Summary
Este protocolo investiga el uso de plasma rico en vesículas extracelulares (VE) como indicador de la capacidad coagulativa de la VE. El plasma rico en EV se obtiene mediante un proceso de centrifugación diferencial y posterior recalcificación.
Abstract
El papel de las vesículas extracelulares (VE) en diversas enfermedades está ganando cada vez más atención, particularmente debido a su potente actividad procoagulante. Sin embargo, existe una necesidad urgente de una prueba a pie de cama para evaluar la actividad procoagulante de la VE en entornos clínicos. Este estudio propone el uso del tiempo de activación de la trombina del plasma rico en EV como medida de la actividad procoagulante de EV. Se emplearon procedimientos estandarizados para obtener sangre entera cirada de sodio, seguida de centrifugación diferencial para obtener plasma rico en EV. El plasma rico en EV y el cloruro de calcio se añadieron a la copa de prueba, y los cambios en la viscoelasticidad se monitorizaron en tiempo real utilizando un analizador. Se determinó el tiempo de coagulación natural del plasma rico en EV, denominado EV-ACT. Los resultados revelaron un aumento significativo de EV-ACT cuando se eliminó EV del plasma obtenido de voluntarios sanos, mientras que disminuyó significativamente cuando se enriqueció EV. Además, el EV-ACT se acortó considerablemente en muestras humanas de preeclampsia, fractura de cadera y cáncer de pulmón, lo que indica niveles elevados de EV plasmático y promoción de la hipercoagulación sanguínea. Con su procedimiento simple y rápido, EV-ACT se muestra prometedor como una prueba a pie de cama para evaluar la función de la coagulación en pacientes con niveles altos de EV en plasma.
Introduction
La trombosis, causada por la hipercoagulabilidad, desempeña un papel importante en diversas enfermedades, como el traumatismo cerebral1, la preeclampsia2, los tumores3 y las pacientes con fracturas4. El mecanismo subyacente a la hipercoagulabilidad es complejo, y recientemente se ha puesto énfasis en el papel de las vesículas extracelulares (VE) en los trastornos de la coagulación. Los VE son cuerpos en forma de vesícula con una estructura de dos capas que se desprenden de la membrana celular, con un diámetro que varía de 10 nm a 1000 nm. Se asocian con una variedad de procesos patológicos, particularmente trastornos de la coagulación5. Varios estudios han identificado las VE como un predictor prometedor del riesgo de trombosis 6,7. La actividad procoagulante de las VE depende de la expresión de los factores de coagulación, principalmente el factor tisular (TF) y la fosfatidilserina (PS). Los VE con actividad procoagulante robusta mejoran significativamente la eficiencia catalítica de la tenasa y el complejo de protrombina, promoviendo así el fibrinógeno mediado por trombina y la trombosis local8. Se han observado niveles elevados de VE y su relación causal con la hipercoagulabilidad en numerosas enfermedades9. En consecuencia, la estandarización de la detección de VE y el reporte de su actividad procoagulante es un área importante de investigación10.
Hasta la fecha, solo se dispone de unos pocos kits comerciales para detectar la actividad procoagulante de los vehículos eléctricos. El ensayo MP-Activity y el ensayo MP-TF, producidos por una empresa comercial, son ensayos funcionales utilizados para medir la actividad procoagulante de EV en plasma11. Estos ensayos emplean un principio similar al de los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas para detectar PS y TF en EV. Sin embargo, estos kits son caros y están limitados a unas pocas instituciones de investigación de alto nivel. El proceso es complejo y requiere mucho tiempo, lo que dificulta su implementación en entornos clínicos. Además, un ensayo de fosfolípidos procoagulantes (PPL) desarrollado comercialmente mezcla plasma libre de PS con plasma de prueba, midiendo el tiempo de coagulación para detectar cuantitativamente los niveles de EV PS positivos12. Sin embargo, estos ensayos se centran principalmente en PS y TF en los vehículos eléctricos, pasando por alto otras vías de coagulación en las que los vehículos eléctricos circulantes pueden estar implicados12.
El sistema de coagulación del plasma es intrincado y comprende componentes "invisibles" y "visibles", incluidos coagulantes, anticoagulantes, sistemas fibrinolíticos y EV suspendidos en el plasma. Fisiológicamente, estos componentes mantienen un equilibrio dinámico. En condiciones patológicas, el aumento significativo de las VE en circulación contribuye a la hipercoagulabilidad, particularmente en pacientes con traumatismo craneoencefálico, preeclampsia, fracturas y varios tipos de cáncer13. Actualmente, la evaluación del estado de coagulación en los laboratorios clínicos implica principalmente la evaluación del sistema de coagulación, el sistema de anticoagulación y la fibrinólisis 14,15,16,17. El tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial activada, el tiempo de trombina y el cociente normalizado internacional se utilizan comúnmente para evaluar los niveles de factor de coagulación en el sistema de coagulación18. Sin embargo, estudios recientes han revelado que estas pruebas no reflejan completamente la hipercoagulabilidad de ciertas enfermedades19. Otros métodos de ensayo, como la tromboelastometría (TEG), la TEG rotacional y el análisis de sonoclot, miden los cambios viscoelásticos en sangre total20,21. Dado que las muestras de sangre entera contienen numerosas células sanguíneas y plaquetas, es más probable que estas pruebas indiquen el estado de coagulación de la muestra en su conjunto. Algunos investigadores han reportado sobre el papel de las células sanguíneas y las plaquetas en la actividad procoagulante22,23. Un estudio reciente también descubrió que las pruebas previas de la función de la coagulación enfrentan dificultades para detectar cambios en la actividad procoagulante de las micropartículas24. Por lo tanto, se ha propuesto la hipótesis de que la función procoagulante de las VE puede evaluarse mediante mediciones viscoelásticas del tiempo de coagulación activado (ACT) en plasma rico en EV.
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Protocol
La recolección de muestras humanas fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Hospital General de la Universidad Médica de Tianjin. La recolección de sangre venosa humana siguió estrictamente la pauta emitida por la Comisión Nacional de Salud de China, a saber, la Guía WS/T 661-2020 para la recolección de muestras de sangre venosa. Brevemente, se recolectó sangre de individuos sanos con consentimiento informado de la vena del área braquial anterior, y las muestras se mezclaron con anticoagulante citrato de sodio al 3,2% en una proporción de 1:9. Cuando solo se recolectaron muestras de anticoagulante de citrato de sodio, se descartó el primer recipiente de recolección. El flujo de procesamiento se inició dentro de las 0,5 h posteriores a la recolección de la muestra. Se reclutaron sujetos adultos sanos para la recolección de muestras después de obtener el consentimiento informado. Los criterios de exclusión de los pacientes fueron: (1) trombosis intravascular reciente, (2) deterioro de la función hepática y renal, (3) hipertensión, hiperlipidemia, diabetes y otras enfermedades crónicas, (4) aspirina o tratamiento anticoagulante, (5) menstruación y embarazo.
1. Aislamiento de plasma rico en VE
- Centrifugar las muestras a 120 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente para eliminar las células sanguíneas. El sobrenadante es plasma rico en plaquetas. Luego, transfiera la mitad superior del sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga con una pipeta.
- Centrifugar el plasma rico en plaquetas a 1500 x g durante 20 min a temperatura ambiente para eliminar las plaquetas. El sobrenadante es plasma pobre en plaquetas. A continuación, transfiera la mitad superior del sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga.
- Centrifugar el plasma pobre en plaquetas a 13000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares. El sobrenadante es plasma rico en EV. Luego, transfiera la mitad superior del sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga para pruebas posteriores.
2. Detección de EV-ACT de la muestra por parte del analizador
- Encienda el analizador de coágulos (consulte la tabla de materiales) y precaliente el instrumento a 37 °C. Instale la sonda desechable y la taza de prueba, luego inicie el procedimiento de control de calidad de la máquina.
NOTA: Cuando el valor de la señal de resistencia viscosa en la pantalla se muestra como una línea recta, significa que no se interfiere con la detección y se califica el control de calidad del estado del analizador. El procedimiento de prueba se puede iniciar después de que se califique la autoprueba. - Introduzca la información de muestra en el sistema. A continuación, transfiera 200 μL de plasma rico en EV al vaso de prueba, seguido de 20 mM y 170 μL de cloruro de calcio. Haga clic en el botón de inicio. La varilla de agitación magnética en la taza de prueba mezclará completamente la muestra y el cloruro de calcio. Cierre la tapa y la sonda comenzará a detectar el cambio en la resistencia de la muestra.
NOTA: Una vez finalizada la prueba, el analizador indicará automáticamente "prueba completada". El sistema visualiza y registra la hora de EV-ACT. El resultado se expresa en la unidad de tiempo "segundo". Deseche la sonda y pruebe la copa.
3. Control de calidad basado en citometría de flujo de la muestra de plasma rica en EV
- Los VE se identificaron por primera vez por su tamaño (0,1-1 μm). Ajuste los parámetros del citómetro de flujo con anticipación y configure la "puerta" de EV utilizando perlas de poliestireno disponibles comercialmente (0,5, 0,9 y 3,0 μm) (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: La mezcla de perlas consiste en esferas fluorescentes de diferentes diámetros que cubren el rango de tamaño de microvesículas (0,5 y 0,9 μm) y plaquetas (0,9 μm y 3 μm). - Ajuste el voltaje de la dispersión directa y la dispersión lateral, y asegúrese de que las microesferas de 0,9 μm caigan en la región adecuada. La región EV se puede dibujar de acuerdo con el diámetro de la microesfera.
- Transfiera 50 μL de plasma rico en EV al tubo de flujo, seguido de 450 μL de solución salina tamón fosfato filtrado. Mezcle bien el líquido en el tubo de flujo. Por último, detectar las muestras mediante citometría de flujo25.
- Utilice partículas fluorescentes Ultra Rainbow (consulte la Tabla de materiales) para cuantificar el número de EVs.In breve, agregue 10 μL de las partículas a la muestra antes de la detección de flujo y calcule la concentración de EV utilizando la siguiente fórmula después de que se complete la detección de la muestra: 10,120 * EV (#) / (microperlas * volumen) * factor de dilución26.
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Representative Results
El tiempo de activación de la trombina del plasma rico en EV se midió utilizando un analizador de método viscoelástico para la medición del tiempo de coagulación del plasma. La máquina consta de cuatro componentes principales: un convertidor electrónico de señal, una sonda, un tanque de detección y un elemento calefactor (Figura 1A, B). La sonda utiliza oscilaciones de alta frecuencia y baja amplitud para detectar cambios en la viscosidad del plasma. El control de calidad diario implica principalmente el control de la calidad del aire para evaluar la estabilidad de la plataforma de prueba e identificar cualquier perturbación física en la sonda. El control de calidad del rendimiento implica pruebas con aceite de viscosidad estándar para garantizar que el valor de resistencia detectado por la sonda se encuentre dentro del rango establecido.
Después de obtener plasma rico en EV, los EV se midieron mediante citometría de flujo para el control de calidad de la muestra. Las muestras no calificadas exhiben un grupo distinto con un tamaño de partícula ligeramente mayor cerca de la "puerta" de EV (Figura 2A). Por el contrario, las muestras cualificadas ricas en EV muestran que la mayoría de las señales caen dentro de la "puerta" de EV como un solo grupo (Figura 2B).
Para evaluar la concentración de EV en muestras de plasma ricas en EV de voluntarios sanos, se realizó una centrifugación a gran velocidad (1,00,000 x g, 70 min). Los resultados revelaron que un aumento en la concentración de EV acortó el EV-ACT, mientras que una disminución en la concentración de EV prolongó el EV-ACT (Figura 3A). El tiempo EV-ACT puede exhibir una correlación negativa con los niveles de EV. Se examinaron varias muestras de pacientes clínicos, y los hallazgos demostraron que las muestras de plasma ricas en EV de pacientes con preeclampsia, fracturas de cadera y cáncer de pulmón (de izquierda a derecha) tenían tiempos de EV-ACT significativamente más cortos en comparación con las voluntarias sanas (Figura 3B).
En conclusión, se estableció preliminarmente un método experimental rápido y rentable para detectar la actividad procoagulante de la VE, prometedor para aplicaciones clínicas en los exámenes a pie de cama.
Figura 1: El diagrama esquemático y la imagen física del analizador de coágulos. (A) y (B) representan los componentes principales del analizador y la configuración de operación, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Citometría de flujo representativa de EV en plasma rico en EV. (A) Muestras de plasma ricas en EV no calificadas. (B) Muestras de plasma ricas en EV calificadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos del EV-ACT de la muestra. (A) Resultados del EV-ACT después de la eliminación del EV y la concentración de EV en muestras ricas en EV de voluntarios sanos (de izquierda a derecha, suspensión del sedimento después de la supercentrifugación, plasma rico en EV y sobrenadante después de la ultracentrifugación). (B) Resultados de EV-ACT de muestras ricas en EV de voluntarios y pacientes sanos (de izquierda a derecha, preeclampsia, fractura de cadera, cáncer de pulmón y voluntaria sana). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, se describió la preparación de plasma rico en EV y se verificó la racionalidad del método mediante citometría de flujo. Posteriormente, las muestras de plasma recalcificado se analizaron para el tiempo de ACT utilizando un analizador de coágulos basado en los principios de viscoelasticidad24. Como se muestra en la Figura 3A, se encontró que la concentración de EV obtenida a través de la ultracentrifugación acortó el tiempo EV-ACT, mientras que el sobrenadante después de la ultracentrifugación, que había reducido los niveles de EV, exhibió tiempos EV-ACT prolongados. Estos hallazgos sugieren una estrecha relación entre los resultados de EV-ACT y los niveles de EV. En la Figura 3B, se comparó el EV-ACT de muestras de plasma de pacientes con preeclampsia, fracturas de cadera y cáncer de pulmón con voluntarios sanos, revelando tiempos de EV-ACT significativamente más cortos en los grupos de enfermedad. Informes previos han indicado niveles elevados de VE promotoras de la coagulación en plasma para estas enfermedades 27,28,29. Sin embargo, se debe tener en cuenta que otros factores presentes en el plasma pueden influir en los resultados de EV-ACT, y se justifica una mayor exploración de estos factores influyentes. Este ensayo propone reconocer el papel crucial de los VE en el estado de hipercoagulabilidad de ciertas enfermedades y aborda la falta de un método de detección rápido y de bajo costo para la actividad procoagulante de los VE.
Dentro del sistema de muestras de sangre aisladas, las sustancias relacionadas con la coagulación pueden dividirse en células sanguíneas, plaquetas, metabolitos celulares (principalmente VE) y otros componentes "invisibles" (como factores de coagulación y factores anticoagulantes)30,31,32. Dada la complejidad del mecanismo de coagulación, el sistema de detección se simplificó a plasma rico en EV para minimizar la interferencia de otros factores. Los pasos clave en este proceso incluyen la prevención de la generación de vehículos eléctricos artificiales durante el procesamiento de muestras y la minimización de la contaminación plaquetaria. Por lo tanto, es necesario iniciar el procedimiento de centrifugación diferencial dentro de las 0,5 horas y completar la detección dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de la muestra. Estudios previos han demostrado que el uso de una fuerza centrífuga suficientemente alta y la retención de la mitad superior del sobrenadante puede reducir eficazmente la contaminación plaquetaria33. Se utilizó citometría de flujo para detectar plaquetas residuales en plasma rico en EV, confirmando su muy baja presencia. Las muestras no calificadas son el resultado principalmente de la contaminación plaquetaria y la fragmentación celular causada por el proceso de manipulación. La contaminación plaquetaria se caracteriza por la presencia de partículas fuera de la "puerta" de los VE, mientras que la fragmentación celular aparece como un grupo distinto dentro de la "puerta" de los VE.
Estudios recientes han confirmado niveles significativamente elevados de VE plasmáticas en ciertas enfermedades34,35. Estos VE promueven principalmente la coagulación a través de la presencia de fosfatidilserina (PS) y factor tisular (TF) en su superficie. Por lo tanto, el tiempo de ACT del plasma rico en EV depende en gran medida del nivel de EV coagulantes. Una limitación de esta prueba es la necesidad de garantizar que los niveles de los factores de coagulación no cambien significativamente en la medida en que afecten el tiempo de coagulación durante el análisis EV-ACT. Sin embargo, los estudios sobre los cambios en los niveles de factores de coagulación después de la aparición de la enfermedad son relativamente escasos, y su efecto sobre el EV-ACT debe evaluarse en futuras investigaciones. Además, el uso excesivo de fármacos anticoagulantes puede afectar significativamente a los resultados de la EV-ACT, por lo que este método no debe emplearse durante dicho tratamiento.
Existen varios métodos para determinar los VE procoagulantes, cada uno con sus ventajas y desventajas. Piwkham et al. evaluaron la actividad procoagulante de EV mezclando la suspensión de EV con plasma normal y observando el tiempo de formación de coágulos sanguíneos en un baño de agua a 37 °C36. Aunque este método es simple, la observación subjetiva del tiempo de formación del coágulo puede conducir a variaciones en los resultados entre diferentes observadores. Patil et al. emplearon un ensayo de coagulación estandarizado interno para pruebas de micropartículas procoagulantes utilizando veneno de víbora Russell en un coagulómetro semiautomático37. Este método de detección utiliza equipos semiautomáticos, que ofrecen una alta eficiencia y simplicidad. Sin embargo, la adición de veneno de víbora Russell para activar el factor X pasa por alto la presencia de otros anticoagulantes en el plasma, como la proteína lactadherina. Este método evalúa los resultados en función del equilibrio entre los VE procoagulantes y los componentes anticoagulantes en el plasma, lo que proporciona un reflejo más preciso de la función de coagulación de la muestra de plasma.
Las pruebas de función de coagulación existentes se centran principalmente en el tiempo de activación de la trombina en sangre total o sangre rica en plaquetas, o detectan deficiencias en los factores de coagulación24. El desarrollo de un método de prueba para la actividad procoagulante de las VE ayudará a dilucidar el papel de las VE en la enfermedad y en futuros tratamientos. El sencillo proceso de preparación de la muestra, que implica la adición de solo CaCl2, hace que el ensayo sea conveniente para que los médicos determinen rápidamente el estado de la función de coagulación de los pacientes. La prueba EV-ACT es fácil de realizar, con resultados disponibles en 10-15 minutos, lo que la hace muy adecuada para el desarrollo como prueba de cabecera. Estudios anteriores han identificado tentativamente aplicaciones de EV-ACT en preeclampsia, tumores y fracturas. La investigación futura continuará explorando las perspectivas de aplicación clínica de EV-ACT.
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Disclosures
Todos los autores declararon que no existen posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, subvención n.º 81930031, 81901525. Además, agradecemos a Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. por proporcionarnos máquinas y orientación técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
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