Summary
Her præsenterer vi en protokol til at evaluere nociception hos mus inficeret med Trypanosoma evansi, ved hjælp af det elektroniske von Frey-apparat som et værktøj, der måler mekaniske tærskler i bagpoten og indvoldene.
Abstract
Patogenese af infektionssygdomme er stadig et komplekst felt at studere. Forløbet af flere kliniske tegn, såsom allodyni og smerte, kan observeres hos husdyr. Kendskabet til deres veje og korrekt behandling kræver imidlertid kontrollerede forsøg, mange af dem med forsøgsdyr. Måling af ændringer i mekaniske tærskler i bagpoten og indvoldene er en nyttig teknik til at observere ændringer i smerteopfattelsen hos gnavere. Abstinensrespons kan måles først i baseline-test, hvilket skaber bedre kontrol af forsøgsgrupper. Efterfølgende tests kan udføres efter at have induceret infektion og tilføjet lægemidler til protokollen. Brugen af et elektronisk von Frey-apparat forbundet med brugen af en ansigtsskala til at observere smertelignende ændringer muliggør en enkel, præcis og konsistent vurdering til at evaluere allodyni og smerte hos mus. Således repræsenterer eksperimenter med den nuværende metode til Trypanosoma evansi-infektion en nyttig metode til at evaluere allodyni og smerter hos laboratorieinficerede dyr, som kan anvendes til den konventionelle behandling af husdyr.
Introduction
Trypanosoma evansi er det ætiologiske middel til sygdommen kaldet "surra" eller "mal-das-cadeiras" i Sydamerika 1,2. Det rammer almindeligvis heste og kvæg, men også vild fauna, der overføres af hæmatofage flagermus, tabanider og stomoxer fluebid 1,3. Surra er en alvorlig sygdom hos husdyr, som kan være dødelig i mangel af den korrekte behandling, og som udviser uspecifikke kliniske tegn såsom anæmi, appetitløshed og vægt, muskelsvaghed og abort, som kan variere afhængigt af værten og den geografiske region 2,4,5,6.
Udtrykket af allodyni og smerte hos inficerede dyr i løbet af sygdommen er stadig et nyt emne 2,7. Trangen til at forstå patogenesen bag disse tegn er et vigtigt skridt til at forbedre og forfine den aktuelt anvendte behandling ved at tilføje effektive smertestillende lægemidler til den klassiske trypanocidale protokol 5,6. I dette scenarie repræsenterer muligheden for at replikere sygdommen ved hjælp af en musemodel en fordel, da mus let kan holdes under kontrollerede miljøer i laboratoriet og derfor giver resultater, der er mere konsistente end feltforsøg med husdyr.
En mekanisk tærskel opnås almindeligvis ved hjælp af et elektronisk von Frey (EvF) apparat til evaluering af allodyni i et stort antal eksperimenter 2,8,9. Denne enhed bruges til at vurdere vævets følsomhed over for mekanisk stimulering: Når apparatet rører dyrets pote, gennem en 20-200 μL spids, der er fastgjort til enheden, registreres den kraft, hvormed dyret trækker poten tilbage.
Gnavere bruges normalt som standarddyr i disse eksperimenter, og de fleste resultater ekstrapoleres til andre arter, da de fleste undersøgte sygdomme kommer fra andre arter, hvor det ville være vanskeligt at udføre en kontrolleret undersøgelse. Desuden er allodyni og smerte tæt forbundet. Brugen af en specifik ansigtsskala til at evaluere smerte hos inficerede mus spiller en vigtig rolle som et bekræftende hjælpestof til at bekræfte tilstedeværelsen af smerte i løbet af T. evansi-infektion 2,10.
I denne protokol demonstrerer vi en ny model til at evaluere allodyni og smerte hos mus eksperimentelt inficeret med T. evansi, der viser en høj korrelation mellem variabler og viser sig dermed at være en stærk model. Desuden kræver det et lille antal forskere at udføre hele proceduren, hvilket mindsker risikoen for menneskelig indblanding under eksperimentet. Det gør det også muligt for investigator at replikere målsygdommen under et akut forløb og tilføje flere forskellige behandlingslægemidler i det eksperimentelle design og derved opnå konsistente resultater på kort tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført med 10 uger gamle voksne schweiziske hunmus (35-55 g). Dyrene blev anbragt i polysulfonbure (3-5 dyr pr. bur) i et rum med kontrolleret temperatur (21 ± 1 °C), 12 timers lys/12 timers mørkecyklus og standard laboratoriechow og vand ad libitum. Ti dyr blev tildelt hver gruppe i hver test for at demonstrere de konsistente virkninger af lægemiddelbehandlinger. Det eksperimentelle design blev indsendt og godkendt af den etiske komité ved Santa Catarina State University (CEUA) (protokolnummer: 6019201123). Alle dyreforsøg overholdt ARRIVE-retningslinjerne (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) og blev udført i overensstemmelse med National Research Councils vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Forberedelse og podning af Trypanosoma evansi
FORSIGTIG: Bær en engangskittel, handsker, maske og øjenbeskyttelse, når du håndterer inficerede blodprøver, reagenser og andre kemiske forbindelser.
- Tænd for vandbadsudstyret og juster det ved en konstant temperatur på 37 °C.
- Tag et mikrocentrifugerør indeholdende den konserverede blodprøve ud af ultrafryseren (-80 °C). Læg den i vandbadet, indtil blodet tøer op.
BEMÆRK: Det samme isolat skal bruges til at inficere alle mus i hver gruppe af forskellige eksperimenter for at opretholde et lige stort antal blodpassager. - Brug fosfatbufret saltvand (PBS, 0,1 M) indeholdende 60 % D-(+)-glucose (pH 7,4) til at udføre seriefortynding (10:1 v v), indtil der opnås 1 ×10 4 trypanosomer pr. 0,1 ml. Bestem antallet af parasitceller ved manuel celletælling ved hjælp af et Neubauer-kammer på et mikroskop med en 100x objektivlinse2.
- Pokuler 0,1 ml af den fortyndede blodopløsning (inficeret gruppe) eller det samme volumen i 0,9 % saltvand (kontrolgruppe), intraperitonealt, ved hjælp af en 26 G 1/2" nål koblet til en insulinsprøjte.
2. Elektronisk von Frey-apparatopsætning og betjening
BEMÆRK VENLIGST: Vær forsigtig med, hvordan de indhentede data registreres. Noget EvF-udstyr har specifikke programmer til at overføre de opnåede data fra apparatet til andre elektroniske enheder, såsom computere, tablets eller smartphones.
- Tænd for EvF-apparatet. Sørg for, at udstyret er godt opladet, før du starter eksperimentet, observer batteriniveauet, der vises på udstyrsskærmen, og oplad det om nødvendigt.
- Tilslut EvF-apparatet til den valgte elektroniske enhed via Wi-Fi for at overføre og gemme de opnåede data.
- Indsæt en 10 μL polypropylenspids i EvF-apparatets kegle, og indstil udlæsningen til nul (0.00 g) ved at trykke på knappen med et potesymbol.
- Bemærk, at når det evaluerede væv er undersøgt; det maksimale påførte tryk vises på EvF-apparatets display. Overfør den derefter til den valgte elektroniske enhed ved at trykke på knappen med et antennesymbol for sikker optagelse.
- Nulstil udlæsningen til nul og gør dig klar til at tage en ny måling ved blot at trykke på knappen med potesymbolet igen.
3. Generelle betragtninger i forbindelse med vurderinger af mekaniske tærskelværdier
- Udfør alle eksperimenter i et stille rum med kontrolleret temperatur ved 21 °C og en 12 timers lys/12 timers mørkecyklus, og sørg for at respektere musens døgncyklus ved at udføre alle evalueringer på samme tidspunkt på dag2.
- Få den samme person til at udføre både baseline og eksperimentelle mekaniske tærskelvurderinger for at reducere bias og sikre målekonsistens; Sørg for, at eksperimenterne er blindede.
- Placer hver mus forsigtigt inde i et individuelt kammer lavet af polymethylmethacrylat (PMMA) med en perforeret top placeret på et 5 mm² mesh gulvstativ 2,8.
- Lad musene akklimatisere sig i 30 minutter i PMMA-kamrene, før du vurderer både baseline og eksperimentelle mekaniske tærskler2.
- Placer netgulvstativet i en behagelig højde (på en stabil overflade), så dyrene er tilgængelige fra alle sider. Sørg for, at musens mave og alle fire poter er let tilgængelige gennem netgulvåbningerne.
- Dæk den stabile overflade, der bruges til at tildele kamrene med absorberende materiale til at absorbere eller opsamle vandladning og afføring. Sørg for, at undersøgerens arme kan bevæge sig frit under kamrene, mens du betjener EvF-apparatet.
4. Baseline mekanisk tærskelvurdering og muserespons på stimuli
- Til mavemålinger skal du opdele maven i tre virtuelle dele (kraniale, medium og kaudale områder). Vælg kranieområdet (anatomisk indeholdende leveren) som standardmålvæv til visceral allodyni mekanisk tærskelvurdering. For potemål skal du vælge den rigtige bagpote til standardisering.
- Tag en baseline-måling fra hver mus 48 timer før infektionen. For at gøre det skal du placere musene i de indeholdende kamre, forberede EvF-apparatet og bruge begge hænder til at hæve sonden langsomt for at stimulere det målrettede væv.
- Øg gradvist trykket på vævet, indtil musen udtrykker en nociceptiv adfærd. For evaluering af højre bagpote skal du kigge efter potetilbagetrækning, poteslikning eller firepotespring 2,8,9. For visceral evaluering skal du kigge efter en skarp tilbagetrækning af maven, øjeblikkelig slikning eller ridsning af det sondede sted eller firepotespring 2,11.
- Gem den opnåede værdi ved at overføre dataene til den valgte elektroniske enhed, der indeholder det specifikke EvF-program, eller skrive dem i en karakterbog. Nulstil displayet til nul, og gentag processen fire gange for at opnå fem målinger8.
BEMÆRK: Overvej kun tre lignende målinger for at estimere middelværdien2 - Den mekaniske tærskel for musen i det tilstødende kammer måles, indtil hver mus er undersøgt fem gange, og der opnås en middelværdi for hvert dyr.
- Referencemålingerne gentages 24 timer senere, og mus med middelværdier på under 3,00 g eller med forskelle mellem basalmålinger på over 2,00 g 2,8 udelukkes.
BEMÆRK: Der skal kun vælges ét målvæv for hver mus i hvert forsøg, så dyrene ikke vænner sig til at blive sonderet, da antallet af evalueringer vil være betydeligt højere i løbet af en kort periode.
5. Eksperimentel vurdering af mekanisk tærskelværdi for højre bagpote og visceral allodyni
- Vurder den mekaniske tærskel for højre bagpote eller visceral allodyni 1 time efter infektionen til evaluering af dag 0.
- Gentag proceduren hver 24. time over 5 dage efter infektion.
BEMÆRK: Hvis der er en behandling, der skal administreres, skal du vælge et passende tidspunkt inden for forsøgsdesignet. - Sæt musene tilbage i deres oprindelige bure for at forhindre dyr i at kæmpe mod hinanden, med adgang til standard laboratoriechow og vand ad libitum , efter at målingerne er afsluttet.
- Udfør en normalitetstest for at kontrollere normalfordelingen af dataene og yderligere passende statistisk analyse af de indsamlede data.
6. Vurdering af grimasseskala for mus
- Sørg for, at hver mus let ses, mens den er inde i det indeholdende kammer, og undersøg hver mus før eksperimentet for at sikre, at der ikke er læsioner på lemmer, mave eller ansigt og ingen pelsændringer.
- Observer musens orbitalområde. Klassificer åbne øjne som fravær af smerte (score 0), mens en tydelig smerte kan repræsenteres, når musen lukker øjnene (score 2).
- Observer musens næse. Klassificer en normal næse som fravær af smerte, mens tilstedeværelsen af en bule på næseryggen repræsenterer åbenlys smerte.
- Læg mærke til musens kinder. Klassificer normale kinder som fravær af smerte, mens tilstedeværelsen af en bule på begge kinder repræsenterer tydelig smerte.
- Overhold placeringen af musens ører. Klassificer afrundede ører som fravær af smerte, mens ører, der roterer udad eller bagud, væk fra ansigtet, i en spids form, repræsenterer tydelig smerte. Afstanden mellem ørerne øges med smertescoren.
- Observer musens knurhår. Klassificer knurhår med deres naturlige nedadgående kurve som fravær af smerte, mens knurhår, der enten trækkes tilbage mod kinden eller trækkes fremad, repræsenterer åbenlys smerte.
- Da medfødt adfærd, såsom selvpleje, kan forstyrre ansigtsudtrykket, skal du ikke betragte disse som smerterelateret adfærd8. Vent på, at musen stopper denne funktionsmåde før hver evaluering af handlingsenheden.
- Udfør en normalitetstest for at kontrollere normalfordelingen af dataene og yderligere passende statistisk analyse af de indsamlede data.
BEMÆRK: Ved afslutningen af alle eksperimenterne blev mus humant aflivet ved hjælp af ketamin (90 mg/kg) og xylazin (7,5 mg/kg), injiceret intraperitonealt. Efter at have nået frem til en bekræftet dyb anæstesiplan blev de udsat for cervikal dislokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fald i den mekaniske tærskel på grund af T. evansi-infektion som evalueret af elektronisk von Frey-apparat på både højre bagpote og visceralt væv
Eksperimentet blev udført over 5 dage, ifølge tidligere data relateret til den tilgængelige T. evansi-prøve 2. Inficerede mus begyndte at vise en signifikant forskel i mekanisk tærskel på højre bagpote på dag 3 efter infektion og forblev signifikant lavere end kontrolgruppen i løbet af de næste 2 dage efter infektion (figur 1A) sammenlignet med uinficerede mus. Lignende resultater for abdominal taktil følsomhed viste visceral allodyni hos inficerede mus fra dag 3 efter infektion og forblev signifikant lavere end kontrolgruppen i de næste 2 dage efter infektion (figur 1B).
Figur 1: Allodynievaluering af mus eksperimentelt inficeret med Trypanosoma evansi. (A) Allodyni i højre bagpote og (B) visceral allodyni. Data udtrykt som gennemsnittet ± SD for ti dyr for hver forsøgsgruppe. Statistisk analyse: Elevens t-test, en uparret analyse pr. tidspunkt. Stjerner viser signifikante forskelle mellem eksperimentelle grupper i betragtning af det samme analyserede tidspunkt (p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Induktion af musesmerterelaterede ansigtstræk ved T. evansi-infektion og numerisk fortolkning ved Mouse Grimace Scale smertevurdering
Inficerede mus begyndte at manifestere signifikante tegn på smerterelaterede ansigtstræk på dag 3 efter infektion og viste en gennemsnitlig score på 0,4 [0-1] på det nævnte tidspunkt. Den samme tendens blev observeret under eksperimentet, hvor den inficerede gruppe viste signifikante forskelle sammenlignet med kontrolgruppen, der præsenterede gennemsnitlige scorer på 0,6 [0-1] og 1,3 [0-2] for henholdsvis dag 4 og 5 efter infektion. Kontrolgruppen scorede ikke på Mouse Grimasse-skalaen, som forventet. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af Students t-test, en uparret analyse pr. tidspunkt, der betragter en værdi på p < 0,05 som signifikant. Desuden identificerede Pearson-korrelationskoefficienten (r) interaktionsmønstre mellem Mouse Grimace Scale-smertevurderingen og højre bagpote-allodyni eller mellem samme skala og visceral allodyni, hvilke værdier var henholdsvis -96,35 % og -84,08 %. Derudover var bestemmelseskoefficienterne (R2) for Mouse Grimace Scale smertevurdering og højre bagpote allodyni eller visceral allodyni henholdsvis 0,9283 og 0,7070.
Denne undersøgelse stemmer overens med tidligere data, som bekræftede tilstedeværelsen af betændelse og smerte gennem forløbet af T. evansi-infektion 2,3,7,12. Desuden giver den beskrevne metode en nøjagtig metode til at identificere og måle allodyni og smerte hos mus. Desuden viste brugen af Mouse Grimace Scale smertevurdering hos inficerede mus et meget højt negativt r (90 til 100 %) sammenlignet med resultaterne udtrykt ved allodynievalueringen af højre bagpote og højt negativt r (70 til 89 %) for visceral allodynievaluering af de respektive dyr13. På samme måde indikerede brugen af Mouse Grimace Scale smertevurdering hos inficerede mus en meget stærk R2 (0,90 til 1,00) sammenlignet med resultaterne udtrykt ved allodynievalueringen af højre bagpote og stærk R2 (0,70 til 0,89) for visceral allodynievaluering af de samme dyr14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skridt i eksperimenter, der involverer inficerede dyr, er kontrol af parasitæminiveauer. Forskellige stammer af T. evansi kan opføre sig på forskellige måder hos mus, hvilket fører fra akutte til kroniske infektioner 2,4,5,6. Desuden kan ændringer i infektionsdosis nedsætte eller forlænge overlevelsestiden for mus. Derfor anbefales det at opnå en overlevelseskurve før eksperimenterne for at bestemme den korrekte periode af eksperimentet og forhindre frustration over uventede musedødshændelser 15,16. Derudover kan disse data bestemme humane endepunkter for eksperimentet, hvis det er relevant.
Derudover skal det samme isolat bruges til at inficere alle mus i eksperimentet for at respektere et lige antal blodpassager, som forklaret i protokolafsnittet. På samme måde kan kryokonserveret eller frisk inficeret blod bruges til at inficere musene, da nogle kryokonserverede prøver kan inaktiveres efter optøning i et vandbad. Frisk inficeret blod kan dog producere hurtigere parasitæmi og derfor tidligere dødsfald17,18.
Ændringer i eksperimentet, såsom tilsætning af trypanocidale eller smertestillende lægemidler, er levedygtige. Nye grupper betyder flere dyr, og det er vigtigt at huske, at selv kontrolgrupper for de valgte lægemidler skal underkastes baseline-målinger. Det er vores erfaring, at ca. 20-25 % af musene er udelukket fra forsøget efter den anden baseline-måling, hvilket er i overensstemmelse med tidligere data8. Det betyder, at det oprindelige antal dyr skal være højere end forsøgsantallet af dyr, hvilket kan være et problem, når flere grupper vurderes og der derfor estimeres et højere antal mus.
Farmakokinetik og farmakodynamik skal tages i betragtning for denne model. Nogle lægemidler tager længere perioder at udøve deres farmakologiske virkning, hvilket kan påvirke det eksperimentelle design af en model, hvor mus normalt dør i gennemsnit 4 til 5 dage 2,6. Derudover, hvis dyr faster til den valgte behandling, kan akklimatiseringsperioden være en vigtig faktor at overveje, da den vil påvirke både lægemiddeldynamik og eksperimentel tidsplan og procedure, som rapporteret i protokolafsnittet.
En stor forbedring i den nuværende metode er, at en enkelt veluddannet forsker kan udføre hele EvF-aflæsningsproceduren (både baseline og eksperimentelle målinger), mens han forbliver blind for infektionen eller behandlingerne. En anden efterforsker skal udføre infektionen i begyndelsen af eksperimentet. Dette er ikke nødvendigt efter infektionsproceduren, da EvF-apparatet har et specifikt von Frey Wi-Fi-måleprogram, der kun tillader én person at betjene udstyret fuldt ud. Desuden er denne metode hurtigere end det almindelige Filament von Frey-udstyr og lettere at udføre 8,19.
Træthed kan dog være en komplikation, da den samme forsker skal udføre alle dyreaflæsninger og kan udvikle udmattelse på grund af den gentagne bevægelse efter et stykke tid8. I betragtning af overlevelsesforventningen for mus inficeret med T. evansi opfordres et stort antal grupper i forsøgsdesignet ikke. Det er vores erfaring, at der i gennemsnit kan måles 10 mus ad gangen (afhængigt af forsøgsdesignet) på mindre end 30 minutter. Desuden skal der kun vælges ét målvæv for hver mus i hvert forsøg, så dyrene ikke vænner sig til at blive undersøgt, som forklaret i protokolafsnittet, hvilket også mindsker risikoen for at udvikle træthed hos forskeren.
Derudover har både EvF (højre bagpote og viscerale målinger) og Mouse Grimace Scale-vurderinger brug for veluddannede forskere. Før eksperimenterne udføres, skal efterforskeren bruge lange perioder på at øve sig. For korrekt at evaluere ændringerne i ansigtsudtryk hos mus, skal forskeren ikke kun kende de forventede ændringer, men også det normale ansigtsudtryk hos en almindelig mus og dens variationer af normalitet og adfærd10,20. For korrekt at evaluere musenes mekaniske tærskel ved hjælp af EvF-apparatet skal forskeren desuden gentage flere baseline-målinger, indtil musens respons på sondestimuli let genkendes, og konsistens opnås 2,8.
Fremtidige anvendelser af protokollen involverer evaluering af allodyni og smerte samt dens behandling på mus inficeret med T. evansi. Den nuværende model gør det muligt for videnskabelige forskere at evaluere den smerterelaterede patogenese af en sygdom, der almindeligvis findes i husdyr, hos mus under et kontrolleret miljø i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne giver en særlig tak til Santa Catarina State University for økonomisk støtte, til farmakologilaboratoriet for dyrene og rummet og til Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory for den kryokonserverede blodprøve inficeret med T. evansi , der blev brugt i disse eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe | TKL | 80288090100 | Used to infund solutions on laboratory animals |
| Accessories for von Frey analgesimeter | INSIGHT | EFF 303 | Containment box with support for digital analgesimeter assessment |
| D-(+)-Glucose | SIGMA-ALDRICH | G7021 | A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms |
| Digital analgesimeter | INSIGHT | von Frey Wi-Fi | The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli |
| Gilson type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18261 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment |
| Laboratory water bath | BEING INSTRUMENT | BW-22P | Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature |
| Phosphate buffered saline | SIGMA-ALDRICH | 806552 | A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications |
| Swiss mice (Mus musculus) from both gender | UFSC | Swiss Webster | Laboratory animals used for controlled experiments |
| Trypanosoma evansi cryiopreserved sample | UDESC | - | Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory |
| Universal type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18171 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment |
References
- Desquesnes, M., et al. Trypanosoma evansi and surra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects. BioMed Research International. 2013, 194176 (2013).
- Cipriani, D. S., et al. Experimental Trypanosoma evansi infection induces pain along with oxidative stress, prevented by COX-2 inhibition. Experimental Parasitology. 247, 108477 (2023).
- Paim, F. C., et al. Cytokines in rats experimentally infected with Trypanosoma evansi. Experimental Parasitology. 128 (4), 365-370 (2011).
- Gillingwater, K., et al. In vivo investigations of selected diamidine compounds against Trypanosoma evansi using a mouse model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 5074-5079 (2009).
- Dkhil, M. A., et al. Treatment of Trypanosoma evansi-infected mice with Eucalyptus camaldulensis led to a change in brain response and spleen immunomodulation. Frontiers in Microbiology. 13, 833520 (2022).
- Dkhil, M. A., et al. Murine liver response to Allium sativum treatment during infection induced-trypanosomiasis. Saudi Journal of Biological Sciences. 28 (6), 3270-3274 (2021).
- Martins de Moraes, C., et al. Infection by Trypanosoma evansi in horses from Brazil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. 102 (561-562), 159-163 (2007).
- Martinov, T., et al. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of Visualized Experiments. 82, e51212 (2013).
- Rodríguez-Angulo, H., et al. Role of TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas' disease. Experimental Parasitology. 134 (4), 422-429 (2013).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7, 447-449 (2010).
- Eijkelkamp, N., et al. Increased visceral sensitivity to capsaicin after DSS-induced colitis in mice: spinal cord c-Fos expression and behavior. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (4), 749-757 (2007).
- Mekata, H., et al. Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi. Journal of Veterinary Medical Science. 77 (8), 1017-1019 (2015).
- Mukaka, M. M. Statistics corner: a guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Schober, P., et al. Correlation coefficients: appropriate use and interpretation. Anesthesia and Analgesia. 126 (5), 1763-1768 (2018).
- Kamidi, C. M., et al. Differential virulence of camel Trypanosoma evansi isolates in mice. Parasitology. 145 (9), 1235-1242 (2018).
- Mekata, H., et al. Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates. Parasitology Research. 112, 1513-1521 (2013).
- Silva, A. S., et al. Trypanosoma evansi pathogenicity strain in rats inoculated with parasite in fresh and cryopreserved blood. Ciência Rural. 39 (6), 1842-1846 (2009).
- Silva, A. S., et al. Acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain and spinal cord of rats infected with Trypanosoma evansi. Veterinary Parasitology. 175, 237-244 (2011).
- Diógenes, A. K. L., et al. Concurrent validity of electronic von Frey as an assessment tool for burn associated pain. Burns. 46 (6), 1328-1336 (2020).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17, 45-59 (2016).
