd tid.
6. Montering av färgade fjäll
- Förbered monteringsmediet genom att tillsätta 2.4 g Mowiol 4-88 kristaller till 6 g glycerol (se materialförteckning). Alla föredragna monteringsmedier kan användas.
- Tillsätt 6 ml avjoniserat vatten och låt stå i en magnetisk omrörare i en timme.
- Tillsätt 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) och inkubera vid cirka 53 °C tills Mowiolkristallerna är helt upplösta.
- Klargör lösningen genom centrifugering vid 2000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Överför lösningen till en förvaringsbehållare. Monteringsmediet kan förvaras i frysen i cirka 12 månader. Den upptinade Mowiol-lösningen är stabil i upp till 1 månad.
- Montera skalorna på ett objektglas för att montera mediet, täck dem med ett täckglas och se dem under ett mikroskop.
7. Ex vivo-odling av skalor
OBS: Detta steg är anpassat från de Vrieze et al.12.
- Innan du skördar skalorna i en steril miljö, förbered det osteogena mediet och odlingsplattan.
- Osteogent odlingsmedium (OCM): I ett sterilt centrifugrör, gör 15 ml OCM i standardcellodlingsmedium (hög glukos, ingen glutamin, ingen fenolröd) vid de slutliga koncentrationerna av 1 % bovint kalvserum, 1 % (200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85 % NaCl), 1 % antibiotika/antimykotisk lösning (100x) lösning, 4 mM CaCl2, 10 mM β-glycerofosfat, 1 nM natriumpyruvat och 1 % amfotericin B (valfritt) (se materialförteckning).
- Häll OCM i en steril reagensbehållare och tillsätt 100 μL med hjälp av en flerkanalspipett till varje brunn på 96-hålsplattan.
- Försegla 96-hålsplattan och förvara plattan. OCM kan förvaras i kylskåp under en kort period (över natten till 1 vecka) och förvaras vid 28 °C före användning.
- Utför kalkavverkning och PBS-tvätt.
- Skörda fjällen med en steril pincett/pincett och lägg dem i en petriskål som innehåller en steril PBS-lösning.
- Utför plattinställning.
- Överför varje våg från petriskålen till varje brunn på plattan med 96 hål med 100 μL OCM (uppvärmd till 28 °C) med en steril pincett.
- När alla fjäll har överförts till plattan, ta plattan under ett stereomikroskop. Använd en fin, steril pipettspets för att försiktigt flytta varje skala till botten av brunnen och håll dem borta från sidan av brunnarna för att undvika ljusreflektion under bildtagningen.
OBS: Detta steg krävs endast om du utför live-avbildning. - Överför försiktigt plattan till inkubatorn eller Live Imaging System (LIS, se materialtabell) (inställd på 28 °C, 5 % CO2), där fjällen kan odlas i upp till 7 dagar.
- Uppdatera OCM (valfritt).
- Värm OCM som förvarats i kylen till 28 °C.
- Överför försiktigt 96-hålsplattan till en steril miljö. Använd en flerkanalspipett och aspirera 50 μL från varje brunn. För detta, tryck spetsarna mot väggarna och doppa dem inte förrän i botten för att undvika att aspirera/flytta/ta bort fjällen. Använd nya tips för olika tillstånd.
- Häll OCM i en steril reagensbehållare och använd flerkanalspipetten för att tillsätta 60 μL OCM till varje brunn.
- Placera plattan under stereomikroskopet och kontrollera om det finns felplacerade skalor (för nära väggarna, flytande eller i vertikalt läge i mediet). Placera om dem med en fin, steril pipettspets om det behövs.
- Sätt tillbaka plattan i inkubatorn/LIS.
OBS: Uppdatera inte mediet om experimentet involverar dygnsrytm (CR), eftersom serumchock kan påverka den biologiska klockan. Observera att om du studerar CR noterar du att ljusförhållandena också återställer klockan.
- Utför färgning och avbildning efter odling (valfritt).
- Efter 6 dagars odling, fixera dem och rikta dem för lämplig färgning som von Kossa och ALP som nämns ovan.
- Alternativt, om försöksfisken har en fluorescerande märkning, placera plattan i ett levande bildsystem.
OBS: Om du använder ett live-bildsystem, se till att det är inställt på en temperatur och CO2 -nivå som är lämplig för experimentet. Vanligtvis användes 28 °C och 5 % CO2 i denna studie. Välj lämpliga filter och avbildningstidpunkter (här användes ett intervall på 2 eller 4 timmar, vilket är tillräckligt för att följa osteoblastmigrationen) och lågförstoringsmål (dvs. 4x) för att säkerställa jämn avbildning av hela brunnarna. Detta beror på att fjällen tenderar att röra sig inuti brunnarna, särskilt under medieförändringar.
Representative Results
Regenerering av kalkavlagringar
Fjällregenerering kan spåras med ett vanligt fluorescerande stereomikroskop genom att avbilda zebrafiskens flank. Figur 3A visar förändringar i fjällens sp7/osx-uttryck under fjällregenerering hos en 4 månader gammal zebrafisk. Tidpunkter för flankavbildning som visas i figur 3A är ontogenetiska (ursprungliga fjäll, före skörd), dag 2, dag 4 och dag 10 efter skörd. Vi använder vanligtvis osx (även känd som osterix eller sp7) transgena linjer (antingen som en GFP (Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19 eller mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17 för att spåra förändringar i skelettsystemet eftersom det märker benbildande osteoblaster. Tidig mönstring av nybildade fjäll kan ses på 2 dagars föryngring. Detta tidiga mönster av avlagringar störs i vissa fall, särskilt hos skelettmutanter. Genom att följa föryngringens förlopp kan man analysera regenereringens kapacitet och hastighet. På skördedagen kan individuell avbildning av skördade fjäll utföras efter flankavbildning med hjälp av samma stereomikroskop, som visas i figur 3B. Regenererade fjäll har mycket högre osx-uttryck jämfört med dag 0 ontogenetiska skalor eftersom osteoblaster krävs för den nya benbildningen.
Kultur i ex vivo-skala
Även om man kan studera de novo-benbildningsprocessen genom att spåra regenereringsprocessen på fiskens flank, kan vi också använda denna modell för att studera reparation och läkning av skelettskador med ex vivo-skalkultur genom att göra en skada på fjällen med en skalpell. Med hjälp av ett live-bildsystem kan reparationen spåras i realtid. Figur 4 visar ett representativt resultat av ett skadeläkningssvar på ontogenetisk skala på 3 dagar i en odling där osteoblasterna är märkta med osx: mCherry. Skadestället som visas av infällningarna i början av odlingen visar ett tydligt gap mellan osteoblaster och skalcirkuler (Figur 4A). Man kan övervaka migrationen av osteoblaster mot skadestället med time-lapse-avbildning. Efter 3 dagar i odling minskar bredden på gapet och uttrycket avosx kan ses mellan gapet och den nybildade skalcirculi (Figur 4B). Dessutom är morfologin när det gäller formen på osteoblasterna mer cirkulär i början av kulturen och efter 3 dagar är den mer långsträckt. Denna förändring i osteoblasternas utseende beror troligen på att de är i odling och inte i sin naturliga miljö (fäst vid fisken).
Figur 1: Exempel på avbildningsalternativ för vågar. Osteoblaster kan visualiseras med osx/sp7 transgena reporterlinjer (antingen i GFP eller mCherry). ALP-färgning kan användas för att visa osteoblastaktiviteten. TRAP-färgning kan visa aktiviteten hos osteoklaster. Alizarinrött (AR) och Calceingrönt är båda färgämnen som kan användas i levande fisk; AR etiketterar mineralisering och Calcein etiketterar nybildat ben. Mineraliseringens omfattning kan också påvisas med von Kossa-färgning. Skalstaplar: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk illustration av ett experiment för föryngring av skala. Allmän schematisk bild av ett skalföryngringsförsök som visar att fisken separeras i enskilda bassänger före försöket. Längd, kön och hälsa registreras. Schemat visar också det föreslagna området på fiskens flank för att skörda fjäll och föreslagna avbildningstidpunkter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av osterixuttryck (för att visualisera osteoblaster) under fjällregenerering tagna från en 4 månader gammal zebrafisk. (A) Flankbilderna tagna på dag 0 (före skörd, ontogenetiska skalor), 2 dph (dagar efter skörd) dag 2, 4 dph och 10 dph för att spåra förändringar i osx-uttrycket . Skalstreck: 1 mm. (B) Representativa bilder av ett ontogenetiskt fjäll och ett fjäll vid 10 dph tagna från samma fisk som i panel (A). Lägg märke till de ökade nivåerna av osx-uttryck som visas i magenta i mitten av de regenererande skalorna. Skalstaplar: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av reparationsrespons på skelettskada på ontogenetisk skala som fångats från en 4 månader gammal zebrafisk med hjälp av ett levande bildsystem. A) Ontogenetiska fjäll med en skada orsakad av skalpell samma dag som skörden (tidpunkt 0/dag0) av kulturen. (B) Samma skala visas 3 dagar efter skadan. Infälld bild visar skadeområdet. Skalstaplar: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Zebrafiskens elasmoidfjäll, som en ny modell för skelettforskning, har stor potential att hjälpa oss att förstå benunderhåll, regenerering och skadereparation. Överflödet av fjäll på fisk möjliggör screening av föreningar med medelhög till hög genomströmning, samtidigt som antalet djur som används minskar och den inomindividuella variationen begränsas. Här presenteras protokoll för skalregenerering och ex vivo-skalkultur för att studera regenerering och reparation.
Några kritiska steg måste övervägas när du följer detta protokoll. Det är viktigt att försiktigt avlägsna fjällen, särskilt när man använder en transgen reporterlinje för att begränsa störningen av cellpopulationen som orsakas av skörden. Om jämförelser ska göras med ontogenetiska fjäll, se till att regionen inte innehåller spontant regenererande fjäll (som naturligt kan uppstå under fiskens livslängd). Se till att miljön och utrustningen är sterila för ex vivo-odling för att uppnå optimal cellöverlevnad och minimal infektion i odlingen.
Beroende på den specifika forskningsfrågan kan anpassningar göras i protokollet, till exempel genom att kombinera olika transgena reporterlinjer för att visualisera andra celltyper av genuttrycksprofiler under regenerering och reparation11,14.
Det breda utbudet av färgning man kan utföra på vågen innebär att man för varje testad förening eller tillstånd kan titta på dess effekter på benet från olika vinklar; medan sp7/osx-reportrar kan visa osteoblastnummer, ALP-färgning kan visualisera osteoblastaktivitet, TRAP-färgning kan visualisera osteoklastaktivitet, Calcein-grön levande färgning kan märka nybildat ben och Alizarin-röd eller von Kossa-färgning kan visa skalmineralisering. Luciferasaktivitet för att kvantifiera osteoblaster kan också användas12. I kombination med dessa färgningstekniker kan man lära sig det relativa bidraget från osteoblaster och osteoklaster till en given beneffekt. Fjällen saknar osteocyter, som är vanliga i däggdjursben och är de viktigaste drivkrafterna för benmekanosensorisk respons; Skalreparation och regenerering i denna modell drivs främst av osteoblaster med efterföljande remodellering av osteoklaster 8,9. Det är viktigt att notera att variation förekommer mellan individer ochåldersgrupper 20 år. För att minimera detta måste fjällskördsområdet vara konstant, eftersom olika platser kan ge upphov till olika fjällmorfologier, och fisk från samma syskongrupper används så att ålder och storlek är konsekventa. Men eftersom flera fjäll kan skördas per fisk kan man köra fler experiment med färre fiskar, vilket minskar den inomindividuella variabiliteten.
Sammanfattningsvis visar dessa protokoll experimentella tekniker som kan tillämpas på ontogenetiska och regenererande skalor. Sammanfattningsvis visar elasmoidfjäll stor potential som en skelettmodell för att hjälpa till att förstå benbildning och reparation; och kommer att bidra till att minska djuranvändningen för screening av osteoanabola föreningar med hög kapacitet.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mathew Green från Animal Service Unit för fiskuppfödning och Katy Jepson från Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB och QT finansierades av Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044), RR finansierades av (NHMRC APP1158758). Detta arbete stöddes också av BBSRC-bidraget (BB/T001984/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
- Tobias, J. H., et al. Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).
- Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. Zebrafish: An emerging model for orthopedic research. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).
- Dietrich, K., et al. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).
- McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish. JBMR Plus. 5 (3), 10461 (2021).
- Sehring, I., Weidinger, G. Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758 (2022).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).
- Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, 37001 (2018).
- Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).
- Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research. Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).
- Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone. Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
- De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales. PLoS One. 9 (2), 89347 (2014).
- Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biology. 20 (1), 21 (2022).
- Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. Journal of Bone and Mineral Research. , John Wiley and Sons Inc. (2022).
- Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).
- Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
- Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity. European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369 (2022).
- DeLaurier, A., et al. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505 (2010).
- Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates. Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).
