Essai de thrombose veineuse dans un modèle murin de cancer

Summary

Cet article vise à présenter une méthode optimisée pour évaluer la thrombose veineuse dans un modèle de cancer de souris, en utilisant des clips vasculaires pour réaliser une ligature veineuse. L’optimisation minimise la variabilité des mesures liées à la thrombose et améliore la pertinence pour la thrombose veineuse associée au cancer humain.

Abstract

Cet article méthodologique met en évidence les nuances chirurgicales d’un modèle de thrombose veineuse chez le rongeur, en particulier dans le contexte de la thrombose associée au cancer (CAT). La thrombose veineuse profonde est une complication fréquente chez les survivants du cancer et peut être potentiellement mortelle. Les modèles actuels de thrombose veineuse murine impliquent généralement une occlusion mécanique complète ou partielle de la veine cave inférieure (IVC) à l’aide d’une suture. Cette procédure induit une stase totale ou partielle du sang et des lésions endothéliales, déclenchant une thrombogenèse. Les modèles actuels présentent des limites telles qu’une plus grande variabilité du poids des caillots, un taux de mortalité important et une courbe d’apprentissage prolongée. Ce rapport présente des améliorations chirurgicales à l’aide de clips vasculaires pour remédier à certaines de ces limitations. À l’aide d’un modèle murin de xénogreffe de cancer du côlon syngénique, nous avons utilisé des clips vasculaires personnalisés pour ligaturer la veine cave infrarouge. Ces clips permettent un espace résiduel des lèvres similaire à celui d’une suture en polypropylène 5-0 après une ligature IVC. Des souris avec la méthode de suture ont servi de témoins. La méthode du clip vasculaire a permis d’obtenir une occlusion vasculaire partielle reproductible et cohérente et un poids de caillot plus important avec moins de variabilité que la méthode de suture. On s’attendait à ce que le poids du caillot soit plus important, la plus grande masse du caillot et la plus grande surface luminale de l’IVC en raison du profil de pression plus élevé des clips vasculaires par rapport à une suture en polypropylène 6-0. L’approche a été validée par échographie en niveaux de gris, qui a révélé une masse de caillot systématiquement plus importante dans la veine cave infrarouge avec des clips vasculaires par rapport à la méthode de suture. Ces observations ont été corroborées par la coloration par immunofluorescence. Cette étude propose une méthode améliorée pour générer un modèle de thrombose veineuse chez la souris, qui peut être utilisé pour approfondir la compréhension mécanistique de la tomodensitométrie et dans la recherche translationnelle telle que la découverte de médicaments.

Introduction

Thromboembolie veineuse associée au cancer (TEV)
Le risque de thromboembolie veineuse (TEV) est 4 à 7 fois plus élevé chez les survivants du cancer que dans la population générale ^1,2,3. Cette affection s’avère mortelle chez un patient sur sept atteint d’un cancer. L’incidence de la TEV varie en fonction du type de cancer et de la charge tumorale et est la plus élevée chez les patients atteints de cancers du pancréas et de l’estomac⁴.

La TEV associée au cancer chez les patients cancéreux a une signification pronostique. Il est associé à une survie globale défavorable au cours de la première année suivant un diagnostic de cancer, même après ajustement en fonction de l’âge, de la race et du stade du cancer sous-jacent⁵. Ces résultats soulignent l’importance d’examiner la TEV associée au cancer et la nécessité de sonder son mécanisme à l’aide d’un modèle animal. La pertinence translationnelle de ce domaine est encore soulignée par le fait que la TEV chez les patients cancéreux peut être évitée et traitée par thromboprophylaxie et traitement antithrombotique⁶.

Modèles animaux de cancer et de thrombose veineuse
Les modèles de cancer sont conventionnellement appelés xénogreffes, qui impliquent l’injection de cellules cancéreuses chez la souris. L’injection de cellules cancéreuses à un site comme son origine est appelée modèle orthotopique, tandis qu’à un site différent (plan sous-cutané sur le flanc) est connue sous le nom de modèle hétérotopique. L’espèce d’origine des cellules cancéreuses les détermine en tant que modèle allogénique, comme la lignée cellulaire HT-29 (cancer du côlon humain)^7,8,9. Au contraire, les modèles syngéniques utilisent les lignées cellulaires cancéreuses murines, y compris les lignées cellulaires RenCa et MC-38 ^3,10.

La littérature a décrit des modèles de thrombose artérielle, veineuse et capillaire chez les rongeurs. La thrombose veineuse est induite dans la veine cave inférieure (IVC) par une lésion mécanique (fil guide) ou une ligature IVC complète, chimique (chlorure ferrique) ou électrolytique. La thrombose induite par le chlorure ferrique ou la ligature IVC représentent des modèles d’occlusion complets. Ce dernier se traduit par la stase du sang et des infiltrats inflammatoires dans les veines^11,12,13. Le modèle de ligature complète entraîne un taux élevé de formation de thrombose chez 95 % à 100 % des souris. Le modèle de ligature partielle de l’IVC peut inclure l’interruption des branches latérales ilio-lombaires, et le retour veineux est abrogé par l’application de ligature de suture dans les points cibles distaux de l’IVC¹². Parfois, un support d’espace est utilisé pour interrompre partiellement le retour veineux. Cependant, le poids du thrombus est incohérent dans le modèle actuel d’occlusion partielle, ce qui entraîne une grande variabilité du poids et de la taille des caillots^12,14.

Ces deux modèles mécaniques de grandes veines (partiels et complets) ont des limites. Tout d’abord, la ligature IVC (modèle de stase) entraîne souvent une hypotension. Le sang est dévié dans les veines vertébrales. Bien qu’entre des mains expérimentées, la mortalité avec ce modèle varie de 5 % à 30 %, le taux le plus élevé étant attendu au cours de la courbe d’apprentissage. Il est important de noter que le modèle d’occlusion complète ne reproduit pas la thrombose veineuse profonde (TVP) chez l’homme, où un thrombus est généralement non occlusif. L’occlusion complète est susceptible d’altérer les facteurs hémorhéologiques et les paramètres pharmacodynamiques, modifiant la biodisponibilité des composés sur le site local. En raison de ces limitations, les modèles d’occlusion complète peuvent ne pas être optimaux pour tester de nouveaux composés chimiques à des fins thérapeutiques et pour la découverte de médicaments¹².

Il convient de noter que pour fournir un modèle murin plus pertinent sur le plan clinique de la thrombose veineuse avec diminution du débit avec lésions endothéliales, un modèle de thrombose veineuse a été introduit, où la TVP est déclenchée par la restriction du flux sanguin en l’absence de perturbation endothéliale. Le modèle a été validé par microscopie électronique^{à balayage 15}. Un modèle de thrombose cliniquement pertinent privilégié est celui avec une thrombose presque complète qui permet la découverte de médicaments. La formation de caillots dans les modèles actuels d’occlusion partielle est incohérente, ce qui entraîne une grande variabilité du poids et de la hauteur du caillot^12,16. De plus, le poids du caillot est variable avec les méthodes conventionnelles, ce qui nécessite plus de souris par étude¹².

Les modèles précédents de thrombose associée au cancer se concentraient sur le cancer du côlon, du pancréas et du poumon et étaient tous des modèles d’occlusion complète^17,18,19. Ce manuscrit modifie le modèle de thrombose d’occlusion partielle afin de réduire la variabilité et la mortalité des souris dans les caillots (Figure 1). Des études antérieures ont utilisé des lignées cellulaires cancéreuses allogéniques sur des souris athymiques immunodéprimées 19,20,21. Ce manuscrit utilise une xénogreffe syngénique de cellules MC-38 chez des souris C57Bl6/J, ce qui permet l’utilisation de souris immunocompétentes et l’examen des composants immunitaires de la thrombogenèse.

Protocol

Pour cette étude, 16 souris femelles C57Bl6/J, âgées de 8 à 12 semaines et pesant entre 20 et 25 g, ont été utilisées. Les souris ont été logées dans des conditions standard et ont été nourries avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Boston. Les procédures ouvertes décrites ici ont été entreprises dans un état stérile. 1….

Representative Results

Un groupe de souris femelles C57Bl6/J, âgées de 8 à 12 semaines, a reçu une injection de cellules MC-38 à la phase logarithmique de la croissance cellulaire. Les xénogreffes se sont développées rapidement entre la troisième et la quatrième semaine après l’injection18. Une fois que les tumeurs ont atteint un volume moyen de 400 mm3, les souris ont été randomisées dans les groupes témoin et expérimental. Le groupe témoin a subi une ligature IVC avec suture, tandis que l…

Discussion

Dans un modèle de cancer du côlon par xénogreffe syngénique, nous observons une thrombogénicité et des expressions plus élevées des marqueurs de coagulation dans le groupe expérimental par rapport au groupe témoin. Il est important de noter que la variance de tous ces paramètres était plus faible dans le groupe expérimental que dans le groupe témoin. La modification a consisté à introduire un clip vasculaire avec un profil de pression spécifique au point de confluence de l’IVC et de la veine rénale ga…

Materials

Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors – Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01