توضح هذه المقالة إجراء لإنتاج iTenocytes عن طريق توليد خلايا انسجة اللحمة المتوسطة المشتقة من iPSC مع الإفراط في التعبير المشترك عن Scleraxis باستخدام ناقل عدسي فيروسي وتمدد أحادي المحور عبر مفاعل حيوي 2D.
تتطلب تحديات اليوم في إصلاح الأوتار والأربطة تحديد مرشح مناسب وفعال للعلاج القائم على الخلايا لتعزيز تجديد الأوتار. تم استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة (MSCs) كاستراتيجية محتملة لهندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار. في حين أنها متعددة القدرات ولديها إمكانات التجدد في الجسم الحي ، إلا أنها محدودة في قدرتها على التجديد الذاتي وتظهر عدم تجانس النمط الظاهري. يمكن للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التحايل على هذه القيود بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي واللدونة التنموية التي لا مثيل لها. في تطور tenocyte ، Scleraxis (Scx) هو منظم جزيئي مباشر حاسم لتمايز الأوتار. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التنظيم الميكانيكي عنصر مركزي يوجه تطور الأوتار الجنينية والشفاء. على هذا النحو ، قمنا بتطوير بروتوكول لتغليف التأثير التآزري للتحفيز البيولوجي والميكانيكي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. تم حث iPSCs لتصبح خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (iMSCs) وتم تمييزها بعلامات الخلايا اللحمية المتوسطة الكلاسيكية عبر قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، تم تحويل iMSCs إلى SCX بشكل ثابت (iMSCSCX +). يمكن أن تنضج خلاياiMSC SCX + هذه إلى خلايا iTenocytes عبر تحميل الشد أحادي المحور باستخدام مفاعل حيوي 2D. تميزت الخلايا الناتجة بمراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الخلايا iTenocytes لمساعدة الباحثين في تطوير مصدر غير محدود للخلايا الخيفية الجاهزة لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.
لمعالجة المشكلات المعاصرة في إصلاح الأوتار والأربطة ، هناك حاجة إلى مرشح خلية ذي صلة مناسب للعلاجات القائمة على الخلايا. تتضمن إحدى طرق التحقيق في هندسة الأنسجة لإصلاح الأوتار استكشاف خلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs) والخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs) كاستراتيجيات محتملة. تتمتع هذه الخلايا بقدرة متعددة القدرات ووفرة كبيرة وإمكانات متجددة في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فقد أظهروا قدرة شفاء محسنة ونتائج وظيفية محسنة في النماذج الحيوانية1. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا تظهر قدرات محدودة على التجديد الذاتي ، وتنوع النمط الظاهري ، وعلى وجه الخصوص ، قدرة محدودة على تكوين الأوتار. توفر تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) حلا لهذه القيود نظرا لقدرتها الرائعة على التجديد الذاتي وقدرتها على التكيف التنموي التي لا مثيل لها. حقق فريق البحث لدينا وآخرون تمايزا ناجحا ل iPSCs إلى كيانات تشبه الخلايا اللحمية المتوسطة (iMSCs) 2,3. على هذا النحو ، فإن iMSCs لديها القدرة على أن تكون مصدرا خيفيا لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.
التصلب (SCX) هو عامل نسخ ضروري لتطور الأوتار ويعتبر أقدم علامة يمكن اكتشافها للخلايا الوترية المتمايزة. بالإضافة إلى ذلك ، ينشط SCX علامات تمايز الأوتار النهائية ، بما في ذلك الكولاجين من النوع 1a1 (COL1a1) والموهوك (MKX) والتينومودولين (TNMD) ، من بين أمور أخرى4،5،6. تشمل الجينات الأخرى التي يتم التعبير عنها أثناء نضوج الأوتار عضو عائلة البروتين المعزز لبلمرة التوبولين 3 (TPPP3) ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRa)7. في حين أن هذه الجينات ضرورية لتطور الأوتار ونضجها ، إلا أنها للأسف ليست فريدة من نوعها لأنسجة الأوتار ويتم التعبير عنها في الأنسجة العضلية الهيكلية الأخرى مثل العظام أو الغضاريف 5,7.
بالإضافة إلى التعبير عن العلامات أثناء نمو الأوتار ، يعد التحفيز الميكانيكي عنصرا أساسيا لتطور الأوتار الجنينية والشفاء4،5،6. الأوتار مستجيبة ميكانيكيا ، وتتغير أنماط نموها استجابة لبيئتها. على المستوى الجزيئي ، تؤثر الإشارات الميكانيكية الحيوية على التطور والنضج والصيانة واستجابات الشفاء للخلاياالوترية 8. تم استخدام أنظمة مفاعلات حيوية مختلفة لنمذجة الأحمال الفسيولوجية والإشارات الميكانيكية الحيوية. تتضمن بعض هذه الأنظمة النموذجية تحميل الأنسجة خارج الجسم الحي ، وأنظمة تحميل الخلايا 2D التي تطبق التوتر ثنائي المحور أو أحادي المحور ، وأنظمة 3D باستخدام السقالات والهلاميات المائية 9,10. تعد أنظمة 2D مفيدة عند دراسة تأثيرات التحفيز الميكانيكي على الجينات الخاصة بالوتر أو مورفولوجيا الخلايا في سياق مصير الخلية ، بينما يمكن لأنظمة 3D تكرار تفاعلات الخلية و ECM بدقةأكبر 9,10.
في أنظمة التحميل 2D ، يكون الضغط بين الخلايا وركيزة الثقافة متجانسا ، مما يعني أنه يمكن التحكم بشكل كامل في الحمل المطبق على الهيكل الخلوي للخلايا. بالمقارنة مع التحميل ثنائي المحور ، فإن التحميل أحادي المحور أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ، حيث تتعرض الخلايا الوترية في الغالب للتحميل أحادي المحور من حزم الكولاجين في الجسم الحي9. وجد أنه خلال الأنشطة اليومية ، تتعرض الأوتار لتحميل شد أحادي المحور يصل إلى 6٪ إجهاد11. على وجه التحديد ، وجدت الدراسات السابقة أن التحميل ضمن النطاقات الفسيولوجية من 4٪ -5٪ قد ثبت أنه يعزز تمايز الوتر من خلال الحفاظ على تعبير العلامات المرتبط بالوتر مثل SCX و TNMD ، بالإضافة إلى زيادة إنتاج الكولاجين 9,10. قد تكون السلالات التي تزيد عن 10٪ ذات صلة بالصدمة ولكنها ليست ذات صلة من الناحية الفسيولوجية 12,13.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول يأخذ في الاعتبار التأثير التآزري للتحفيز الميكانيكي والبيولوجي الذي قد يكون ضروريا لتوليد الخلايا الوترية. نصف أولا طريقة قابلة للتكرار لحث iPSCs في iMSCs عن طريق التعرض قصير المدى للأجسام الجنينية لعوامل النمو ، والتي تؤكدها علامات سطح MSC باستخدام قياس التدفق الخلوي. ثم نقوم بتفصيل طريقة نقل الفيروسات العدسية لهندسة iMSCs للحصول على تعبير مفرط مستقر عن SCX (iMSCSCX +). لمزيد من نضوج الخلايا ، يتم زرع iMSCSCX + في ألواح سيليكون مغلفة بالفبرونيكتين وتخضع لبروتوكول توتر أحادي المحور محسن باستخدام مفاعل حيوي CellScale MCFX. تم تأكيد إمكانات الوتر من خلال مراقبة تنظيم علامات الأوتار المبكرة والمتأخرة ، وكذلك ترسب الكولاجين14. هذه الطريقة لتوليد iTenocytes هي إثبات للمفهوم قد يوفر مصدرا خيفيا غير محدود لتطبيقات العلاج بخلايا الأوتار.
في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء iTenocytes من خلال ثلاث خطوات رئيسية: (1) تحريض iPSCs إلى iMSCs ، (2) الإفراط في التعبير عن SCX باستخدام ناقل عدسي فيروسي ، و (3) نضوج الخلايا من خلال التوتر أحادي المحور ثنائي الأبعاد.
تم وصف البروتوكول المقدم للتمييز بين iPSCs إلى iMSCs مسبقا من قبل مجموعتنا<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل NIH / NIAMS K01AR071512 و CIRM DISC0-14350 إلى ديمتري شين. كانت بلازميدات تغليف الفيروسات العدسية هدية من مختبر سيمون نوت (قسم العلوم الطبية الحيوية ، مركز Cedars-Sinai الطبي).
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |