Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utvärdera nociception hos möss infekterade med Trypanosoma evansi, med hjälp av den elektroniska von Frey-apparaten som ett verktyg för att mäta mekaniska trösklar i baktass och inälvor.
Abstract
Patogenes vid infektionssjukdomar är fortfarande ett komplext område att studera. Förloppet av flera kliniska tecken, såsom allodyni och smärta, kan observeras hos husdjur. Kunskapen om deras vägar och rätt behandling kräver dock kontrollerade experiment, många av dem med hjälp av försöksdjur. Att mäta förändringar i mekaniska trösklar i baktassen och inälvorna är en användbar teknik för att observera förändringar i smärtuppfattning hos gnagare. Abstinensrespons kan först mätas i baslinjetester, vilket skapar bättre kontroll av experimentella grupper. Efterföljande tester kan utföras efter att ha inducerat infektion och lagt till läkemedel i protokollet. Användningen av en elektronisk von Frey-apparat i samband med användningen av en ansiktsvåg för att observera smärtliknande förändringar möjliggör en enkel, exakt och konsekvent bedömning för att utvärdera allodyni och smärta hos möss. Experiment med den nuvarande metodiken för Trypanosoma evansi-infektion representerar således en användbar metod för att utvärdera allodyni och smärta hos laboratorieinfekterade djur, som kan tillämpas på konventionell behandling av boskapsdjur.
Introduction
Trypanosoma evansi är det etiologiska smittämnet för sjukdomen som kallas "surra" eller "mal-das-cadeiras" i Sydamerika 1,2. Det drabbar vanligtvis hästar och nötkreatur, men även vilda djur, och överförs av hematofagiska fladdermöss, tabanider och stomoxar flugbett 1,3. Surra är en allvarlig sjukdom hos husdjur, som kan vara dödlig i avsaknad av rätt behandling, och uppvisar ospecifika kliniska tecken som anemi, förlust av aptit och vikt, muskelsvaghet och abort, som kan variera beroende på värd och geografisk region 2,4,5,6.
Uttrycket av allodyni och smärta hos infekterade djur under sjukdomsförloppet är fortfarande ett nytt ämne 2,7. Behovet av att förstå patogenesen bakom dessa tecken är ett viktigt steg för att förbättra och förfina den behandling som för närvarande används genom att lägga till effektiva smärtstillande läkemedel till det klassiska trypanocidalprotokollet 5,6. I detta scenario är möjligheten att replikera sjukdomen med hjälp av en murin modell en fördel, eftersom möss lätt kan hållas under kontrollerade miljöer i laboratoriet och därför ge resultat som är mer konsekventa än fältförsök med boskap.
En mekanisk tröskel erhålls vanligtvis med hjälp av en elektronisk von Frey-apparat (EvF) för utvärdering av allodyni i ett stort antal experiment 2,8,9. Denna anordning används för att bedöma vävnadens känslighet för mekanisk stimulering: när apparaten vidrör djurets tass, genom en 20-200 μL spets som är fäst vid enheten, registreras den kraft med vilken djuret drar tillbaka tassen.
Gnagare används vanligtvis som standarddjur i dessa experiment, och de flesta resultat extrapoleras till andra arter, eftersom de flesta undersökta sjukdomar kommer från andra arter där det skulle vara svårt att genomföra en kontrollerad studie. Dessutom är allodyni och smärta intimt relaterade. Användningen av en specifik ansiktsskala för att utvärdera smärta hos infekterade möss spelar en viktig roll som ett bekräftande adjuvans för att bekräfta närvaron av smärta under förloppet av T. evansi-infektion 2,10.
I detta protokoll demonstrerar vi en ny modell för att utvärdera allodyni och smärta hos möss experimentellt infekterade med T. evansi, som visar en hög korrelation mellan variabler, vilket visar sig vara en stark modell. Dessutom krävs det ett litet antal forskare för att utföra hela proceduren, vilket minskar risken för mänsklig inblandning under experimentet. Det gör det också möjligt för prövaren att replikera målsjukdomen under ett akut förlopp och lägga till flera olika behandlingsläkemedel i den experimentella designen, och därigenom få konsekventa resultat på kort tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes på 10 veckor gamla vuxna schweiziska honmöss (35-55 g). Djuren inhystes i polysulfonburar (3-5 djur per bur) i ett rum med kontrollerad temperatur (21 ± 1 °C), 12 timmars ljus/12 timmars mörkcykel och standard laboratoriemat och vatten ad libitum. Tio djur tilldelades varje grupp i varje test för att påvisa de konsekventa effekterna av läkemedelsbehandlingar. Den experimentella designen lämnades in och godkändes av den etiska kommittén vid Santa Catarina State University (CEUA) (protokollnummer: 6019201123). Alla djurförsök följde ARRIVE-riktlinjerna (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) och utfördes i enlighet med National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Beredning och inokulering av Trypanosoma evansi
VARNING: Bär en engångslabbrock, handskar, mask och ögonskydd när du hanterar infekterade blodamples, reagenser och andra kemiska föreningar.
- Slå på vattenbadsutrustningen och justera den till en konstant temperatur på 37 °C.
- Ta ut ett mikrocentrifugrör som innehåller det bevarade blodprovet ur ultrafrysen (-80 °C). Lägg den i vattenbadet tills blodet tinar.
OBS: Samma isolat bör användas för att infektera alla möss i varje grupp av olika experiment för att upprätthålla ett lika stort antal blodpassager. - Använd fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, 0,1 M) innehållande 60 % D-(+)-glukos (pH 7,4) för att utföra seriespädning (10:1 v v) tills 1 × 104 trypanosomer per 0,1 ml uppnås. Bestäm antalet parasitceller genom manuell cellräkning med hjälp av en Neubauer-kammare på ett mikroskop med en 100x objektivlins2.
- Inokulera 0,1 ml av den utspädda blodlösningen (infekterad grupp), eller samma volym i 0,9 % koksaltlösning vehikel (kontrollgrupp), intraperitonealt, med hjälp av en 26 G 1/2" nål kopplad till en insulinspruta.
2. Installation och drift av elektroniska von Frey-apparater
OBS: Var försiktig med hur erhållna data registreras. Vissa EvF-utrustning har specifika program för att överföra erhållna data från apparaten till andra elektroniska enheter, såsom datorer, surfplattor eller smartphones.
- Slå på EvF-apparaten. Se till att utrustningen är väl laddad innan du påbörjar experimentet, observera batterinivån som visas på utrustningsskärmen och ladda den vid behov.
- Anslut EvF-apparaten till den valda elektroniska enheten via Wi-Fi för att överföra och spara erhållna data.
- Sätt in en 10 μL polypropenspets i EvF-apparatens kon och ställ in avläsningen på noll (0.00 g) genom att trycka på knappen med en tasssymbol.
- Observera att när den utvärderade vävnaden har undersökts; det maximala applicerade trycket visas på EvF-apparatens display. Överför den sedan till den valda elektroniska enheten genom att trycka på knappen med en antennsymbol för säker inspelning.
- Återställ avläsningen till noll och gör dig redo att göra en ny mätning genom att helt enkelt trycka på knappen med tasssymbolen igen.
3. Allmänna överväganden för mekaniska tröskelbedömningar
- Utför alla experiment i ett tyst rum med kontrollerad temperatur vid 21 °C och en 12 timmars ljus/12 timmars mörkcykel, och se till att respektera musens cirkadiska cykel genom att utföra alla utvärderingar vid samma tidpunkt på dag2.
- Låt samma person utföra både baslinjebedömningar och experimentella mekaniska tröskelbedömningar för att minska bias och säkerställa mätkonsistens; Se till att experimenten är blindade.
- Placera varje mus försiktigt inuti en enskild kammare av polymetylmetakrylat (PMMA) med en perforerad topp placerad på ett 5 mm² nätgolvstativ 2,8.
- Låt mössen acklimatisera sig i 30 minuter i PMMA-kamrarna innan du bedömer både baslinje- och experimentella mekaniska trösklar2.
- Placera golvstativet i nät på en bekväm höjd (på en stadig yta) så att djuren är tillgängliga från alla sidor. Se till att buken och mössens alla fyra tassar är lättillgängliga genom nätgolvöppningarna.
- Täck den stadiga ytan som används för att fördela kamrarna med absorberande material för att absorbera eller samla in miktion och avföring. Se till att utredarens armar kan röra sig fritt under kamrarna när du använder EvF-apparaten.
4. Bedömning av mekanisk tröskel vid baslinjen och musens svar på stimuli
- För bukmätningar, dela upp buken i tre virtuella delar (kraniala, medelstora och kaudala områden). Välj kranialområdet (anatomiskt innehållande levern) som standardmålvävnad för bedömning av visceral allodyni, mekanisk tröskel. För tassmått, välj rätt baktass för standardisering.
- Gör en baslinjemätning från varje mus 48 timmar före infektionen. För att göra det, placera mössen i de innehållande kamrarna, förbered EvF-apparaten och använd båda händerna för att höja sonden långsamt för att stimulera den riktade vävnaden.
- Öka gradvis trycket på vävnaden tills musen uttrycker ett nociceptivt beteende. För utvärdering av höger baktass, leta efter tassindragning, tassslickning eller fyrtasshoppning 2,8,9. För visceral utvärdering, leta efter en skarp indragning av buken, omedelbar slickning eller skrapning av det undersökta stället, eller fyrtasshoppning 2,11.
- Spara det erhållna värdet genom att överföra data till den valda elektroniska enheten som innehåller det specifika EvF-programmet eller skriva det i en betygsbok. Återställ displayen till noll och upprepa processen fyra gånger för att få fem mätningar8.
OBS: Tänk bara på tre liknande mätningar för att uppskatta medelvärdet2 - Mät den mekaniska tröskeln för musen som finns i den intilliggande kammaren tills varje mus har undersökts fem gånger och ett medelvärde erhålls för varje djur.
- Upprepa baslinjemätningarna 24 timmar senare och uteslut möss med medelvärden under 3,00 g eller med skillnader mellan basala mätningar högre än 2,00 g 2,8.
OBS: Endast en målvävnad måste väljas för varje mus i varje försök så att djuren inte vänjer sig vid att bli undersökta, eftersom antalet utvärderingar skulle bli betydligt högre på kort tid.
5. Experimentell bedömning av mekanisk tröskel för höger baktass och visceral allodyni
- Bedöm den mekaniska tröskeln för höger baktass eller visceral allodyni 1 timme efter infektionen för utvärdering dag 0.
- Upprepa proceduren var 24:e timme under 5 dagar efter infektion.
OBS: om det finns en behandling som ska administreras, välj en lämplig tidpunkt inom den experimentella designen. - Sätt tillbaka mössen i sina ursprungliga burar för att förhindra att djuren slåss mot varandra, med tillgång till standard labbmat och vatten ad libitum efter att mätningarna är klara.
- Utför ett normalitetstest för att kontrollera den normala fördelningen av data och ytterligare lämplig statistisk analys av insamlade data.
6. Bedömning av musgrimasskala
- Se till att varje mus är lätt att se när den är inne i den innehållande kammaren och undersök varje mus före experimentet för att säkerställa att det inte finns några lesioner på lemmarna, buken eller ansiktet och inga pälsförändringar.
- Observera musens omloppsområde. Klassificera öppna ögon som en frånvaro av smärta (poäng 0) medan en uppenbar smärta kan representeras när musen stänger ögonen (poäng 2).
- Observera musens nos. Klassificera en normal näsa som frånvaron av smärta medan närvaron av en utbuktning på näsryggen representerar uppenbar smärta.
- Observera musens kinder. Klassificera normala kinder som frånvaron av smärta medan närvaron av en utbuktning på båda kinderna representerar uppenbar smärta.
- Observera positionen för musens öron. Klassificera rundade öron som frånvaron av smärta medan öron som roterar utåt eller bakåt, bort från ansiktet, i en spetsig form, representerar uppenbar smärta. Utrymmet mellan öronen ökar med smärtpoängen.
- Observera musens morrhår. Klassificera morrhår med sin naturliga nedåtgående kurva som frånvaron av smärta, medan morrhår som antingen dras tillbaka mot kinden eller dras framåt representerar uppenbar smärta.
- Eftersom medfödda beteenden, såsom självtvättning, kan störa ansiktsuttrycket, betrakta inte dessa som smärtrelaterade beteenden8. Vänta tills musen har stoppat det här beteendet före varje utvärdering av åtgärdsenheten.
- Utför ett normalitetstest för att kontrollera den normala fördelningen av data och ytterligare lämplig statistisk analys av insamlade data.
OBS: I slutet av alla experiment avlivades mössen på ett humant sätt med ketamin (90 mg/kg) och xylazin (7,5 mg/kg), som injicerades intraperitonealt. Efter att ha nått en bekräftad djup anestesiplan utsattes de för cervikal luxation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Minskning av den mekaniska tröskeln på grund av T. evansi-infektion utvärderad med elektronisk von Frey-apparat på både höger baktass och viscerala vävnader
Experimentet genomfördes under 5 dagar, enligt tidigare data relaterade till det tillgängliga T. evansi sample2. Infekterade möss började visa en signifikant skillnad i mekanisk tröskel på höger baktass dag 3 efter infektion och förblev signifikant lägre än kontrollgruppen under de följande 2 dagarna efter infektion (Figur 1A) jämfört med oinfekterade möss. Liknande resultat för abdominal känselkänslighet visade visceral allodyni hos infekterade möss från och med dag 3 efter infektion och förblev signifikant lägre än kontrollgruppen under de följande 2 dagarna efter infektion (Figur 1B).
Figur 1: Allodyniutvärdering av möss experimentellt infekterade med Trypanosoma evansi. (A) Allodyni på höger baktass och (B) visceral allodyni. Data uttryckta som medelvärdet ± SD för tio djur i varje försöksgrupp. Statistisk analys: Elevens t-test, en oparad analys per tidpunkt. Asterisker visar signifikanta skillnader mellan experimentella grupper som betraktar samma analyserade tidpunkt (p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Induktion av mussmärtrelaterade ansiktsdrag med T. evansi-infektion och numerisk tolkning med Mouse Grimace Scale smärtbedömning
Infekterade möss började uppvisa signifikanta tecken på smärtrelaterade ansiktsdrag på dag 3 efter infektion, och visade en genomsnittlig poäng på 0,4 [0-1] vid den angivna tidpunkten. Samma tendens observerades under experimentet, där den infekterade gruppen uppvisade signifikanta skillnader jämfört med kontrollgruppen, med medelvärden på 0,6 [0-1] och 1,3 [0-2] för dag 4 respektive 5 efter infektion. Kontrollgruppen fick inte poäng på Mouse Grimace Scale, som förväntat. Den statistiska analysen utfördes med hjälp av Students t-test, en oparad analys per tidpunkt, där man ansåg att ett värde på p < 0,05 var signifikant. Dessutom identifierade Pearsons korrelationskoefficient (r) interaktionsmönster mellan smärtskattningen på Mouse Grimace Scale och höger baktassallodyni eller mellan samma skala och visceral allodyni, vilka värden var -96,35 % respektive -84,08 %. Dessutom var bestämningskoefficienterna (R2) för smärtbedömning på Mouse Grimace Scale och höger baktassallodyni eller visceral allodyni 0,9283 respektive 0,7070.
Den aktuella studien stämmer överens med tidigare data, som bekräftade förekomsten av inflammation och smärta under förloppet av T. evansi infektion 2,3,7,12. Dessutom ger den beskrivna metoden en exakt metodik för att identifiera och mäta allodyni och smärta hos möss. Dessutom indikerade användningen av Mouse Grimace Scale smärtbedömning hos infekterade möss en mycket hög negativ r (90 till 100 %) jämfört med de resultat som uttrycktes av utvärderingen av höger baktassallodyni och hög negativ r (70 till 89 %) för visceral allodyniutvärdering av respektive djur13. På liknande sätt indikerade användningen av smärtbedömning av Mouse Grimace Scale hos infekterade möss ett mycket starkt R2 (0,90 till 1,00) jämfört med de resultat som uttrycktes av utvärderingen av höger baktassallodyni och starkt R2 (0,70 till 0,89) för visceral allodyniutvärdering av samma djur14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg i experiment på infekterade djur är kontrollen av parasiteminivåerna. Olika stammar av T. evansi kan bete sig på olika sätt hos möss, vilket leder från akuta till kroniska infektioner 2,4,5,6. Dessutom kan förändringar i infektionsdosen minska eller förlänga överlevnadstiden för möss. Därför rekommenderas att man tar fram en överlevnadskurva före experimenten för att bestämma den korrekta perioden för experimentet och förhindra frustration med oväntade musdödsfall 15,16. Dessutom kan dessa data bestämma humana effektmått för experimentet, om tillämpligt.
Dessutom måste samma isolat användas för att infektera alla möss i experimentet för att respektera ett lika stort antal blodpassager, som förklaras i protokollavsnittet. På samma sätt kan kryokonserverat eller färskt infekterat blod användas för att infektera mössen, eftersom vissa kryokonserverade prover kan inaktiveras efter upptining i ett vattenbad. Färskt infekterat blod kan dock ge snabbare parasitemi och därmed tidigare dödsfall17,18.
Modifieringar i experimentet, såsom tillsats av trypanocidala eller smärtstillande läkemedel, är genomförbara. Nya grupper innebär fler djur och det är viktigt att komma ihåg att även kontrollgrupper för de valda läkemedlen måste genomgå baslinjemätningar. Enligt vår erfarenhet utesluts cirka 20-25 % av mössen från experimentet efter den andra baslinjemätningen, vilket överensstämmer med tidigare data8. Detta innebär att det initiala antalet djur måste vara högre än det experimentella antalet djur, vilket kan vara ett problem när fler grupper utvärderas och därmed ett högre antal möss uppskattas.
Farmakokinetik och farmakodynamik måste beaktas för denna modell. Vissa läkemedel tar längre tid på sig att utöva sin farmakologiska verkan, vilket kan påverka den experimentella utformningen av en modell där möss vanligtvis dör i genomsnitt 4 till 5 dagar2,6. Dessutom, om djuren fastar för den valda behandlingen, kan acklimatiseringsperioden vara en viktig faktor att ta hänsyn till, eftersom den kommer att påverka både läkemedelsdynamiken och experimentschemat och proceduren, som rapporterats i protokollavsnittet.
En stor förbättring med den nuvarande metoden är att en enda välutbildad forskare kan utföra hela EvF-avläsningsproceduren (både baslinjemätningar och experimentella mätningar) samtidigt som han är blind för infektionen eller behandlingarna. En annan utredare måste utföra infektionen i början av experimentet. Detta är inte nödvändigt efter infektionsproceduren, eftersom EvF-apparaten har ett specifikt von Frey Wi-Fi-mätprogram som endast tillåter en person att använda utrustningen fullt ut. Dessutom är denna metod snabbare än den vanliga Filament von Frey-utrustningen och lättare att utföra 8,19.
Trötthet kan dock vara en komplikation, eftersom samma forskare måste utföra alla djuravläsningar och kan utveckla utmattning på grund av den repetitiva rörelsen efter en tid8. Med hänsyn till den förväntade överlevnaden för möss infekterade med T. evansi, uppmuntras inte ett stort antal grupper i den experimentella designen. Enligt vår erfarenhet kan i genomsnitt 10 möss åt gången (beroende på experimentell design) mätas på mindre än 30 minuter. Dessutom måste endast en målvävnad väljas för varje mus i varje experiment så att djuren inte vänjer sig vid att bli undersökta, vilket förklaras i protokollavsnittet, vilket också minskar risken för att utredaren utvecklar trötthet.
Dessutom behöver både EvF (höger baktass och viscerala mätningar) och Mouse Grimace Scale-bedömningar välutbildade forskare. Innan experimenten utförs måste utredaren tillbringa långa perioder med att öva. För att korrekt utvärdera förändringarna i ansiktsuttryck hos möss måste forskaren känna till inte bara de förväntade förändringarna utan också det normala ansiktsuttrycket hos en vanlig mus och dess variationer av normalitet och beteenden10,20. Dessutom, för att korrekt utvärdera mössens mekaniska tröskel med hjälp av EvF-apparaten, måste forskaren upprepa flera baslinjemätningar tills musens svar på sondstimuli lätt känns igen och konsistens uppnås 2,8.
Framtida tillämpningar av protokollet involverar utvärdering av allodyni och smärta, samt dess behandling, på möss infekterade av T. evansi. Den aktuella modellen gör det möjligt för forskare att utvärdera den smärtrelaterade patogenesen av en sjukdom som vanligtvis finns hos boskap, hos möss under en kontrollerad miljö i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna riktar ett särskilt tack till Santa Catarina State University för ekonomiskt stöd, till farmakologilaboratoriet för djuren och rymden och till Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory för det kryokonserverade blodprovet infekterat med T. evansi som användes i dessa experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 G 1/2" needle coupled to insulin syringe | TKL | 80288090100 | Used to infund solutions on laboratory animals |
| Accessories for von Frey analgesimeter | INSIGHT | EFF 303 | Containment box with support for digital analgesimeter assessment |
| D-(+)-Glucose | SIGMA-ALDRICH | G7021 | A monosaccharide which is the main source of energy in the form of ATP for living organisms |
| Digital analgesimeter | INSIGHT | von Frey Wi-Fi | The von Frey Wi-Fi is a portable device used to assess tissue sensitivity to mechanical stimuli |
| Gilson type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18261 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for hind paw allodynia assessment |
| Laboratory water bath | BEING INSTRUMENT | BW-22P | Used to heat liquid and semi-solid substances contained in appropriate recipients to specific temperature |
| Phosphate buffered saline | SIGMA-ALDRICH | 806552 | A balanced salt solution buffer used for a variety of cell culture applications |
| Swiss mice (Mus musculus) from both gender | UFSC | Swiss Webster | Laboratory animals used for controlled experiments |
| Trypanosoma evansi cryiopreserved sample | UDESC | - | Sample used to infect all mice, ceded by the Hemoparasites and Vectors Biochemistry Laboratory |
| Universal type 10 µL polypropylene tip | CRALPLAST | 18171 | Polypropylene to be used on eletronic von Frey apparatus, recommended for visceral allodynia assessment |
References
- Desquesnes, M., et al. Trypanosoma evansi and surra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects. BioMed Research International. 2013, 194176 (2013).
- Cipriani, D. S., et al. Experimental Trypanosoma evansi infection induces pain along with oxidative stress, prevented by COX-2 inhibition. Experimental Parasitology. 247, 108477 (2023).
- Paim, F. C., et al. Cytokines in rats experimentally infected with Trypanosoma evansi. Experimental Parasitology. 128 (4), 365-370 (2011).
- Gillingwater, K., et al. In vivo investigations of selected diamidine compounds against Trypanosoma evansi using a mouse model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 5074-5079 (2009).
- Dkhil, M. A., et al. Treatment of Trypanosoma evansi-infected mice with Eucalyptus camaldulensis led to a change in brain response and spleen immunomodulation. Frontiers in Microbiology. 13, 833520 (2022).
- Dkhil, M. A., et al. Murine liver response to Allium sativum treatment during infection induced-trypanosomiasis. Saudi Journal of Biological Sciences. 28 (6), 3270-3274 (2021).
- Martins de Moraes, C., et al. Infection by Trypanosoma evansi in horses from Brazil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. 102 (561-562), 159-163 (2007).
- Martinov, T., et al. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of Visualized Experiments. 82, e51212 (2013).
- Rodríguez-Angulo, H., et al. Role of TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas' disease. Experimental Parasitology. 134 (4), 422-429 (2013).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7, 447-449 (2010).
- Eijkelkamp, N., et al. Increased visceral sensitivity to capsaicin after DSS-induced colitis in mice: spinal cord c-Fos expression and behavior. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (4), 749-757 (2007).
- Mekata, H., et al. Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi. Journal of Veterinary Medical Science. 77 (8), 1017-1019 (2015).
- Mukaka, M. M. Statistics corner: a guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Schober, P., et al. Correlation coefficients: appropriate use and interpretation. Anesthesia and Analgesia. 126 (5), 1763-1768 (2018).
- Kamidi, C. M., et al. Differential virulence of camel Trypanosoma evansi isolates in mice. Parasitology. 145 (9), 1235-1242 (2018).
- Mekata, H., et al. Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates. Parasitology Research. 112, 1513-1521 (2013).
- Silva, A. S., et al. Trypanosoma evansi pathogenicity strain in rats inoculated with parasite in fresh and cryopreserved blood. Ciência Rural. 39 (6), 1842-1846 (2009).
- Silva, A. S., et al. Acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain and spinal cord of rats infected with Trypanosoma evansi. Veterinary Parasitology. 175, 237-244 (2011).
- Diógenes, A. K. L., et al. Concurrent validity of electronic von Frey as an assessment tool for burn associated pain. Burns. 46 (6), 1328-1336 (2020).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17, 45-59 (2016).
