Venøs tromboseanalyse i en musemodell av kreft

Summary

Denne artikkelen tar sikte på å presentere en optimalisert metode for å vurdere venøs trombose i en musekreftmodell, ved hjelp av vaskulære klipp for å oppnå venøs ligering. Optimalisering minimerer variasjonen i tromboserelaterte målinger og øker relevansen for human kreftassosiert venetrombose.

Abstract

Denne metodeartikkelen fremhever de kirurgiske nyansene til en gnagermodell av venøs trombose, spesielt i sammenheng med kreftassosiert trombose (CAT). Dyp venøs trombose er en vanlig komplikasjon hos kreftoverlevende og kan være potensielt dødelig. De nåværende murine venøse trombosemodellene involverer vanligvis en fullstendig eller delvis mekanisk okklusjon av den dårligere vena cava (IVC) ved hjelp av en sutur. Denne prosedyren induserer en total eller delvis stasis av blod og endotelskader, som utløser trombogenese. De nåværende modellene har begrensninger som høyere variasjon i koagulasjonsvekter, signifikant dødelighet og langvarig læringskurve. Denne rapporten introduserer kirurgiske forbedringer ved hjelp av vaskulære klips for å løse noen av disse begrensningene. Ved hjelp av en syngen kolonkreft xenograft musemodell, benyttet vi tilpassede vaskulære klipp for å ligere den infrarenale vena cava. Disse klipsene tillater gjenværende leppeplass som ligner på en 5-0 polypropylen sutur etter IVC-ligeringer. Mus med suturmetoden fungerte som kontroller. Den vaskulære klipsmetoden resulterte i en konsistent reproduserbar partiell vaskulær okklusjon og større koagulasjonsvekter med mindre variabilitet enn suturmetoden. De større koagulasjonsvektene, større koagulasjonsmasse og koagulering til IVC-luminaloverflaten var forventet på grunn av den høyere trykkprofilen til vaskulære klemmer sammenlignet med en 6-0 polypropylensutur. Tilnærmingen ble validert med gråskala ultralyd, som viste gjennomgående større koagulasjonsmasse i infrarenal vena cava med vaskulære klips sammenlignet med suturmetoden. Disse observasjonene ble ytterligere underbygget med immunfluorescensfargingen. Denne studien gir en forbedret metode for å generere en venøs trombosemodell hos mus, som kan brukes til å utdype den mekanistiske forståelsen av CAT og i translasjonsforskning som narkotikaforskning.

Introduction

Kreftassosiert venøs tromboembolisme (VTE)
Venøs tromboembolisme (VTE) risiko er 4 til 7 ganger høyere hos kreftoverlevende sammenlignet med den generelle befolkningen ^1,2,3. Denne tilstanden viser seg å være dødelig hos en av syv pasienter med kreft. Forekomsten av VTE varierer avhengig av type kreft og tumorbyrde og er høyest blant pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og mage⁴.

Kreftassosiert VTE hos kreftpasienter har prognostisk betydning. Det er forbundet med ugunstig total overlevelse i det første året etter en kreftdiagnose, selv etter justering for alder, rase og stadium av underliggende kreft⁵. Disse funnene fremhever viktigheten av å undersøke kreftassosiert VTE og behovet for å undersøke mekanismen ved hjelp av en dyremodell. Den translasjonelle relevansen av dette området understrekes ytterligere av det faktum at VTE hos kreftpasienter kan forebygges og behandles med tromboseprofylakse og antitrombotisk behandling⁶.

Dyremodeller av kreft og venøs trombose
Kreftmodeller kalles konvensjonelt xenotransplantater, som innebærer injeksjon av kreftceller i mus. Injeksjonen av kreftceller på et sted som opprinnelsen blir referert til som en ortotopisk modell, mens på et annet sted (subkutant plan over flanken) er kjent som en heterotopisk modell. Kreftcellenes opprinnelsesart bestemmer dem som en allogen modell, slik som HT-29-cellelinjen (human tykktarmskreft)^7,8,9. Tvert imot bruker syngene modeller murine kreftcellelinjer, inkludert RenCa og MC-38 cellelinjer ^3,10.

Litteraturen har beskrevet arterielle, venøse og kapillære trombosemodeller hos gnagere. Venøs trombose induseres i den dårligere vena cava (IVC) ved mekanisk skade (ledetråd) eller fullstendig IVC-ligering, kjemisk (jernklorid) eller elektrolytisk skade. Jernkloridindusert trombose eller IVC-ligering representerer komplette okklusjonsmodeller. Sistnevnte resulterer i stasis av blod og inflammatoriske infiltrater i venene^11,12,13. Den komplette ligeringsmodellen resulterer i en høy grad av trombosedannelse hos 95% til 100% av musene. Den partielle IVC-ligeringsmodellen kan inkludere avbrudd av laterale iliolumbargrener, og venøs retur oppheves ved å anvende suturligasjoner i de distale målpunktene til IVC¹². Noen ganger brukes en plassholder til å avbryte venøs retur delvis. Imidlertid er trombusvekten inkonsekvent i den nåværende partielle okklusjonsmodellen, noe som resulterer i høy variasjon i koagulasjonsvekter og høyder^12,14.

Begge disse store venemekaniske modellene (delvis og fullstendig) har begrensninger. For det første resulterer IVC-ligering (stasemodell) ofte i hypotensjon. Blodet blir shunted gjennom vertebrale vener. Selv om det er i erfarne hender, varierer dødeligheten med denne modellen fra 5% -30%, med den høyere frekvensen forventet under læringskurven. Det er viktig at den komplette okklusjonsmodellen ikke reproduserer dyp venetrombose (DVT) hos mennesker, hvor en trombose vanligvis ikke er okklusiv. Fullstendig okklusjon vil sannsynligvis endre hemoreologiske faktorer og farmakodynamiske parametere, og endre biotilgjengeligheten av forbindelser på det lokale stedet. På grunn av disse begrensningene kan det hende at komplette okklusjonsmodeller ikke er optimale for testing av nye kjemiske forbindelser for terapeutiske formål og narkotikafunn¹².

Det skal bemerkes at for å gi en mer klinisk relevant murine modell av venøs trombose med redusert strømning med endotelskade, er det innført en venøs trombosemodell, hvor DVT utløses av begrensning av blodstrømmen i fravær av endotelforstyrrelser. Modellen ble validert ved skanning elektronmikroskopi¹⁵. En foretrukket klinisk relevant trombosemodell er en med nesten fullstendig trombose som muliggjør legemiddelfunn. Koagulasjonsdannelsen i dagens partielle okklusjonsmodeller er inkonsistent, noe som resulterer i høy variasjon i koagulasjonsvekt og -høyder^12,16. Videre er koagulasjonsvekten variabel med de konvensjonelle metodene, og krever flere mus per studie¹².

Tidligere kreftassosierte trombosemodeller fokuserte på tykktarms-, bukspyttkjertel- og lungekreft og var alle komplette okklusjonsmodeller^17,18,19. Dette manuskriptet modifiserer modellen for partiell okklusjon trombose for å gi blodpropper med lavere variabilitet og musemortalitet (figur 1). Tidligere studier brukte allogene kreftcellelinjer på immunkompromitterte atymiske mus bakgrunn 19,20,21. Dette manuskriptet bruker et MC-38-cellesyngent xenograft i C57Bl6/J-mus, som tillater bruk av immunkompetente mus og undersøkelse av immunkomponenter mot trombogenese.

Protocol

For denne studien ble 16 kvinnelige C57Bl6 / J-mus, 8-12 uker i alderen og en kroppsvekt på 20 til 25 g brukt. Musene ble plassert under vanlige forhold og ble matet med chow og vann ad libitum. Denne studien ble utført med godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston University. De åpne prosedyrene som er beskrevet her, ble utført i steril tilstand. 1. Xenograft-modellen CellekulturFør heterotopisk subkutan impl…

Representative Results

En gruppe kvinnelige C57Bl6/J-mus, 8-12 ukers alder, ble injisert med MC-38-celler i den logaritmiske fasen av celleveksten. Xenotransplantatene vokste raskt mellom tredje og fjerde uke etter injeksjon18. Når svulstene nådde et gjennomsnittlig volum på 400 mm3, ble mus randomisert til kontroll- og eksperimentgruppene. Kontrollgruppen gjennomgikk IVC-ligering med sutur, mens de eksperimentelle musene ble utsatt for IVC-ligering med vaskulær klipsapplikasjon. Tumorvolumene i kontroll-…

Discussion

I en syngen xenograft kolonkreftmodell observerer vi høyere trombogenisitet og uttrykk av koagulasjonsmarkører i eksperimentgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Det er viktig at variansen i alle disse parametrene var lavere i eksperimentgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Modifikasjonen innebar å introdusere en vaskulær klips med en spesifikk trykkprofil ved konfluenspunktet til IVC og venstre nyrevene. Klippet ble plassert over et avstandsstykke, som var en 5-0 polypropylen sutur. Denne modifikasjonen red…

Materials

Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors – Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01