Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi
Summary
Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis’in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC’den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.
Abstract
Günümüzün tendon ve bağ onarımındaki zorlukları, tendon rejenerasyonunu desteklemek için hücre bazlı tedavi için uygun ve etkili bir adayın belirlenmesini gerektirmektedir. Mezenkimal stromal hücreler (MSC’ler), tendon onarımı için potansiyel bir doku mühendisliği stratejisi olarak araştırılmıştır. Multipotent olmalarına ve in vivo rejeneratif potansiyele sahip olmalarına rağmen, kendi kendini yenileme kapasiteleri sınırlıdır ve fenotipik heterojenlik sergilerler. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler), yüksek kendini yenileme kapasiteleri ve benzersiz gelişimsel plastisiteleri nedeniyle bu sınırlamaları aşabilir. Tenosit gelişiminde, Skleraksi (Scx), tendon farklılaşmasının çok önemli bir doğrudan moleküler düzenleyicisidir. Ek olarak, mekanoregülasyonun embriyonik tendon gelişimini ve iyileşmesini yönlendiren merkezi bir unsur olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, tenosit üretmek için gerekli olabilecek biyolojik ve mekanik stimülasyonun sinerjik etkisini kapsüllemek için bir protokol geliştirdik. iPSC’ler mezenkimal stromal hücreler (iMSC’ler) haline geldi ve akış sitometrisi yoluyla klasik mezenkimal stromal hücre belirteçleri ile karakterize edildi. Daha sonra, bir lentiviral vektör kullanılarak, iMSC’ler SCX’i (iMSCSCX+) stabil bir şekilde aşırı eksprese etmek için dönüştürüldü.Bu iMSCSCX+ hücreleri, bir 2D biyoreaktör kullanılarak tek eksenli çekme yüklemesi yoluyla iTenositlere daha da olgunlaştırılabilir. Elde edilen hücreler, erken ve geç tendon belirteçlerinin yukarı regülasyonunun yanı sıra kollajen birikiminin gözlemlenmesiyle karakterize edildi. Bu iTenosit üretme yöntemi, araştırmacılara tendon hücre tedavisi uygulamaları için potansiyel olarak sınırsız bir kullanıma hazır allojenik hücre kaynağı geliştirmede yardımcı olmak için kullanılabilir.
Introduction
Tendon ve bağ onarımındaki çağdaş sorunların üstesinden gelmek için, hücre bazlı tedavilere uygun uygun bir hücre adayına ihtiyaç vardır. Tendon onarımı için doku mühendisliğinde bir araştırma yolu, potansiyel stratejiler olarak kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin (BM-MSC’ler) ve adipoz doku kaynaklı stromal hücrelerin (ASC’ler) araştırılmasını içerir. Bu hücreler multipotent yeteneğe, büyük bolluğa ve in vivo rejeneratif potansiyele sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde gelişmiş iyileşme kapasitesi ve gelişmiş fonksiyonel sonuçlar göstermişlerdir1. Bununla birlikte, bu hücreler sınırlı kendini yenileme yetenekleri, fenotipik çeşitlilik ve özellikle tendon oluşumu için sınırlı kapasite sergilerler. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi, olağanüstü kendini yenileme kapasitesi ve eşsiz gelişimsel uyarlanabilirliği nedeniyle bu kısıtlamalara bir çözüm sunar. Araştırma ekibimiz ve diğerleri, iPSC’lerin mezenkimal stromal hücre benzeri varlıklara (iMSC’ler) başarılı bir şekilde farklılaşmasını sağlamıştır2,3. Bu nedenle, iMSC’ler tendon hücre tedavisi uygulamaları için allojenik bir kaynak olma potansiyeline sahiptir.
Skleraksi (SCX), tendon gelişimi için gerekli olan bir transkripsiyon faktörüdür ve farklılaşmış tenositler için en erken saptanabilir belirteç olarak kabul edilir. Ek olarak, SCX, diğerlerinin yanı sıra tip 1a1 zincir kollajen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) ve tenomodulin (TNMD) dahil olmak üzere aşağı akış tendon farklılaşma belirteçlerini aktive eder 4,5,6. Tendon olgunlaşması sırasında eksprese edilen diğer genler arasında tübülin polimerizasyonunu teşvik eden protein ailesi üyesi 3 (TPPP3) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa)7 bulunur. Bu genler tendon gelişimi ve olgunlaşması için gerekli olmakla birlikte, ne yazık ki tendon dokusuna özgü değildir ve kemik veya kıkırdak gibi diğer kas-iskelet dokularında eksprese edilir 5,7.
Tendon gelişimi sırasında belirteçlerin ekspresyonuna ek olarak, mekanostimülasyon embriyonik tendon gelişimi ve iyileşmesi için önemli bir unsurdur 4,5,6. Tendonlar mekano-duyarlıdır ve büyüme modelleri çevrelerine tepki olarak değişir. Moleküler düzeyde, biyomekanik ipuçları tenositlerin gelişimini, olgunlaşmasını, bakımını ve iyileşme tepkilerini etkiler8. Fizyolojik yükleri ve biyomekanik ipuçlarını modellemek için çeşitli biyoreaktör sistemleri kullanılmıştır. Bu model sistemlerden bazıları ex vivo doku yüklemesi, çift eksenli veya tek eksenli gerilim uygulayan 2D hücre yükleme sistemleri ve iskele ve hidrojel kullanan 3D sistemleriiçerir 9,10. 2D sistemler, mekanik stimülasyonun tendona özgü genler veya hücre kaderi bağlamında hücrelerin morfolojisi üzerindeki etkilerini incelerken avantajlıdır, 3D sistemler ise hücre-ECM etkileşimlerini daha doğru bir şekilde kopyalayabilir 9,10.
2D yükleme sistemlerinde, hücreler ve kültür substratı arasındaki gerilme homojendir, yani hücrelerin hücre iskeletine uygulanan yük tamamen kontrol edilebilir. Çift eksenli yükleme ile karşılaştırıldığında, tenositler ağırlıklı olarak in vivo9 kollajen demetlerinden tek eksenli yüklemeye maruz kaldığından, tek eksenli yükleme fizyolojik olarak daha önemlidir. Günlük aktiviteler sırasında tendonların %6’ya kadar tek eksenli gerilme yüküne maruz kaldığı bulunmuştur11. Spesifik olarak, önceki çalışmalar, %4-5 fizyolojik aralıklarında yüklemenin, SCX ve TNMD gibi tendonla ilgili belirteç ekspresyonunu koruyarak ve ayrıca artan kollajen üretimini koruyarak tenojenik farklılaşmayı teşvik ettiği gösterilmiştir 9,10. % 10’dan fazla suşlar travmatik olarak ilişkili olabilir, ancak fizyolojik olarak anlamlı olmayabilir12,13.
Burada, tenosit üretimi için gerekli olabilecek mekanik ve biyolojik stimülasyonun sinerjik etkisini hesaba katan bir protokol sunulmaktadır. İlk olarak, embriyoid cisimlerin büyüme faktörlerine kısa süreli maruz kalması yoluyla iPSC’leri iMSC’lere indüklemek için tekrarlanabilir bir yöntem tanımladık ve akış sitometrisi kullanılarak MSC yüzey belirteçleri ile doğrulanmıştı. Daha sonra, iMSC’leri SCX’in (iMSCSCX+) kararlı aşırı ekspresyonuna sahip olacak şekilde tasarlamak için bir lentiviral transdüksiyon yöntemini detaylandırıyoruz. Daha fazla hücre olgunlaşması için, iMSCSCX+ , fibronektin kaplı silikon plakalara ekilir ve CellScale MCFX biyoreaktörü kullanılarak optimize edilmiş tek eksenli gerilim protokolüne tabi tutulur. Tenterojenik potansiyel, erken ve geç tendon belirteçlerinin yukarı regülasyonunun yanı sıra kollajen birikimi14 gözlemlenerek doğrulandı. Bu iTenosit üretme yöntemi, tendon hücre tedavisi uygulamaları için sınırsız kullanıma hazır, allojenik bir kaynak sunabilen bir kavram kanıtıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, iTenositler üç ana adımla üretilir: (1) iPSC’lerin iMSC’lere indüksiyonu, (2) bir lentiviral vektör kullanılarak SCX’in aşırı ekspresyonu ve (3) hücrelerin 2D tek eksenli gerilim yoluyla olgunlaşması.
iPSC’leri iMSC’lere ayırmak için sunulan protokol daha öncegrubumuz 2 tarafından tanımlanmıştır. Bu yayından bu yana, iMSC’lerin klinik araştırmalarda 21,22,23 kull…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen NIH/NIAMS K01AR071512 ve CIRM DISC0-14350 tarafından Dmitriy Sheyn’e desteklenmiştir. İki lentivirüs ambalaj plazmidi, Simon Knott laboratuvarından (Biyomedikal Bilimler Bölümü, Cedars-Sinai Tıp Merkezi) bir hediyeydi.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
| Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
| Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
| Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
| Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
| Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
| Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
| MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
| Silicone plates | CellScale | N/A | |
| Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
| Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
| Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
References
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
- Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
- Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
- Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155 (2018).
- Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
- Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
- Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
- Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
- Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748 (2022).
- Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
- Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
- Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
- Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
- Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
- Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
- Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
- McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11 (2019).
- Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
- Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
- Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
- Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977 (2012).
- Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307 (2020).
