Denne artikel beskriver en procedure til fremstilling af iTenocytter ved at generere iPSC-afledte mesenkymale stromale celler med kombineret overekspression af Scleraxis ved hjælp af en lentiviral vektor og uniaxial strækning via en 2D-bioreaktor.
Dagens udfordringer inden for sene- og ledbåndsreparation kræver identifikation af en passende og effektiv kandidat til cellebaseret terapi for at fremme seneregenerering. Mesenkymale stromale celler (MSC’er) er blevet undersøgt som en potentiel vævsteknisk strategi til reparation af sener. Mens de er multipotente og har regenerativt potentiale in vivo, er de begrænsede i deres selvfornyelseskapacitet og udviser fænotypisk heterogenitet. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) kan omgå disse begrænsninger på grund af deres høje selvfornyelseskapacitet og uovertruffen udviklingsmæssige plasticitet. I tenocytudvikling er Scleraxis (Scx) en afgørende direkte molekylær regulator af senedifferentiering. Derudover har mekanoregulering vist sig at være et centralt element, der styrer embryonal seneudvikling og heling. Som sådan har vi udviklet en protokol til at indkapsle den synergistiske virkning af biologisk og mekanisk stimulering, der kan være afgørende for generering af tenocytter. iPSC’er blev induceret til at blive mesenkymale stromale celler (iMSC’er) og blev karakteriseret med klassiske mesenkymale stromale cellemarkører via flowcytometri. Dernæst blev iMSC’erne ved hjælp af en lentiviral vektor transduceret til stabilt at overudtrykke SCX (iMSCSCX+). Disse iMSCSCX+ celler kan modnes yderligere til iTenocytter via uniaxial trækbelastning ved hjælp af en 2D bioreaktor. De resulterende celler blev karakteriseret ved at observere opreguleringen af tidlige og sene senemarkører såvel som kollagenaflejring. Denne metode til generering af iTenocytter kan bruges til at hjælpe forskere med at udvikle en potentielt ubegrænset allogen cellekilde til senecelleterapiapplikationer.
For at tackle de moderne problemer i sener og ledbåndsreparation er der et krav om en relevant cellekandidat, der er egnet til cellebaserede terapier. En undersøgelsesvej inden for vævsteknik til senereparation involverer udforskning af knoglemarvsafledte mesenkymale stromale celler (BM-MSC’er) og fedtvævsafledte stromale celler (ASC’er) som potentielle strategier. Disse celler har multipotent kapacitet, stor overflod og regenerativt potentiale in vivo. Derudover har de vist forbedret helingsevne og forbedrede funktionelle resultater i dyremodeller1. Ikke desto mindre udviser disse celler begrænsede selvfornyelsesevner, fænotypisk mangfoldighed og især begrænset kapacitet til senedannelse. Induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) tilbyder en løsning på disse begrænsninger på grund af dens bemærkelsesværdige selvfornyelseskapacitet og uovertruffen udviklingstilpasningsevne. Vores forskerteam og andre har opnået en vellykket differentiering af iPSC’er i mesenkymale stromale cellelignende enheder (iMSC’er)2,3. Som sådan har iMSC’er potentialet til at være en allogen kilde til senecelleterapiapplikationer.
Scleraxis (SCX) er en transkriptionsfaktor, der er afgørende for seneudvikling og betragtes som den tidligste detekterbare markør for differentierede tenocytter. Derudover aktiverer SCX nedstrøms senedifferentieringsmarkører, herunder type 1a1 kædekollagen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) og tenomodulin (TNMD), blandt andet 4,5,6. Andre gener udtrykt under senemodning omfatter tubulinpolymerisationsfremmende proteinfamiliemedlem 3 (TPPP3) og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRa)7. Mens disse gener er afgørende for seneudvikling og modning, er de desværre ikke unikke for senevæv og udtrykkes i andre muskuloskeletale væv som knogler eller brusk 5,7.
Ud over ekspressionen af markører under seneudvikling er mekanostimulering et væsentligt element for embryonal seneudvikling og heling 4,5,6. Sener er mekanoresponsive, og deres vækstmønstre ændres som reaktion på deres miljø. På molekylært niveau påvirker biomekaniske signaler udviklingen, modningen, vedligeholdelsen og helingsresponserne af tenocytter8. Forskellige bioreaktorsystemer er blevet brugt til at modellere fysiologiske belastninger og biomekaniske signaler. Nogle af disse modelsystemer inkluderer ex vivo-vævsbelastning, 2D-cellebelastningssystemer, der anvender biaksial eller uniaxial spænding, og 3D-systemer, der bruger stilladser og hydrogeler 9,10. 2D-systemer er fordelagtige, når man studerer den mekaniske stimulerings virkninger på enten senespecifikke gener eller cellernes morfologi i forbindelse med celleskæbne, mens 3D-systemer mere præcist kan replikere celle-ECM-interaktioner 9,10.
I 2D-belastningssystemer er belastningen mellem cellerne og kultursubstratet homogen, hvilket betyder, at den påførte belastning på cellernes cytoskelet kan kontrolleres fuldt ud. I sammenligning med bi-aksial belastning er uniaxial belastning mere fysiologisk relevant, da tenocytter overvejende udsættes for uniaxial belastning fra kollagenbundter in vivo9. Det konstateres, at sener under daglige aktiviteter udsættes for uniaxial trækbelastning op til 6% belastning11. Specifikt har tidligere undersøgelser vist, at belastning inden for de fysiologiske områder på 4% -5% har vist sig at fremme tenogen differentiering ved at bevare senerelateret markørekspression som SCX og TNMD samt øget kollagenproduktion 9,10. Stammer på mere end 10% kan være traumatisk relevante, men ikke fysiologisk relevante12,13.
Her præsenteres en protokol, der tager højde for den synergistiske virkning af mekanisk og biologisk stimulering, som kan være afgørende for dannelsen af tenocytter. Vi beskriver først en reproducerbar metode til at inducere iPSC’er i iMSC’er via kortvarig eksponering af embryoidlegemer for vækstfaktorer, bekræftet af MSC-overflademarkører ved hjælp af flowcytometri. Vi beskriver derefter en lentiviral transduktionsmetode til at konstruere iMSC’er til at have stabil overekspression af SCX (iMSCSCX+). For yderligere cellemodning podes iMSCSCX+ i fibronectinbelagte silikoneplader og gennemgår en optimeret uniaxial spændingsprotokol ved hjælp af CellScale MCFX-bioreaktor. Det tenogene potentiale blev bekræftet ved at observere opregulering af tidlige og sene senemarkører samt kollagenaflejring14. Denne metode til generering af iTenocytter er et proof-of-concept, der kan tilbyde en ubegrænset hyldevare, allogen kilde til senecelleterapiapplikationer.
I denne protokol genereres iTenocytter gennem tre hovedtrin: (1) induktion af iPSC’er til iMSC’er, (2) overekspression af SCX ved hjælp af en lentiviral vektor og (3) modning af celler gennem 2D uniaxial spænding.
Den protokol, der præsenteres for differentiering af iPSC’er i iMSC’er, er tidligere beskrevet af vores gruppe2. Siden denne offentliggørelse er der udviklet adskillige protokoller, herunder en etableret protokol til brug af iMSC’er i kliniske forsøg 21,2…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev delvist støttet af NIH / NIAMS K01AR071512 og CIRM DISC0-14350 til Dmitriy Sheyn. De to lentivirusemballageplasmider var en gave fra Simon Knott-laboratoriet (Institut for Biomedicinsk Videnskab, Cedars-Sinai Medical Center).
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |