İzoforma Özgü Retinoik Asit Reseptörleri ile Canlı Nöronal Mitokondri Homeostaz Modülasyonunun Optimize Edilmiş Otomatik Analizi
Summary
Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.
Abstract
Karmaşık mitokondriyal ağ, canlı hücreleri segmentlere ayırmayı, takip etmeyi ve analiz etmeyi çok zorlaştırır. MATLAB araçları, timelapse dosyalarında mitokondrinin analizine izin vererek görüntü işleme sürecini önemli ölçüde basitleştirir ve hızlandırır. Bununla birlikte, mevcut araçlar, bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmi üretir ve temel deney kurulumları, her biri kapsamlı ve zaman alıcı işlem gerektiren binlerce dosyadan oluşan bir çıktıya sahiptir.
Bu sorunları ele almak için, hem MATLAB kodunda hem de canlı komut dosyası formlarında, hızlı dosya analizine olanak tanıyan ve belge okuma ve veri işlemeyi önemli ölçüde azaltan rutin bir optimizasyon geliştirildi. 100 dosya/dk hızıyla optimizasyon, genel olarak hızlı bir analize izin verir. Optimizasyon, zaman dilimleri boyunca bireysel mitokondri için çerçeveye özgü verilerin ortalamasını alarak, verileri mevcut araçlardan elde edilen çıktılarla tutarlı olarak tanımlanmış bir şekilde analiz ederek sonuç çıktısını elde eder. Tetrametilrodamin metil ester boyası kullanılarak canlı konfokal görüntüleme yapıldı ve nöronal mitokondri üzerindeki etkileri literatürde ortaya konan retinoik asit reseptörü (RAR) agonistleri ile nöronal hücrelerin tedavi edilmesiyle rutin optimizasyon doğrulandı. Sonuçlar literatürle tutarlıydı ve izoforma özgü RAR modülasyonuna yanıt olarak mitokondriyal ağ davranışının daha fazla karakterizasyonuna izin verdi.
Bu yeni metodoloji, tüm nöron mitokondri ağının hızlı ve doğrulanmış karakterizasyonuna izin verdi, ancak aynı zamanda sinirbilim alanında uygulanacak önemli bir özellik olan akson ve hücre gövdesi mitokondrileri arasında farklılaşmaya da izin veriyor. Ayrıca, bu protokol, hızlı etkili tedaviler kullanan deneylere uygulanabilir ve tedavilerden önce ve sonra aynı hücrelerin görüntülenmesine izin vererek, sinirbilim alanını aşar.
Introduction
Hücresel mitokondri, tüm fizyolojik durumların merkezinde yer alır ve kanser ve Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklar için farmakolojik tedavinin belirlenmesine yardımcı olmak için homeostazlarının (mitostaz) ve davranışlarının tam olarak anlaşılması çok önemlidir 1,2.
Mitokondri, enerji homeostazı, ATP üretimi, kalsiyum tamponlama ve ROS regülasyonunda çok önemli hücresel roller oynar ve moleküler şaperonlar enerjiye bağımlı olduğundan protein homeostazını korumak için mitostaz gereklidir3. Bunlar, hücresel ihtiyaçları verimli bir şekilde karşılamak için sabit ve dinamik bir ağ modülasyonu ve adaptasyonu gerektirir ve mitokondri taşınması farklı sinyal yolları tarafından düzenlenir; önceki çalışma, retinoik asit reseptörlerinin (RAR’lar) böyle bir yolunu tanımlamıştır4,5. Retinoik asit (RA), RAR aktivasyonu yoluyla aksonal ve nörit büyümesini teşvik eder. Fare primer kortikal nöronlarında, RAR-β’in aktivasyonu, nöritte mitokondriyal büyümeyi, hızı ve hareketliliği teşvik eder6.
Mitokondriyal ağ uyarlanabilirliği ve dinamikleri göz önüne alındığında, mitosazın “gerçek zamanlı” olarak değerlendirilmesi olasılığı sadece enerji homeostazını araştırmak için değil, aynı zamanda proteostaz, hücresel sağlık, proliferasyon veya sinyalizasyon için de gereklidir. Mitostazın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, bir floresan boya veya işaretleyici kullanarak mitokondriyi vurguladıktan sonra konfokal mikroskopiye ve ayrıca sıcaklık ve/veya CO2 regülasyonuna izin veren özel bir mikroskopi kurulumunadayanır 7. Bu tür bir deney düzeneği, bir seferde bir deneysel kopyanın gerçekleştirilmesini gerektirir. Farklı tedavilerin deneysel tekrarına ek olarak, çoğu deneyin teknik kopyalarına (plaka başına birden fazla konumun görüntülendiği) sahip olması gerektiği ve bir dizi odak düzleminin (z-yığınları) bir dizi zaman noktasında kaydedilmesi gerektiği düşünülmelidir. Böylece, bir kontrol ve iki tedavinin üç tekrarı, plaka başına beş görüntüleme pozisyonu ve 15 zaman noktası ile deneysel bir tasarım, işlenecek 225 yığınla sonuçlanır. Klasik olarak, canlı mitokondri videoları, bilgisayar araçlarına güvenirken bile, kapsamlı manuel girdi gerektiren zaman alıcı bir süreçte, ayrı ayrı analiz edilecek olan kimograflarçizilerek analiz edildi 8.
Canlı hücreli 2 boyutlu ve 3 boyutlu hızlandırılmış dosyalarda mitokondrinin otomatik segmentasyonuna ve izlenmesine izin veren bir algoritmayakın zamanda 9 tanımlandı. Diğer niceleme teknikleri mevcuttur ve hepsinin sınırlamalarıvardır 10. Otomatik açık kaynaklı bir uygulama olan Mitometer, özellikle düşük kullanıcı girdisi gerektiren hızlandırılmış ve mitokondri dinamiği analizi için yeterlidir. Bu uygulamanın, diğer mevcut MATLAB tabanlı araçlara göre bir dizi avantajı vardır, yani, peri- ve tele-nükleer mitokondri arasında ayrım yaptığı için özellikle sinirbilimleri için ilginç olan 13 farklı parametreye kadar bireysel TIF yığınlarının otomatik olarak işlenmesine izin verir.
Ancak, yukarıda açıklanan gibi bir deney için, 225 yığına uygulanan bu 13 parametre, 2.925 ayrı çıktı dosyasıyla sonuçlanır. Bunlar, tüm çıktı dosyalarını indirmek için gereken 10.000’den fazla manuel girişe kadar toplam dört ayrı bilgisayar girişi gerektirir. Büyük deneysel tasarımlar için bu, her dosyanın gereksiz yere son derece zaman alıcı bir analizine ve veri entegrasyonuna neden olur. Burada, hızlı dosya analizine izin veren, belge okumayı ve veri işlemeyi büyük ölçüde azaltan, verileri mevcut araçlardan elde edilen çıktılarla tutarlı olarak tanımlanmış bir şekilde analiz eden rutin bir optimizasyon sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı hücre görüntüleme, ciddi bilgi işlem gerektiren büyük dosyalar üretir, ancak en yeni araçlar bile işlemek için kapsamlı manuel girdi gerektirir. Bu rutin optimizasyon, Mitometre’de mitokondri analizi sürecini basitleştirmeye odaklanmıştır çünkü bu araç, kullanıcı girdisi ve veri çıkışı arasında çok iyi bir denge sunar. Mitokondri görüntü analizi için farklı araçlar arasında kapsamlı bir karşılaştırma daha önce gözden geçirilmiştir10. Diğer boru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Görüntü alımı, PPBI’nin (Portekiz Biyogörüntüleme Platformu) bir düğümü olan iBiMED’in LiM tesisinde gerçekleştirildi: POCI-01-0145-FEDER-022122. Bu çalışma, Ministério da Educação e Ciência’nın Fundação para a Ciência e Tecnologia’sından DT’ye bir hibe olan FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) tarafından desteklenmiştir (2020.02006.CEECIND), ATG-Gabba Mezunlar Derneği’nden VP’ye bir hibe ve Aveiro Üniversitesi Biyotıp Enstitüsü-iBiMED.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
