Оптимизированный автоматизированный анализ модуляции гомеостаза митохондрий живых нейронов изоформ-специфическими рецепторами ретиноевой кислоты
Summary
Митохондриальная сеть чрезвычайно сложна, что делает ее очень сложной для анализа. Новый инструмент MATLAB анализирует митохондрии с конфокальными изображениями в реальном времени на таймлапс-изображениях, но приводит к большому объему вывода, требующему индивидуального ручного вмешательства. Для решения этой проблемы была разработана рутинная оптимизация, позволяющая быстро анализировать файлы.
Abstract
Сложная митохондриальная сеть делает очень сложной сегментацию, отслеживание и анализ живых клеток. Инструменты MATLAB позволяют анализировать митохондрии в таймлапс-файлах, значительно упрощая и ускоряя процесс обработки изображений. Тем не менее, существующие инструменты выдают большой объем выходных данных, требующий индивидуального ручного вмешательства, а базовые экспериментальные установки позволяют выводить тысячи файлов, каждый из которых требует длительной и трудоемкой обработки.
Для решения этих проблем была разработана рутинная оптимизация, как в коде MATLAB, так и в формах live-script, что позволило ускорить анализ файлов и значительно сократить чтение документов и обработку данных. Со скоростью 100 файлов/мин оптимизация позволяет проводить общий быстрый анализ. Оптимизация позволяет получить результаты путем усреднения данных, специфичных для отдельных митохондрий, за все периоды времени, анализируя данные определенным образом, в соответствии с результатами, полученными существующими инструментами. Конфокальную визуализацию в реальном времени проводили с использованием метилового эфира красителя тетраметилродамина, а рутинная оптимизация была подтверждена путем обработки нейрональных клеток агонистами рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), влияние которых на митохондрии нейронов установлено в литературе. Полученные результаты согласовывались с литературными данными и позволили в дальнейшем охарактеризовать поведение митохондриальной сети в ответ на изоформ-специфическую модуляцию RAR.
Эта новая методология позволила быстро и достоверно охарактеризовать сеть митохондрий целых нейронов, а также дифференцировать митохондрии аксонов и митохондрий клеточного тела, что является важной функцией для применения в области нейробиологии. Более того, этот протокол может быть применен к экспериментам с использованием быстродействующих методов лечения, позволяя визуализировать одни и те же клетки до и после лечения, выходя за рамки области неврологии.
Introduction
Клеточные митохондрии находятся в центре всех физиологических состояний, и глубокое понимание их гомеостаза (митостаза) и поведения имеет первостепенное значение для помощи в определении фармакологического лечения широкого спектра заболеваний, включая раки болезнь Альцгеймера.
Митохондрии играют важнейшую клеточную роль в энергетическом гомеостазе, выработке АТФ, буферизации кальция и регуляции АФК, а митостаз необходим для поддержания белкового гомеостаза, поскольку молекулярные шапероныэнергетически зависимы. Они требуют постоянной и динамической модуляции и адаптации сети для эффективного удовлетворения клеточных потребностей, а транспорт митохондрий регулируется различными сигнальными путями; В предыдущей работе был описан один из таких путей — рецепторы ретиноевой кислоты (RARs)4,5. Ретиноевая кислота (РА) способствует росту аксонов и нейритов путем активации RAR. В первичных корковых нейронах мыши активация RAR-β стимулирует рост, скорость и подвижность митохондрий в нейрите6.
Учитывая адаптивность и динамику митохондриальной сети, возможность оценки митостаза в «реальном времени» имеет важное значение не только для исследования энергетического гомеостаза, но и для протеостаза, клеточного здоровья, пролиферации или передачи сигналов. Широко используемый метод оценки митостаза основан на конфокальной микроскопии после выделения митохондрий с помощью флуоресцентного красителя или маркера, а также на специальной микроскопической установке, позволяющей регулировать температуру и/илиCO2 7. Этот тип экспериментальной установки подразумевает, что за один раз выполняется одна экспериментальная репликация. В дополнение к экспериментальному повторению различных методов лечения, следует учитывать, что большинство экспериментов должны иметь свои технические повторы (когда на пластину изображается более одного положения), с серией фокальных плоскостей (z-стеков), записываемых в ряд временных точек. Таким образом, экспериментальный дизайн с тремя повторениями одного контрольного и двух сеансов обработки, с пятью позициями визуализации на пластину и 15 временными точками, приводит к 225 стопкам для обработки. Как правило, видеозаписи живых митохондрий анализировались путем построения кимографов, которые анализировались индивидуально8, в трудоемком процессе, требующем большого количества ручного ввода, даже при использовании компьютерных инструментов.
Недавнобыл описан алгоритм, который позволяет автоматически сегментировать и отслеживать митохондрии в 2-D и 3-D таймлапс-файлах живых клеток. Существуют и другие методы количественной оценки, и все они имеют свои ограничения10. Mitometer, автоматизированное приложение с открытым исходным кодом, особенно подходит для анализа интервальной съемки и динамики митохондрий, требующего минимального участия пользователя. Это приложение имеет ряд преимуществ по сравнению с другими существующими инструментами на основе MATLAB, а именно, позволяет автоматически обрабатывать отдельные стеки TIF, используя до 13 различных параметров, что особенно интересно для нейронаук, поскольку оно различает пери- и телеядерные митохондрии.
Однако для эксперимента, подобного описанному выше, эти 13 параметров, примененных к 225 стекам, приводят к 2925 отдельным выходным файлам. Для этого требуется четыре отдельных компьютерных входа, что в сумме составляет более 10 000 ручных входов, необходимых для загрузки всех выходных файлов. Для крупных экспериментальных проектов это приводит к неоправданно трудоемкому анализу каждого файла и интеграции данных. Здесь мы представляем рутинную оптимизацию, которая позволяет быстро анализировать файлы, значительно сокращая чтение документов и обработку данных, анализируя данные определенным образом, в соответствии с результатами существующих инструментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация живых клеток позволяет создавать большие файлы, которые требуют серьезной вычислительной обработки, но даже самые современные инструменты требуют большого количества ручного ввода для обработки. Эта рутинная оптимизация направлена на упрощение процесса анализа митохо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Получение изображений было выполнено на объекте LiM iBiMED, узле PPBI (Португальская платформа биовизуализации): POCI-01-0145-FEDER-022122. Эта работа была поддержана FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), грантом DT от Fundação para a Ciência e Tecnologia Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), грантом ATG-The Gabba Alumni Association для вице-президента и Институтом биомедицины iBiMED, Университет Авейру.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
