癌症小鼠模型中的静脉血栓形成测定
Summary
本文旨在提出一种优化的评估小鼠癌症模型中静脉血栓形成的方法，使用血管夹实现静脉结扎。优化可最大限度地减少血栓形成相关测量的变异性，并增强与人类癌症相关静脉血栓形成的相关性。
Abstract
本文重点介绍了静脉血栓形成啮齿动物模型的手术细微差别，特别是在癌症相关血栓形成 （CAT） 的背景下。深静脉血栓形成是癌症幸存者的常见并发症，可能致命。目前的小鼠静脉血栓形成模型通常涉及使用缝合线完全或部分机械闭塞下腔静脉 （IVC）。该过程会引起血液和内皮损伤的全部或部分淤滞，从而引发血栓形成。目前的模型存在局限性，例如凝块重量的变异性较高、死亡率高和学习曲线延长。本报告介绍了使用血管夹的手术改进，以解决其中一些局限性。使用同基因结肠癌异种移植小鼠模型，我们采用定制的血管夹来结扎肾下腔静脉。这些夹子允许残留唇部空间，类似于 IVC 结扎后的 5-0 聚丙烯缝合线。用缝合法的小鼠作为对照。与缝合法相比，血管夹法可产生一致的可重复的部分血管闭塞和更大的凝块重量，且变异性更小。由于与 6-0 聚丙烯缝合线相比，血管夹的压力分布更高，因此预计会出现更大的凝块重量、更大的凝块质量和 IVC 管腔表面积的凝块。该方法通过灰度超声检查得到验证，与缝合方法相比，使用血管夹显示肾下腔静脉中的凝块质量始终更大。免疫荧光染色进一步证实了这些观察结果。本研究提供了一种改进的方法来生成小鼠静脉血栓形成模型，可用于加深对CAT的机制理解和药物发现等转化研究。
Introduction
癌症相关性静脉血栓栓塞症 （VTE）
与一般人群相比，癌症幸存者的静脉血栓栓塞 （VTE） 风险高 4-7 倍 1,2,3。这种情况在七分之一的癌症患者中被证明是致命的。静脉血栓栓塞的发病率因癌症类型和肿瘤负荷而异，在胰腺癌和胃癌患者中最高4.
癌症患者癌症相关性静脉血栓栓塞具有预后意义。它与癌症诊断后第一年的不良总生存期有关，即使在调整了潜在癌症的年龄、种族和分期后也是如此5。这些发现强调了检查癌症相关VTE的重要性，以及使用动物模型探索其机制的必要性。癌症患者的静脉血栓栓塞可以通过血栓预防和抗血栓治疗来预防和治疗，这一事实进一步强调了该领域的转化相关性6。
癌症和静脉血栓形成的动物模型
癌症模型通常被称为异种移植物，需要在小鼠体内注射癌细胞。癌细胞在其起源部位的注射被称为原位模型，而在不同的部位（侧腹的皮下平面）被称为异位模型。癌细胞的起源物种将它们确定为同种异体模型，例如 HT-29 细胞系（人结肠癌）7,8,9。相反，同基因模型使用小鼠癌细胞系，包括 RenCa 和 MC-38 细胞系 3,10。
文献描述了啮齿动物的动脉、静脉和毛细血管血栓形成模型。下腔静脉血栓形成由机械损伤（导丝）或完全 IVC 结扎、化学（氯化铁）或电解损伤诱发。氯化铁诱导的血栓形成或IVC结扎术代表了完整的闭塞模型。后者导致血液淤滞和静脉中的炎症浸润11,12,13。完整的结扎模型导致95%至100%小鼠的高血栓形成率。部分 IVC 结扎模型可能包括髂外侧分支的中断，并且通过在 IVC12 的远端靶点进行缝合结扎来消除静脉回流。有时，使用空间支架来部分中断静脉回流。然而，血栓重量在当前的部分闭塞模型中不一致，导致凝块重量和高度的高度变化12,14。
这两种大静脉力学模型（部分和完整）都有局限性。首先，IVC结扎（淤滞模型）通常会导致低血压。血液通过椎静脉分流。虽然在有经验的人手中，但该模型的死亡率在 5%-30% 之间，预计在学习曲线期间的死亡率会更高。重要的是，完整的闭塞模型不会在人类中重现深静脉血栓形成 （DVT），其中血栓通常是非闭塞性的。完全闭塞可能会改变血液流变学因素和药效学参数，从而改变局部部位化合物的生物利用度。由于这些局限性，完整的闭塞模型可能不是测试用于治疗目的和药物发现的新型化合物的最佳选择12。
应该注意的是，为了提供更具临床相关性的静脉血栓形成小鼠模型，该模型具有内皮损伤导致的血流减少，引入了静脉血栓形成模型，其中在没有内皮破坏的情况下，血流受限引发了DVT。通过扫描电子显微镜对模型进行了验证 15.首选的临床相关血栓形成模型是具有近乎完全血栓形成的模型，以便能够发现药物。当前部分闭塞模型中的凝块形成不一致，导致凝块重量和高度的高度变化很大12,16。此外，凝块重量与常规方法不同，每项研究需要更多的小鼠12。
既往癌症相关血栓形成模型主要集中在结肠癌、胰腺癌和肺癌，均为完全闭塞模型17、18、19。该手稿修改了部分闭塞血栓形成模型，以提供具有较低变异性和小鼠死亡率的凝块（图1）。以前的研究在免疫功能低下的无胸腺小鼠背景中使用同种异体癌细胞系19,20,21。该手稿在 C57Bl6/J 小鼠中使用了 MC-38 细胞同源异种移植物，这允许使用免疫功能正常的小鼠并检查血栓形成的免疫成分。
Protocol
Representative Results
Discussion
在同基因异种移植结肠癌模型中，与对照组相比，我们观察到实验组的血栓形成性和凝血标志物的表达更高。重要的是，与对照组相比，实验组所有这些参数的方差都较低。修改涉及在 IVC 和左肾静脉的汇合点引入具有特定压力分布的血管夹。将夹子放置在垫片上，垫片是 5-0 聚丙烯缝合线。这种修改减少了凝块大小和血栓形成标志物的变异性。所有小鼠都经历了100%的存活率。
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 AHA 心脏肿瘤学 SFRN CAT-HD 中心资助857078（KR、VCC、XY 和 SL）和 R01HL166608（KR 和 VCC）的支持。
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
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