יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי
Summary
מאמר זה מתאר הליך לייצור iTenocytes על ידי יצירת תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם ב-iPSC עם ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס באמצעות וקטור לנטי-ויראלי ומתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי.
Abstract
האתגרים הקיימים כיום בתיקון גידים ורצועות מחייבים איתור מועמד מתאים ויעיל לטיפול תאי לקידום התחדשות הגידים. תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) נחקרו כאסטרטגיה פוטנציאלית להנדסת רקמות לתיקון גידים. בעוד שהם רב-פוטנטיים ויש להם פוטנציאל התחדשות in vivo, הם מוגבלים ביכולת ההתחדשות העצמית שלהם ומפגינים הטרוגניות פנוטיפית. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים לעקוף מגבלות אלה בשל יכולת ההתחדשות העצמית הגבוהה שלהם והפלסטיות ההתפתחותית שאין דומה לה. בהתפתחות טנוציטים, סקלרקסיס (Scx) הוא וסת מולקולרי ישיר חיוני של התמיינות גידים. בנוסף, הוכח כי מכנורגולציה היא מרכיב מרכזי המנחה את התפתחות וריפוי הגידים העובריים. לכן, פיתחנו פרוטוקול לתמצת את ההשפעה הסינרגטית של גירוי ביולוגי ומכני שעשוי להיות חיוני ליצירת טנוציטים. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו לתאי סטרומה מזנכימליים (iMSCs) ואופיינו בסמנים קלאסיים של תאי סטרומה מזנכימליים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, באמצעות וקטור לנטי-ויראלי, ה-iMSCs הומרו ל-SCX בעל ביטוי יתר יציב (iMSCSCX+). תאי iMSCSCX+ אלה יכולים להבשיל עוד יותר ל-iTenocytes באמצעות העמסת מתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי. התאים שהתקבלו אופיינו על ידי התבוננות upregulation של סמנים גידים מוקדמים ומאוחרים, כמו גם שקיעת קולגן. שיטה זו של יצירת iTenocytes יכולה לשמש כדי לסייע לחוקרים בפיתוח מקור תאים אלוגני בלתי מוגבל מהמדף עבור יישומי טיפול בתאי גידים.
Introduction
כדי להתמודד עם הבעיות העכשוויות בתיקון גידים ורצועות, יש דרישה למועמד מתאים מתאים לטיפולים מבוססי תאים. אפיק מחקר אחד בהנדסת רקמות לתיקון גידים כרוך בחקר תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם במח עצם (BM-MSCs) ותאי סטרומה שמקורם ברקמת שומן (ASC) כאסטרטגיות אפשריות. תאים אלה הם בעלי יכולת רב-עוצמה, שפע רב ופוטנציאל התחדשות in vivo. בנוסף, הם הראו יכולת ריפוי משופרת ותוצאות תפקודיות משופרות במודלים של בעלי חיים1. עם זאת, תאים אלה מפגינים יכולות התחדשות עצמית מוגבלות, מגוון פנוטיפי, ובעיקר, יכולת מוגבלת ליצירת גידים. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מציעה פתרון לאילוצים אלה בשל יכולת ההתחדשות העצמית יוצאת הדופן שלה ויכולת ההסתגלות ההתפתחותית שאין דומה לה. צוות המחקר שלנו ואחרים השיגו התמיינות מוצלחת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לישויות דמויות תאי סטרומה מזנכימליים (iMSCs)2,3. ככאלה, iMSCs יש פוטנציאל להיות מקור allogenic עבור יישומים טיפול בתאי גידים.
סקלרקסיס (SCX) הוא גורם שעתוק חיוני להתפתחות הגידים ונחשב לסמן המוקדם ביותר הניתן לגילוי עבור טנוציטים ממוינים. בנוסף, SCX מפעיל סמני התמיינות גידים במורד הזרם, כולל קולגן שרשרת 1a1 סוג 1 (COL1a1), מוהוק (MKX) וטנומודולין (TNMD), בין היתר 4,5,6. גנים אחרים המתבטאים במהלך הבשלת הגידים כוללים חלבון מקדם פילמור טובולין 3 (TPPP3) וקולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRa)7. בעוד גנים אלה חיוניים להתפתחות הגידים ולהבשלתם, למרבה הצער הם אינם ייחודיים לרקמת הגידים ומתבטאים ברקמות שרירים ושלד אחרות כמו עצם או סחוס 5,7.
בנוסף לביטוי הסמנים במהלך התפתחות הגיד, מכנוסטימולציה היא מרכיב חיוני להתפתחות וריפוי גידים עובריים 4,5,6. הגידים הם מכניים, ודפוסי הצמיחה שלהם משתנים בתגובה לסביבתם. ברמה המולקולרית, רמזים ביומכניים משפיעים על ההתפתחות, ההתבגרות, התחזוקה והריפוי של טנוציטים8. מערכות ביוריאקטורים שונות שימשו למידול עומסים פיזיולוגיים ורמזים ביומכניים. חלק ממערכות מודל אלה כוללות העמסת רקמות ex vivo, מערכות העמסת תאים דו-ממדיות המפעילות מתח דו-צירי או חד-צירי, ומערכות תלת-ממדיות המשתמשות בפיגומים והידרוג’לים 9,10. למערכות דו-ממדיות יש יתרון כאשר הן חוקרות את השפעות הגירוי המכני על גנים ספציפיים לגיד או על המורפולוגיה של התאים בהקשר של גורל התא, בעוד שמערכות תלת-ממדיות יכולות לשכפל בצורה מדויקת יותר אינטראקציות תא-ECM 9,10.
במערכות העמסה דו-ממדית, המתח בין התאים למצע התרבית הוא הומוגני, כלומר ניתן לשלוט באופן מלא בעומס המופעל על שלד התא. בהשוואה להעמסה דו-צירית, העמסה חד-צירית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית, שכן טנוציטים נתונים בעיקר להעמסה חד-צירית מצרורות קולגן in vivo9. נמצא כי במהלך הפעילות היומיומית, הגידים נתונים לעומס מתיחה חד צירי עד 6% מתח11. באופן ספציפי, מחקרים קודמים מצאו כי העמסה בטווח הפיזיולוגי של 4%-5% הוכחה כמקדמת התמיינות טנוגנית על ידי שימור ביטוי סמנים הקשורים לגידים כמו SCX ו- TNMD, כמו גם ייצור קולגן מוגבר 9,10. זנים של יותר מ -10% עשויים להיות רלוונטיים טראומטית אך לא רלוונטיים פיזיולוגית12,13.
כאן מוצג פרוטוקול שלוקח בחשבון את ההשפעה הסינרגטית של גירוי מכני וביולוגי שעשוי להיות חיוני לייצור טנוציטים. תחילה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור להשראת iPSCs לתוך iMSCs באמצעות חשיפה לטווח קצר של גופים עובריים לגורמי גדילה, שאושרה על ידי סמני פני השטח של MSC באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן אנו מפרטים שיטת התמרה לנטיויראלית כדי להנדס iMSCs כך שיהיו בעלי ביטוי יתר יציב של SCX (iMSCSCX+). להבשלת תאים נוספת, iMSCSCX+ נזרעים לתוך לוחות סיליקון מצופים פיברונקטין ועוברים פרוטוקול מתח חד-צירי אופטימלי באמצעות ביוריאקטור CellScale MCFX. הפוטנציאל הטנוגני אושר על ידי התבוננות בהגברת הוויסות של סמני גידים מוקדמים ומאוחרים, כמו גם שקיעת קולגן14. שיטה זו ליצירת iTenocytes היא הוכחת היתכנות שעשויה להציע מקור אלוגני ללא הגבלה מהמדף ליישומי טיפול בתאי גידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, iTenocytes נוצרים באמצעות שלושה שלבים עיקריים: (1) אינדוקציה של iPSCs ל- iMSCs, (2) ביטוי יתר של SCX באמצעות וקטור לנטיויראלי, ו- (3) הבשלה של תאים באמצעות מתח חד צירי דו-ממדי.
הפרוטוקול שהוצג להבחנה בין iPSCs ל- iMSCs תואר בעבר על ידי קבוצה2 שלנו. מאז פרסום זה, פותחו פרוטו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך חלקית על ידי NIH/NIAMS K01AR071512 ו- CIRM DISC0-14350 לדמיטרי שיין. שני פלסמידים באריזות לנטיוירוס היו מתנה ממעבדת סיימון נוט (המחלקה למדעים ביו-רפואיים, המרכז הרפואי סידרס-סיני).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
- Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
- Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
- Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
- Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
- Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
- Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
- Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
- Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
- Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
- Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
- Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
- Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
- Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
- Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
- Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
- McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
- Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
- Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
- Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
- Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
- Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).
