Génération d’iténocytes induits dérivés de cellules souches pluripotentes via une surexpression combinée de la scléraxie et une tension uniaxiale 2D
Summary
Cet article décrit un procédé de production d’iténocytes en générant des cellules stromales mésenchymateuses dérivées d’iPSC avec une surexpression combinée de la sclérax à l’aide d’un vecteur lentiviral et d’un étirement uniaxial via un bioréacteur 2D.
Abstract
Les défis actuels en matière de réparation des tendons et des ligaments nécessitent l’identification d’un candidat approprié et efficace pour la thérapie cellulaire afin de favoriser la régénération des tendons. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont été explorées comme une stratégie potentielle d’ingénierie tissulaire pour la réparation des tendons. Bien qu’ils soient multipotents et aient un potentiel de régénération in vivo, ils sont limités dans leur capacité d’auto-renouvellement et présentent une hétérogénéité phénotypique. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent contourner ces limitations en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement et de leur plasticité développementale inégalée. Dans le développement des ténocytes, la sclérax (Scx) est un régulateur moléculaire direct crucial de la différenciation des tendons. De plus, il a été démontré que la mécanorégulation est un élément central guidant le développement et la cicatrisation des tendons embryonnaires. À ce titre, nous avons développé un protocole pour encapsuler l’effet synergique de la stimulation biologique et mécanique qui peut être essentiel pour générer des ténocytes. Les cellules iPS ont été induites à devenir des cellules stromales mésenchymateuses (CSMi) et ont été caractérisées avec des marqueurs de cellules stromales mésenchymateuses classiques par cytométrie en flux. Ensuite, à l’aide d’un vecteur lentiviral, les iMSCs ont été transduits pour surexprimer de manière stable SCX (iMSCSCX+). Ces cellules iMSCSCX+ peuvent ensuite être mûries en iténocytes par charge de traction uniaxiale à l’aide d’un bioréacteur 2D. Les cellules résultantes ont été caractérisées par l’observation de la régulation positive des marqueurs tendineux précoces et tardifs, ainsi que du dépôt de collagène. Cette méthode de génération d’iténocytes peut être utilisée pour aider les chercheurs à développer une source cellulaire allogénique potentiellement illimitée pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.
Introduction
Pour répondre aux problèmes contemporains de réparation des tendons et des ligaments, il est nécessaire de disposer d’un candidat cellulaire pertinent et adapté aux thérapies cellulaires. L’une des pistes de recherche en ingénierie tissulaire pour la réparation des tendons implique l’exploration des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSC) et des cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) en tant que stratégies potentielles. Ces cellules ont une capacité multipotente, une grande abondance et un potentiel de régénération in vivo. De plus, ils ont montré une capacité de guérison accrue et de meilleurs résultats fonctionnels dans des modèles animaux1. Néanmoins, ces cellules présentent des capacités d’auto-renouvellement limitées, une diversité phénotypique et, notamment, une capacité limitée de formation de tendons. La technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) offre une solution à ces contraintes en raison de sa remarquable capacité d’auto-renouvellement et de son adaptabilité développementale inégalée. Notre équipe de recherche et d’autres chercheurs ont réussi à différencier les cellules iPS en entités stromales mésenchymateuses de type cellules (CSMi)2,3. En tant que tels, les CSMi ont le potentiel d’être une source allogénique pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.
La sclératie (SCX) est un facteur de transcription essentiel au développement des tendons et est considéré comme le marqueur détectable le plus précoce des ténocytes différenciés. De plus, SCX active les marqueurs de différenciation des tendons en aval, notamment le collagène 1 de la chaîne de type 1a1 (COL1a1), le mohawk (MKX) et la ténomoduline (TNMD), entre autres 4,5,6. D’autres gènes exprimés au cours de la maturation tendineuse comprennent le membre 3 de la famille des protéines favorisant la polymérisation de la tubuline (TPPP3) et le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRa)7. Bien que ces gènes soient essentiels au développement et à la maturation des tendons, ils ne sont malheureusement pas propres au tissu tendineux et sont exprimés dans d’autres tissus musculo-squelettiques comme les os ou le cartilage 5,7.
En plus de l’expression de marqueurs au cours du développement tendineux, la mécanostimulation est un élément essentiel pour le développement et la cicatrisation des tendons embryonnaires 4,5,6. Les tendons sont mécanosensibles et leurs schémas de croissance changent en réponse à leur environnement. Au niveau moléculaire, les signaux biomécaniques affectent le développement, la maturation, le maintien et les réponses de guérison des ténocytes8. Divers systèmes de bioréacteurs ont été utilisés pour modéliser les charges physiologiques et les signaux biomécaniques. Certains de ces systèmes modèles comprennent la charge tissulaire ex vivo, les systèmes de charge cellulaire 2D appliquant une tension biaxiale ou uniaxiale, et les systèmes 3D utilisant des échafaudages et des hydrogels 9,10. Les systèmes 2D sont avantageux pour étudier les effets de la stimulation mécanique sur les gènes spécifiques des tendons ou sur la morphologie des cellules dans le contexte du destin cellulaire, tandis que les systèmes 3D peuvent reproduire plus précisément les interactions cellule-ECM 9,10.
Dans les systèmes de chargement 2D, la contrainte entre les cellules et le substrat de culture est homogène, ce qui signifie que la charge appliquée sur le cytosquelette des cellules peut être entièrement contrôlée. Par rapport à la charge biaxiale, la charge uniaxiale est plus pertinente sur le plan physiologique, car les ténocytes sont principalement soumis à une charge uniaxiale provenant de faisceaux de collagène in vivo9. On constate que lors des activités quotidiennes, les tendons sont soumis à une charge de traction uniaxiale allant jusqu’à 6% de la contrainte11. Plus précisément, des études antérieures ont montré qu’il a été démontré qu’une charge dans les plages physiologiques de 4 % à 5 % favorise la différenciation ténogénique en préservant l’expression des marqueurs liés aux tendons comme SCX et TNMD, ainsi qu’une augmentation de la production de collagène 9,10. Des souches de plus de 10 % peuvent être traumatiquement pertinentes, mais pas physiologiquement pertinentes12,13.
Ici, un protocole est présenté qui prend en compte l’effet synergique de la stimulation mécanique et biologique qui peut être essentiel pour la génération de ténocytes. Nous décrivons d’abord une méthode reproductible pour induire des CSPi dans des CSMi via une exposition à court terme des corps embryoïdes à des facteurs de croissance, confirmée par des marqueurs de surface CSM utilisant la cytométrie en flux. Nous détaillons ensuite une méthode de transduction lentivirale pour concevoir des iMSC afin qu’ils aient une surexpression stable de SCX (iMSCSCX+). Pour une maturation cellulaire plus poussée, les iMSCSCX+ sont ensemencés dans des plaques de silicone recouvertes de fibronectine et subissent un protocole de tension uniaxiale optimisé à l’aide du bioréacteur CellScale MCFX. Le potentiel ténogénique a été confirmé par l’observation de la régulation positive des marqueurs tendineux précoces et tardifs, ainsi que du dépôt de collagène14. Cette méthode de génération d’iténocytes est une preuve de concept qui peut offrir une source allogénique illimitée prête à l’emploi pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, les iTénocytes sont générés par trois étapes principales : (1) l’induction des CSPi en CSMi, (2) la surexpression de SCX à l’aide d’un vecteur lentiviral, et (3) la maturation des cellules par tension uniaxiale 2D.
Le protocole présenté pour différencier les CSPi en CSPi a déjà été décrit par notre groupe2. Depuis cette publication, de nombreux protocoles ont été développés, y compris un protocole établi pour l’utilisation d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été partiellement financée par le NIH/NIAMS K01AR071512 et CIRM DISC0-14350 à Dmitriy Sheyn. Les deux plasmides d’emballage de lentivirus ont été offerts par le laboratoire Simon Knott (Département des sciences biomédicales, Centre médical Cedars-Sinai).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
- Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
- Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
- Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
- Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
- Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
- Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
- Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
- Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
- Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
- Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
- Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
- Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
- Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
- Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
- Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
- McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
- Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
- Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
- Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
- Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
- Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).
