यह लेख एक 2 डी बायोरिएक्टर के माध्यम से एक लेंटिवायरल वेक्टर और यूनिक्सियल स्ट्रेचिंग का उपयोग करके स्क्लेरैक्सिस के संयुक्त ओवरएक्सप्रेशन के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं को उत्पन्न करके iTenocytes का उत्पादन करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
कण्डरा और लिगामेंट की मरम्मत में आज की चुनौतियों में कण्डरा पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए सेल-आधारित चिकित्सा के लिए एक उपयुक्त और प्रभावी उम्मीदवार की पहचान की आवश्यकता है। मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) को कण्डरा की मरम्मत के लिए एक संभावित ऊतक इंजीनियरिंग रणनीति के रूप में खोजा गया है। जबकि वे बहुक्रियाशील हैं और विवो में पुनर्योजी क्षमता रखते हैं, वे अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता में सीमित हैं और फेनोटाइपिक विषमता प्रदर्शित करते हैं। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) अपनी उच्च आत्म-नवीकरण क्षमता और अद्वितीय विकासात्मक प्लास्टिसिटी के कारण इन सीमाओं को दरकिनार कर सकते हैं। टेनोसाइट विकास में, स्क्लेरैक्सिस (एससीएक्स) कण्डरा भेदभाव का एक महत्वपूर्ण प्रत्यक्ष आणविक नियामक है। इसके अतिरिक्त, मेकेनोरेग्यूलेशन को भ्रूण कण्डरा विकास और उपचार का मार्गदर्शन करने वाला एक केंद्रीय तत्व दिखाया गया है। जैसे, हमने जैविक और यांत्रिक उत्तेजना के सहक्रियात्मक प्रभाव को समाहित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो टेनोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है। IPSC mesenchymal स्ट्रोमल कोशिकाओं बनने के लिए प्रेरित किया गया (iMSCs) और प्रवाह cytometry के माध्यम से क्लासिक mesenchymal स्ट्रोमल सेल मार्करों के साथ विशेषता थी. इसके बाद, एक लेंटिवायरल वेक्टर का उपयोग करके, iMSCs को SCX (iMSCSCX+) को स्थिर रूप से ओवरएक्सप्रेस करने के लिए ट्रांसड्यू किया गया था।इन iMSCSCX+ कोशिकाओं को 2D बायोरिएक्टर का उपयोग करके uniaxial तन्यता लोडिंग के माध्यम से iTenocytes में और परिपक्व किया जा सकता है। परिणामी कोशिकाओं को प्रारंभिक और देर से कण्डरा मार्करों के अपग्रेडेशन के साथ-साथ कोलेजन जमाव को देखकर विशेषता थी। iTenocytes उत्पन्न करने की इस विधि कण्डरा सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक संभावित असीमित बंद the-shelf allogeneic सेल स्रोत विकसित करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
कण्डरा और लिगामेंट की मरम्मत में समकालीन मुद्दों से निपटने के लिए, सेल-आधारित उपचारों के लिए उपयुक्त एक प्रासंगिक सेल उम्मीदवार की आवश्यकता होती है। कण्डरा की मरम्मत के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में जांच के एक एवेन्यू में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (बीएम-एमएससी) और वसा ऊतक-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं (एएससी) की खोज संभावित रणनीतियों के रूप में शामिल है। इन कोशिकाओं में विवो में बहुक्रियाशील क्षमता, महान प्रचुरता और पुनर्योजी क्षमता होती है। इसके अतिरिक्त, उन्होंने पशु मॉडल1 में बढ़ी हुई उपचार क्षमता और बेहतर कार्यात्मक परिणाम दिखाए हैं। बहरहाल, ये कोशिकाएं प्रतिबंधित आत्म-नवीकरण क्षमताओं, फेनोटाइपिक विविधता, और विशेष रूप से, कण्डरा गठन के लिए सीमित क्षमता प्रदर्शित करती हैं। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी अपनी उल्लेखनीय आत्म-नवीकरण क्षमता और बेजोड़ विकासात्मक अनुकूलन क्षमता के कारण इन बाधाओं का समाधान प्रदान करती है। हमारे शोध टीम और दूसरों को मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल जैसी संस्थाओं में IPSC के सफल भेदभाव हासिल की है (iMSCs)2,3. जैसे, iMSCs में कण्डरा सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक एलोजेनिक स्रोत होने की क्षमता है।
स्क्लेरैक्सिस (एससीएक्स) कण्डरा विकास के लिए आवश्यक एक प्रतिलेखन कारक है और इसे विभेदित टेनोसाइट्स के लिए सबसे पहला पता लगाने योग्य मार्कर माना जाता है। इसके अतिरिक्त, SCX डाउनस्ट्रीम कण्डरा भेदभाव मार्करों को सक्रिय करता है, जिसमें टाइप 1a1 चेन कोलेजन 1 (COL1a1), मोहॉक (MKX), और टेनोमोडुलिन (TNMD) शामिल हैं, अन्य 4,5,6 शामिल हैं। कण्डरा परिपक्वता के दौरान व्यक्त अन्य जीनों में ट्यूबिलिन पोलीमराइजेशन-प्रमोटिंग प्रोटीन परिवार के सदस्य 3 (टीपीपीपी 3) और प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर अल्फा (पीडीजीएफआरए)7शामिल हैं। जबकि ये जीन कण्डरा विकास और परिपक्वता के लिए आवश्यक हैं, वे दुर्भाग्य से कण्डरा ऊतक के लिए अद्वितीय नहीं हैं और हड्डी या उपास्थि 5,7 जैसे अन्य मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों में व्यक्त किए जाते हैं।
कण्डरा विकास के दौरान मार्करों की अभिव्यक्ति के अलावा, यंत्र भ्रूण कण्डरा विकास औरउपचार 4,5,6 के लिए एक आवश्यक तत्व है. टेंडन मेकेनोरेस्पॉन्सिव हैं, और उनके विकास पैटर्न उनके पर्यावरण के जवाब में बदलते हैं। आणविक स्तर पर, बायोमेकेनिकल संकेत टेनोसाइट्स8 के विकास, परिपक्वता, रखरखाव और उपचार प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। शारीरिक भार और बायोमैकेनिकल संकेतों को मॉडल करने के लिए विभिन्न बायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग किया गया है। इनमें से कुछ मॉडल प्रणालियों में पूर्व विवो ऊतक लोडिंग, द्वि-अक्षीय या एकअक्षीय तनाव को लागू करने वाले 2 डी सेल लोडिंग सिस्टम, और मचान और हाइड्रोगेल 9,10 का उपयोग करके 3 डी सिस्टम शामिल हैं। 2 डी सिस्टम फायदेमंद होते हैं जब या तो कण्डरा-विशिष्ट जीन या सेल भाग्य के संदर्भ में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान पर यांत्रिक उत्तेजना के प्रभावों का अध्ययन करते हैं, जबकि 3 डी सिस्टम सेल-ईसीएम इंटरैक्शन 9,10 को अधिक सटीक रूप से दोहरा सकते हैं।
2 डी लोडिंग सिस्टम में, कोशिकाओं और संस्कृति सब्सट्रेट के बीच तनाव सजातीय है, जिसका अर्थ है कि कोशिकाओं के साइटोस्केलेटन पर लागू भार को पूरी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। द्वि-अक्षीय लोडिंग की तुलना में, यूनिक्सियल लोडिंग अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि टेनोसाइट्स मुख्य रूप से विवो9 में कोलेजन बंडलों से यूनिक्सियल लोडिंग के अधीन हैं। यह पाया जाता है कि दैनिक गतिविधियों के दौरान, tendons 6% तनाव11 अप करने के लिए uniaxial तन्यता लोड हो रहा है के अधीन कर रहे हैं. विशेष रूप से, पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि 4% -5% की शारीरिक सीमाओं के भीतर लोड हो रहा है एससीएक्स और टीएनएमडी जैसे कण्डरा से संबंधित मार्कर अभिव्यक्ति को संरक्षित करके टेनोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, साथ ही कोलेजन उत्पादन 9,10 में वृद्धि हुई है। 10% से अधिक के उपभेदों दर्दनाक प्रासंगिक लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक नहीं12,13 हो सकता है.
यहां, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो यांत्रिक और जैविक उत्तेजना के सहक्रियात्मक प्रभाव को ध्यान में रखता है जो टेनोसाइट्स की पीढ़ी के लिए आवश्यक हो सकता है। हम पहले विकास कारकों के लिए भ्रूण निकायों के अल्पकालिक जोखिम के माध्यम से iMSCs में IPSC प्रेरित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन, प्रवाह cytometry का उपयोग MSC सतह मार्करों द्वारा की पुष्टि. फिर हम इंजीनियर iMSCs को SCX (iMSCSCX+) की स्थिर ओवरएक्सप्रेशन के लिए एक लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन विधि का विस्तार करते हैं। आगे सेल परिपक्वता के लिए, iMSCSCX + फाइब्रोनेक्टिन-लेपित सिलिकॉन प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और CellScale MCFX बायोरिएक्टर का उपयोग कर एक अनुकूलित uniaxial तनाव प्रोटोकॉल से गुजरना. टेनोजेनिक क्षमता जल्दी और देर से कण्डरा मार्करों, साथ ही कोलेजन बयान14 के upregulation अवलोकन द्वारा पुष्टि की गई थी. iTenocytes उत्पन्न करने की यह विधि एक प्रूफ-ऑफ-अवधारणा है जो कण्डरा सेल थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए असीमित ऑफ-द-शेल्फ, एलोजेनिक स्रोत प्रदान कर सकती है।
इस प्रोटोकॉल में, iTenocytes तीन मुख्य चरणों के माध्यम से उत्पन्न होते हैं: (1) iMSCs के लिए IPSC की प्रेरण, (2) एक lentiviral वेक्टर का उपयोग SCX की overexpression, और (3) 2D uniaxial तनाव के माध्यम से कोशिकाओं की परिपक्वता.
iMSCs में IPSC अलग करन…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को आंशिक रूप से NIH/NIAMS K01AR071512 और CIRM DISC0-14350 द्वारा दिमित्री शीन को समर्थित किया गया था। दो लेंटवायरस पैकेजिंग प्लास्मिड साइमन नॉट प्रयोगशाला (बायोमेडिकल साइंसेज विभाग, देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर) से एक उपहार थे।
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |