توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية عن طريق الإفراط في التعبير عن التصلب المشترك والتوتر أحادي المحور 2D
Summary
توضح هذه المقالة إجراء لإنتاج iTenocytes عن طريق توليد خلايا انسجة اللحمة المتوسطة المشتقة من iPSC مع الإفراط في التعبير المشترك عن Scleraxis باستخدام ناقل عدسي فيروسي وتمدد أحادي المحور عبر مفاعل حيوي 2D.
Abstract
تتطلب تحديات اليوم في إصلاح الأوتار والأربطة تحديد مرشح مناسب وفعال للعلاج القائم على الخلايا لتعزيز تجديد الأوتار. تم استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة (MSCs) كاستراتيجية محتملة لهندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار. في حين أنها متعددة القدرات ولديها إمكانات التجدد في الجسم الحي ، إلا أنها محدودة في قدرتها على التجديد الذاتي وتظهر عدم تجانس النمط الظاهري. يمكن للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التحايل على هذه القيود بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي واللدونة التنموية التي لا مثيل لها. في تطور tenocyte ، Scleraxis (Scx) هو منظم جزيئي مباشر حاسم لتمايز الأوتار. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التنظيم الميكانيكي عنصر مركزي يوجه تطور الأوتار الجنينية والشفاء. على هذا النحو ، قمنا بتطوير بروتوكول لتغليف التأثير التآزري للتحفيز البيولوجي والميكانيكي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. تم حث iPSCs لتصبح خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (iMSCs) وتم تمييزها بعلامات الخلايا اللحمية المتوسطة الكلاسيكية عبر قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، تم تحويل iMSCs إلى SCX بشكل ثابت (iMSCSCX +). يمكن أن تنضج خلاياiMSC SCX + هذه إلى خلايا iTenocytes عبر تحميل الشد أحادي المحور باستخدام مفاعل حيوي 2D. تميزت الخلايا الناتجة بمراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الخلايا iTenocytes لمساعدة الباحثين في تطوير مصدر غير محدود للخلايا الخيفية الجاهزة لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.
Introduction
لمعالجة المشكلات المعاصرة في إصلاح الأوتار والأربطة ، هناك حاجة إلى مرشح خلية ذي صلة مناسب للعلاجات القائمة على الخلايا. تتضمن إحدى طرق التحقيق في هندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs) والخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs) كاستراتيجيات محتملة. تتمتع هذه الخلايا بقدرة متعددة القدرات ووفرة كبيرة وإمكانات متجددة في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فقد أظهروا قدرة شفاء محسنة ونتائج وظيفية محسنة في النماذج الحيوانية1. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا تظهر قدرات محدودة على التجديد الذاتي ، وتنوع النمط الظاهري ، وعلى وجه الخصوص ، قدرة محدودة على تكوين الأوتار. توفر تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) حلا لهذه القيود نظرا لقدرتها الرائعة على التجديد الذاتي وقدرتها على التكيف التنموي التي لا مثيل لها. حقق فريق البحث لدينا وآخرون تمايزا ناجحا ل iPSCs إلى كيانات تشبه الخلايا اللحمية المتوسطة (iMSCs) 2,3. على هذا النحو ، فإن iMSCs لديها القدرة على أن تكون مصدرا خيفيا لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.
التصلب (SCX) هو عامل نسخ ضروري لتطور الأوتار ويعتبر أقدم علامة يمكن اكتشافها للخلايا الوترية المتمايزة. بالإضافة إلى ذلك ، ينشط SCX علامات تمايز الأوتار النهائية ، بما في ذلك الكولاجين من النوع 1a1 (COL1a1) والموهوك (MKX) والتينومودولين (TNMD) ، من بين أمور أخرى4،5،6. تشمل الجينات الأخرى التي يتم التعبير عنها أثناء نضوج الأوتار عضو عائلة البروتين المعزز لبلمرة التوبولين 3 (TPPP3) ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRa)7. في حين أن هذه الجينات ضرورية لتطور الأوتار ونضجها ، إلا أنها للأسف ليست فريدة من نوعها لأنسجة الأوتار ويتم التعبير عنها في الأنسجة العضلية الهيكلية الأخرى مثل العظام أو الغضاريف 5,7.
بالإضافة إلى التعبير عن العلامات أثناء نمو الأوتار ، يعد التحفيز الميكانيكي عنصرا أساسيا لتطور الأوتار الجنينية والشفاء4،5،6. الأوتار مستجيبة ميكانيكيا ، وتتغير أنماط نموها استجابة لبيئتها. على المستوى الجزيئي ، تؤثر الإشارات الميكانيكية الحيوية على التطور والنضج والصيانة واستجابات الشفاء للخلاياالوترية 8. تم استخدام أنظمة مفاعلات حيوية مختلفة لنمذجة الأحمال الفسيولوجية والإشارات الميكانيكية الحيوية. تتضمن بعض هذه الأنظمة النموذجية تحميل الأنسجة خارج الجسم الحي ، وأنظمة تحميل الخلايا 2D التي تطبق التوتر ثنائي المحور أو أحادي المحور ، وأنظمة 3D باستخدام السقالات والهلاميات المائية 9,10. تعد أنظمة 2D مفيدة عند دراسة تأثيرات التحفيز الميكانيكي على الجينات الخاصة بالوتر أو مورفولوجيا الخلايا في سياق مصير الخلية ، بينما يمكن لأنظمة 3D تكرار تفاعلات الخلية و ECM بدقةأكبر 9,10.
في أنظمة التحميل 2D ، يكون الضغط بين الخلايا وركيزة الثقافة متجانسا ، مما يعني أنه يمكن التحكم بشكل كامل في الحمل المطبق على الهيكل الخلوي للخلايا. بالمقارنة مع التحميل ثنائي المحور ، فإن التحميل أحادي المحور أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ، حيث تتعرض الخلايا الوترية في الغالب للتحميل أحادي المحور من حزم الكولاجين في الجسم الحي9. وجد أنه خلال الأنشطة اليومية ، تتعرض الأوتار لتحميل شد أحادي المحور يصل إلى 6٪ إجهاد11. على وجه التحديد ، وجدت الدراسات السابقة أن التحميل ضمن النطاقات الفسيولوجية من 4٪ -5٪ قد ثبت أنه يعزز تمايز الوتر من خلال الحفاظ على تعبير العلامات المرتبط بالوتر مثل SCX و TNMD ، بالإضافة إلى زيادة إنتاج الكولاجين 9,10. قد تكون السلالات التي تزيد عن 10٪ ذات صلة بالصدمة ولكنها ليست ذات صلة من الناحية الفسيولوجية 12,13.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول يأخذ في الاعتبار التأثير التآزري للتحفيز الميكانيكي والبيولوجي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. نصف أولا طريقة قابلة للتكرار لحث iPSCs في iMSCs عن طريق التعرض قصير المدى للأجسام الجنينية لعوامل النمو ، والتي تؤكدها علامات سطح MSC باستخدام قياس التدفق الخلوي. ثم نقوم بتفصيل طريقة نقل الفيروسات العدسية لهندسة iMSCs للحصول على تعبير مفرط مستقر عن SCX (iMSCSCX +). لمزيد من نضوج الخلايا ، يتم زرع iMSCSCX + في ألواح سيليكون مغلفة بالفبرونيكتين وتخضع لبروتوكول توتر أحادي المحور محسن باستخدام مفاعل حيوي CellScale MCFX. تم تأكيد إمكانات الوتر من خلال مراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين14. هذه الطريقة لتوليد iTenocytes هي إثبات للمفهوم قد يوفر مصدرا خيفيا غير محدود لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء iTenocytes من خلال ثلاث خطوات رئيسية: (1) تحريض iPSCs إلى iMSCs ، (2) الإفراط في التعبير عن SCX باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، و (3) نضوج الخلايا من خلال التوتر أحادي المحور ثنائي الأبعاد.
تم وصف البروتوكول المقدم للتمييز بين iPSCs إلى iMSCs مسبقا من قبل مجموعتنا<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل NIH / NIAMS K01AR071512 و CIRM DISC0-14350 إلى ديمتري شين. كانت بلازميدات تغليف الفيروسات العدسية هدية من مختبر سيمون نوت (قسم العلوم الطبية الحيوية ، مركز Cedars-Sinai الطبي).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
- Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
- Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
- Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
- Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
- Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
- Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
- Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
- Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
- Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
- Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
- Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
- Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
- Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
- Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
- Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
- McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
- Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
- Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
- Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
- Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
- Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).
