Generation of induced pluripotent stem cell-derived iTenocytes via combined scleraxis overexpression and 2D Uniaxial tension(공막 과발현 및 2D 단축 장력 결합을 통한 유도만능줄기세포 유래 iTenocytes 생성)
Summary
이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.
Abstract
힘줄과 인대 복구에 대한 오늘날의 과제는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 세포 기반 치료에 적합하고 효과적인 후보를 식별해야 합니다. 중간엽 기질 세포(MSC)는 힘줄 복구를 위한 잠재적인 조직 공학 전략으로 연구되어 왔습니다. 그들은 다능하고 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있지만 자체 재생 능력이 제한되어 있으며 표현형 이질성을 나타냅니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 높은 자가 재생 능력과 탁월한 발달 가소성으로 인해 이러한 한계를 우회할 수 있습니다. 건세포 발달에서 공막(Scx)은 힘줄 분화의 중요한 직접 분자 조절자입니다. 또한 기계 조절은 배아 힘줄의 발달과 치유를 이끄는 핵심 요소인 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 힘줄 생성에 필수적일 수 있는 생물학적 및 기계적 자극의 시너지 효과를 캡슐화하는 프로토콜을 개발했습니다. iPSC는 중간엽 기질 세포(iMSC)가 되도록 유도되었으며 유세포 분석을 통해 고전적인 중간엽 기질 세포 마커로 특성화되었습니다. 다음으로, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 iMSC를 안정적으로 과발현하도록 형질주입했습니다(iMSCSCX+). 이러한 iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터를 사용하여 단축 인장 하중을 통해 iTenocyte로 더 성숙할 수 있습니다. 결과 세포는 초기 및 후기 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰하는 것이 특징이었습니다. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 잠재적으로 무제한의 기성품 동종 세포 소스를 개발하는 연구원을 지원하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
힘줄과 인대 복구의 현대 문제를 해결하기 위해서는 세포 기반 치료에 적합한 적절한 세포 후보가 필요합니다. 힘줄 복구를 위한 조직 공학의 한 가지 연구 방법은 골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC) 및 지방 조직 유래 기질 세포(ASC)를 잠재적 전략으로 탐색하는 것입니다. 이 세포는 다능 능력, 매우 풍부하며 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 향상된 치유 능력과 향상된 기능적 결과를 보여주었습니다1. 그럼에도 불구하고 이러한 세포는 제한된 자가 재생 능력, 표현형 다양성, 특히 힘줄 형성 능력이 제한되어 있습니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기술은 뛰어난 자가 재생 능력과 타의 추종을 불허하는 발달 적응성으로 인해 이러한 제약에 대한 솔루션을 제공합니다. 우리 연구팀과 다른 연구팀은 iPSC를 중간엽 기질 세포 유사 개체(iMSC)로 성공적으로 분화시켰습니다2,3. 따라서 iMSC는 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 동종 공급원이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
공막(SCX)은 힘줄 발달에 필수적인 전사 인자이며 분화된 건세포에 대해 가장 먼저 검출할 수 있는 마커로 간주됩니다. 또한 SCX는 유형 1a1 사슬 콜라겐 1(COL1a1), 모호크(MKX) 및 테노모듈린(TNMD)을 포함한 다운스트림 힘줄 분화 마커를 활성화합니다 4,5,6. 힘줄 성숙 중에 발현되는 다른 유전자로는 튜불린 중합 촉진 단백질 패밀리 멤버 3(TPPP3) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa)7가 있습니다. 이러한 유전자는 힘줄의 발달과 성숙에 필수적이지만, 불행히도 힘줄 조직에만 국한된 것은 아니며 뼈나 연골과 같은 다른 근골격계 조직에서 발현됩니다 5,7.
힘줄 발달 중 마커의 발현 외에도 기계 자극은 배아 힘줄 발달 및 치유에 필수적인 요소입니다 4,5,6. 힘줄은 기계적으로 반응하며 성장 패턴은 환경에 따라 변화합니다. 분자 수준에서, 생체역학적 단서는 건세포의 발달, 성숙, 유지 및 치유 반응에 영향을 미친다8. 다양한 바이오리액터 시스템이 생리학적 부하와 생체역학적 단서를 모델링하는 데 활용되었습니다. 이러한 모델 시스템 중 일부에는 생체 외 조직 로딩, 이축 또는 단축 장력을 적용하는 2D 세포 로딩 시스템, 스캐폴드 및 하이드로겔을 사용하는 3D 시스템이 포함됩니다 9,10. 2D 시스템은 힘줄 특이적 유전자 또는 세포 운명의 맥락에서 세포의 형태에 대한 기계적 자극의 효과를 연구할 때 유리한 반면, 3D 시스템은 세포-ECM 상호 작용을 보다 정확하게 복제할 수 있습니다 9,10.
2D 로딩 시스템에서는 세포와 배양 기질 사이의 변형률이 균일하며, 이는 세포의 세포골격에 가해지는 하중을 완전히 제어할 수 있음을 의미합니다. 이축 로딩(bi-axial loading)과 비교하여, 일축 로딩(uniaxial loading)은 생리학적으로 더 관련성이 높은데, 이는 텐노사이트(tenocyte)가 생체 내 콜라겐 다발(collagen bundle)로부터 일축 로딩(uniaxial loading)을 주로 받기 때문이다 9. 일상 활동 중에 힘줄은 최대 6%의 변형률(11)까지 단축 인장 하중을 받는 것으로 나타났다. 특히, 이전 연구에서는 4%-5%의 생리학적 범위 내에서 로딩이 SCX 및 TNMD와 같은 힘줄 관련 마커 발현을 보존하고 콜라겐 생산을 증가시켜 테노겐 분화를 촉진하는 것으로 나타났습니다 9,10. 10% 이상의 균주는 외상적으로는 관련이 있지만 생리적으로는 관련이 없을 수 있다12,13.
여기에서는 건세포 생성에 필수적일 수 있는 기계적 및 생물학적 자극의 시너지 효과를 고려한 프로토콜이 제시됩니다. 먼저 유세포 분석을 사용하여 MSC 표면 마커로 확인된 배아체를 성장 인자에 단기간 노출 시켜 iPSC를 iMSC로 유도하는 재현 가능한 방법을 설명합니다. 그런 다음 SCX(iMSCSCX+)의 안정적인 과발현을 갖도록 iMSC를 엔지니어링하는 렌티바이러스 형질도입 방법을 자세히 설명합니다. 추가 세포 성숙을 위해 iMSCSCX+ 는 피브로넥틴 코팅 실리콘 플레이트에 파종되고 CellScale MCFX 바이오리액터를 사용하여 최적화된 단축 장력 프로토콜을 거칩니다. tenogenic 잠재력은 이른 힘줄 마커와 늦은 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰함으로써 확인되었다14. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 무제한 기성품 동종 소스를 제공할 수 있는 개념 증명입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 iTenocyte는 (1) iMSC에 대한 iPSC의 유도, (2) 렌티바이러스 벡터를 사용한 SCX의 과발현, (3) 2D 단축 장력을 통한 세포 성숙의 세 가지 주요 단계를 통해 생성됩니다.
iPSC를 iMSC로 구별하기 위해 제시된 프로토콜은 이전에 그룹2에서 설명했습니다. 이 발표 이후, 임상시험에서 iMSC를 사용하기 위한 확립된 프로토콜(21,22,23)<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH/NIAMS K01AR071512 및 CIRM DISC0-14350에서 Dmitriy Sheyn에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 두 개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 Simon Knott 실험실(Cedars-Sinai Medical Center, Department of Biomedical Sciences)에서 기증한 것입니다.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
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