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Biology

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Abstract

Le fibre muscolari scheletriche ottenute dalla dissociazione enzimatica dei muscoli del topo sono un modello utile per esperimenti fisiologici. Tuttavia, la maggior parte degli articoli si occupa delle fibre corte del flessore breve delle dita (FDB), il che limita la portata dei risultati relativi ai tipi di fibre, limita la quantità di materiale biologico disponibile e impedisce una chiara connessione tra i fenomeni fisiologici cellulari e le precedenti conoscenze biochimiche e dinamiche ottenute in altri muscoli.

Questo articolo descrive come ottenere fibre intatte da sei muscoli con diversi profili e lunghezze di tipo di fibra. Utilizzando topi adulti C57BL/6, mostriamo il protocollo di dissezione muscolare e isolamento delle fibre e dimostriamo l'idoneità delle fibre per studi transitori di Ca2+ e la loro caratterizzazione morfometrica. Viene anche presentata la composizione del tipo di fibra dei muscoli. Quando sono stati dissociati, tutti i muscoli sono diventati intatti, fibre vive che si contraggono rapidamente per più di 24 ore. FDB ha dato fibre corte (<1 mm), peroneo dita quarti (PDQA) e peroneo lungo (PL) intermedio (1-3 mm), mentre estensore lungo delle dita (EDL), estensore lungo dell'alluce (EHL) e muscolo soleo hanno rilasciato fibre lunghe (3-6 mm).

Quando sono stati registrati con il colorante veloce Mag-Fluo-4, i transienti di Ca2+ delle fibre PDQA, PL ed EHL hanno mostrato una cinetica veloce e stretta che ricorda la morfologia di tipo II (MT-II), nota per corrispondere alle fibre di tipo IIX e IIB. Ciò è coerente con il fatto che questi muscoli hanno oltre il 90% di fibre di tipo II rispetto a FDB (~80%) e soleo (~65%). Andando oltre l'FDB, dimostriamo per la prima volta la dissociazione di diversi muscoli, che rendono le fibre che coprono una gamma di lunghezze comprese tra 1 e 6 mm. Queste fibre sono vitali e danno transienti veloci di Ca2+ , indicando che l'MT-II può essere generalizzato alle fibre veloci IIX e IIB, indipendentemente dalla loro fonte muscolare. Questi risultati aumentano la disponibilità di modelli per gli studi sul muscolo scheletrico maturo.

Introduction

Il muscolo scheletrico maturo dei mammiferi è un tessuto multifunzionale. Regola pesantemente il metabolismo, è la principale fonte di produzione di calore e le sue proprietà dinamiche gli conferiscono un ruolo chiave nella respirazione, nel movimento dei segmenti corporei o nello spostamento da un punto all'altro 1,2,3. Il muscolo scheletrico è anche rilevante per la fisiopatologia di molte malattie, comprese le condizioni ereditarie e croniche, come miopatie, distrofie o sarcopenia, nonché molte condizioni croniche non muscolari, come le malattie cardiometaboliche 3,4,5,6,7,8.

Lo studio ex vivo delle proprietà strutturali e funzionali del muscolo scheletrico maturo in un contesto di salute e malattia è stato possibile principalmente attraverso due modelli sperimentali: il muscolo intero e le fibre isolate. Nel 20° secolo, i ricercatori hanno sfruttato le proprietà dell'intero muscolo estensore lungo delle dita (EDL), del soleo, del tibiale anteriore e del gastrocnemio di diverse piccole specie come modelli cardine per conoscere le unità motorie, i tipi di fibre e le proprietà dinamiche come la forza e la cinetica di contrazione e rilassamento 9,10,11,12,13,14,15,16. Tuttavia, l'avvento di studi di biologia cellulare più raffinati ha spostato l'area verso lo studio delle singole fibre muscolari. Il lavoro pionieristico ha quindi permesso l'isolamento delle fibre flessori brevi delle dita intatte (FDB) dei ratti mediante dissociazione enzimatica per la successiva caratterizzazione 17,18,19. Sebbene le fibre FDB possano essere ottenute anche mediante dissezione manuale20, la facilità e l'elevata produttività della dissociazione enzimatica dei muscoli murini, oltre alla loro idoneità per una varietà di approcci sperimentali, hanno reso quest'ultimo modello ampiamente utilizzato negli ultimi due decenni.

Le fibre corte FDB sono adatte per studi elettrofisiologici e altri studi biofisici, analisi biochimiche, metaboliche e farmacologiche, esperimenti di microscopia elettronica e fluorescenza, trasfezione per approcci di biologia cellulare o come fonte di cellule staminali negli studi di miogenesi 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Tuttavia, l'utilizzo di sole fibre FDB negli esperimenti muscolari restringe l'ambito della ricerca che si occupa dei tipi di fibre e limita la quantità di materiale biologico disponibile per alcune tecniche metodologiche o per ottenere maggiori informazioni da un animale. Queste limitazioni ostacolano una chiara correlazione dei fenomeni fisiologici cellulari con precedenti studi biochimici e dinamici eseguiti in diversi muscoli interi, intatti (ad esempio, EDL, soleo, peronei).

Superando queste limitazioni, alcuni gruppi sono riusciti a dissociare i muscoli EDL e soleo più lunghi 24,33,34,35,36,37,38,39,40, aprendo la porta ad un'ulteriore estensione del metodo ad altri muscoli rilevanti. Tuttavia, l'uso di EDL e fibre soleo è ancora scarso, probabilmente a causa della mancanza di dettagli metodologici per ottenerle come fibre intatte. Qui descriviamo in dettaglio come isolare fibre di diverse lunghezze e tipi da sei muscoli: tre di essi già descritti (FDB, EDL e soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce [EHL], peroneo lungo [PL] e peroneo delle dita quarti [PDQA]). I risultati del presente lavoro confermano che il modello di fibre enzimaticamente dissociate è adatto per un'ampia gamma di studi e future correlazioni con dati precedentemente pubblicati, aumentando così la disponibilità di modelli per studi sul muscolo scheletrico maturo.

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per l'Etica negli Esperimenti con gli animali dell'Università di Antioquia (UdeA) (verbali 104 del 21 giugno 2016 e 005 del 15 aprile 2021), secondo la Legge 84 del 1989 e la Risoluzione 8430 del 1993 emesse dal Governo Colombiano e sono state eseguite e riportate in conformità con la Ricerca Animale: Linee guida per la segnalazione degli esperimenti in vivo (ARRIVE)41. Tutti i risultati qui presentati provengono da topi maschi sani, di 7-13 settimane, di 20-26 g, C57BL/6. La figura 1 mostra il disegno generale di questo studio e l'ordine delle procedure. Tutti i reagenti, i materiali e i dettagli delle apparecchiature sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Animali

  1. Ospita un massimo di sei topi per gabbia rettangolare in acrilico, trasparente, con lettiera derivata dal legno, in condizioni di temperatura controllata (21 ± 2 °C) e cicli luce:buio (12:12 h).
  2. Dare agli animali libero accesso al cibo e all'acqua del rubinetto in strutture specifiche per animali prive di agenti patogeni senza alcun arricchimento ambientale.

2. Dissezione

  1. Soluzioni, materiali e reagenti
    1. Preparare e filtrare (0,22 μm) le soluzioni di lavoro con la seguente composizione (tutte le concentrazioni in mM):
      1. Tirodo: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glucosio, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissociazione: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Preparare due camere di dissezione; stereoscopio; forbici operatorie; forbici fini; pinze sottili; e flaconcini di vetro puliti, trasparenti, non conici, larghi 1-1,5 cm, di volume totale di 3-4 mL con tappi. Predisporre un sistema per stimolare elettricamente i muscoli nelle camere di dissezione.
    3. Preparare pipette in vetro Pasteur lucidate a fuoco con puntali di diversa larghezza: 5, 4, 3, 2 e 1 mm.
    4. Impostare il bagnomaria a 37 °C. Pesare aliquote di 3 mg di collagenasi di tipo 2.
  2. Procedimento
    1. Sacrificare il topo utilizzando metodi approvati dal Comitato Etico locale. La lussazione cervicale è consigliata perché è rapida, meno stressante ed evita l'esposizione a farmaci, che possono influenzare il tessuto muscolare (come la CO2 o alcuni anestetici). Iniziare immediatamente la dissezione per ottenere risultati migliori.
    2. Posiziona il mouse su una superficie di schiuma e fissa o fissa con del nastro adesivo gli arti anteriori. Tagliare entrambi gli arti posteriori sopra le ginocchia con le forbici operatorie, trasferire ciascuno di essi in una camera di dissezione separata e aggiungere Tyrode freddo (10-20 °C) per coprire il tessuto.
      NOTA: Ogni arto posteriore darà sei muscoli diversi nel seguente ordine: FDB, soleo, EDL, EHL, PL e PDQA. Riferimenti anatomici dettagliati per sezionare i sei muscoli intatti da tendine a tendine sono forniti nella Figura 2 e altrove42.
    3. Appuntare il primo arto posteriore alla camera di dissezione in una posizione in cui sia visibile la faccia posteriore delle zampe. Rimuovere la pelle sotto ingrandimento; quindi esporre e rimuovere l'FDB (Figura 2). Conservare in un flaconcino di vetro etichettato con 1 mL di soluzione di Tyrode.
      NOTA: Sono necessari un ingrandimento appropriato e un allenamento precedente per evitare tagli indesiderati nel tessuto muscolare.
    4. Esponi, rimuovi e conservi il soleo in un flaconcino separato con 1 ml di Tyrode. Utilizzare forbici sottili per separare prima il gastrocnemio e poi per rimuovere il soleo, come indicato nella Figura 2.
    5. Esporre la faccia anteriore della gamba, rimuovere la pelle e identificare i tendini distali del tibiale anteriore e i muscoli EDL della caviglia. Rimuovere e scartare i tibiali; quindi tagliare i tendini distali dell'EDL (Figura 2). Continuare la dissezione fino a rimuovere l'EDL e metterlo in un flaconcino di vetro separato con 1 mL di Tyrode.
    6. Rimuovere il muscolo EHL, che si trova appena posteriormente e medialmente all'EDL. Iniziare la dissezione identificando e seguendo il tendine fino al 1° dito, come indicato nel pannello corrispondente della Figura 2. Conservare il muscolo in un flaconcino di vetro separato con 1 ml di Tyrode.
    7. Identificare e seguire il tendine più esterno dei peronei per tagliarlo e rimuovere il muscolo PL (Figura 2). Mettere il muscolo in una fiala di vetro separata con 1 ml di Tyrode.
    8. Identificare e seguire il tendine fino alla4a cifra; tagliarlo e rimuovere il muscolo PDQA (Figura 2). Metterlo in un flaconcino di vetro separato con 1 ml di Tyrode.
    9. Ripetere la procedura con il secondo arto posteriore.
    10. Riunire entrambi i muscoli dello stesso tipo in una fiala di vetro etichettata o in una piccola capsula di Petri con la soluzione di Tyrode.
      NOTA: Se si prevede di sezionare più di due paia di muscoli durante una sessione di lavoro, reclutare due ricercatori per la procedura di dissezione.

3. Protocollo di isolamento delle fibre muscolari

  1. Rinnovare la soluzione di Tyrode nelle camere di dissezione per rimuovere i detriti e il pelo di topo. Versare i muscoli FDB in una camera di dissezione, verificarne l'integrità e trasferirli in una nuova fiala di vetro con 1 mL di soluzione di dissociazione. Ripeti questa procedura con i muscoli EHL, PL e PDQA.
    NOTA: Se un muscolo sembra ipercontratto, tagliato o non risponde alla stimolazione elettrica, non continuare con la fase successiva del protocollo. Piuttosto, ottimizzare il protocollo di dissezione verificando la qualità delle soluzioni (pH, contaminazione, osmolarità) e acquisendo maggiori competenze di dissezione (Figura 1C e video supplementare S1).
  2. Eseguire tagli longitudinali o diagonali ai muscoli soleo e EDL, seguendo l'orientamento delle fibre (Figura 2). Per il soleo, seguire il tendine centrale, tagliando ~80% della sua lunghezza. Per l'EDL, basta seguire uno o due tendini e tagliare all'incirca la stessa lunghezza del soleo. Mettere ogni paio di muscoli in fiale di vetro con 1 mL di soluzione di dissociazione.
    NOTA: Questa procedura rende l'EDL e il soleo più piccoli e consente alla collagenasi di entrare meglio nel tessuto. Sono obbligatori un ingrandimento sufficiente (40-50x), oltre a forbici e pinze sottili. Controllare sempre l'integrità del campione mediante ispezione visiva e stimolazione elettrica prima di passare alla fase successiva del protocollo di dissociazione.
  3. Aggiungere 3 mg di collagenasi di tipo 2 (con un'attività di 250-300 U/mg) a ciascun flaconcino contenente 1 mL di soluzione di dissociazione e un paio di muscoli. Standardizzare l'esatta quantità di collagenasi considerando l'attività del lotto enzimatico utilizzato.
  4. Incubare le coppie di muscoli a bagnomaria per 65-90 minuti a 36,8-37 °C, agitando delicatamente.
    NOTA: Essere rigorosi con il controllo della temperatura. Standardizzare la procedura in modo che i muscoli non rimangano in collagenasi per più di 100 minuti per evitare danni.
  5. Controllare i flaconcini sotto l'ingrandimento dello stereoscopio ogni 5 minuti dopo il 65° minuto di incubazione. Quando i muscoli appaiono leggermente increspati, sfilacciati e allentati, agitare delicatamente la fiala e verificare se alcune fibre iniziano a staccarsi rapidamente. In questo caso, lavare i muscoli con Tyrode a temperatura ambiente per inattivare e rimuovere la collagenasi.
    NOTA: Il lavaggio deve essere eseguito con cura, senza toccare i muscoli con le pipette. Iniziare aggiungendo 0,8 mL di Tyrode e poi rimuovere 0,8 mL della soluzione. Ripetere questa procedura 4-5 volte e verificare che la soluzione diventi completamente trasparente.
  6. Separa più fibre dalla maggior parte dei muscoli con una triturazione molto delicata in Tyrode con l'aiuto del set di pipette Pasteur lucidate a fuoco. Iniziare agitando la soluzione intorno al muscolo con la pipetta più larga (punta da 5 mm) e poi tirare delicatamente i muscoli dentro e fuori dalla pipetta 3-4 volte. Quando il muscolo inizia a rilasciare fibre e diventa più sottile, ripetere la procedura con la pipetta successiva (punta da 4 mm).
    NOTA: le fibre renderizzate tramite questa procedura rimangono eccitabili e si contraggono rapidamente per più di 24 ore, come esemplificato utilizzando le fibre PL, EDL, EHL e soleo in Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 e Supplemental Video S5.

4. Procedure sperimentali

NOTA: Le fibre isolate sono state utilizzate per le stime della concentrazione di Ca2+ sarcoplasmatica, le misurazioni morfometriche e gli studi di espressione della catena pesante della miosina (MHC).

  1. Misura del Ca sarcoplasmatico2+ Concentrazione durante una contrazione
    1. Montare un vetrino pulito sulla camera del bagno sperimentale. Rivestire il vetrino con 2-3 μL di laminina e lasciarlo asciugare per 30 secondi prima di versare ~400 μL di sospensione in fibra sul vetrino. Lasciare che le fibre aderiscano alla laminina per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
    2. Montare la camera sperimentale sul tavolino di un microscopio invertito dotato di epifluorescenza (Figura 3A).
    3. Evocare singole contrazioni per verificare la vitalità delle fibre applicando impulsi di corrente rettangolari (0,8-1,2 ms) attraverso i due elettrodi di platino posti lungo entrambi i lati della camera sperimentale. Anche quando è attaccata alla laminina, la contrazione delle fibre è ancora visibile principalmente agli estremi.
    4. Caricare le fibre con 3,5-4,5 μM del colorante rapido Ca2+ Mag-Fluo-4, AM per 4-5 minuti in soluzione di Tyrode. Trascorso questo tempo, lavare delicatamente con Tyrode per rimuovere il colorante extracellulare. Lasciare che il colorante intracellulare sia deesterificato per ~15-20 minuti in condizioni di oscurità. Mantenere sempre la temperatura al di sotto dei 22 °C per evitare la compartimentazione del colorante.
      NOTA: Preparare una scorta di Mag-Fluo-4, AM solo in dimetilsolfossido (DMSO), in modo che la concentrazione finale di DMSO nella soluzione di Tyrode di carico sia inferiore allo 0,5%.
    5. Illuminare la fibra con un diodo a emissione di luce bianca (LED) e un set di filtri con le seguenti lunghezze d'onda per eccitazione/dicroica/emissione: 450-490/510/515 nm (Figura 3A).
      NOTA: Fonti alternative di eccitazione includono lampade a fluorescenza al mercurio e allo xeno. Utilizzare l'intensità e la dimensione più basse possibili del punto di eccitazione per evitare il fotosbiancamento del colorante e danni alla cellula.
    6. Evocare la risposta Ca2+ della fibra (transitori sarcoplasmatici Ca2+ ) applicando impulsi di corrente rettangolari (0,8-1,2 ms) attraverso i due elettrodi di platino posti lungo entrambi i lati della camera sperimentale a 20-22 °C.
    7. Raccogli e salva i segnali luminosi con un obiettivo a lunga distanza 40x a immersione in olio adatto alla fluorescenza e un tubo fotomoltiplicatore (PMT) collegato a un digitalizzatore (Figura 3A e video supplementare S6). Garantire una scala nel software di acquisizione di 0-200 unità arbitrarie (AU) e impostare la fluorescenza a riposo (riposo F) dell'esperimento a 10 UA su quella scala modulando la dimensione del punto di eccitazione e il guadagno del PMT. Una volta che la procedura è standardizzata, mantieni il guadagno invariato da un esperimento all'altro e imposta la scala solo attraverso piccoli aggiustamenti nella dimensione dello spot.
      NOTA: In caso di artefatti da movimento, utilizzare 20-30 μM di N-benzil-p-toluene sulfonamide (BTS) nella soluzione di Tyrode.
    8. Analizzare e calibrare i segnali come segue:
      1. Filtro passa-basso dell'intera traccia a 1 kHz.
      2. Calcolare il riposo F in 1 s della traccia, regolare il riposo F a 0 e misurare l'ampiezza dei transienti sarcoplasmatici Ca2+ (picco F). Presentare l'ampiezza come nell'equazione (1):
        Equation 1(1)
      3. Calcolare la concentrazione di picco di Ca2+ ([Ca2+], μM) utilizzando l'equazione (2)26 e i seguenti parametri: costante di dissociazione in situ (Kd) = 1,65 × 105 μM2, fluorescenza massima (Fmax) di 150,9 UA, fluorescenza minima (Fmin) di 0,14 UA, concentrazione di Mag-Fluo-4 [D]T di 229,1 μM26. Ilpicco F è già stato ottenuto al punto 4.1.8.2.
        Equation 2(2)
      4. Misurare il tempo di salita dal 10% al 90% dell'ampiezza (RT, ms), la durata a metà massimo (HW, ms) e il tempo di decadimento dal 90% al 10% dell'ampiezza (DT, ms). Quindi, stimare la cinetica di decadimento secondo un fit con la funzione biesponenziale (equazione 3):
        Equation 3(3)
      5. Salvare i valori delle costanti di tempo di decadimento τ1 e τ2 (ms) e delle ampiezze A1 e A226.
  2. Misure morfometriche
    1. Montare un vetrino pulito sulla camera del bagno sperimentale. Rivestire il vetrino con 2-3 μL di laminina e lasciarlo asciugare per 30 secondi prima di versare ~400 μL di sospensione in fibra sul vetrino. Lasciare che le fibre aderiscano alla laminina per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
    2. Evocare singole contrazioni per verificare la vitalità delle fibre applicando impulsi di corrente rettangolari (0,8-1,2 ms) attraverso i due elettrodi di platino posti lungo entrambi i lati della camera sperimentale. Anche quando è attaccata alla laminina, la contrazione delle fibre è ancora visibile principalmente agli estremi.
    3. Acquisire immagini delle fibre vive utilizzando obiettivi 10x e 20x e una fotocamera di almeno 5 megapixel montata su un microscopio a fluorescenza invertita. Memorizzate le immagini in formato . Formato TIFF per le analisi offline.
      NOTA: Potrebbe essere necessario un set di ~2-6 immagini per catturare completamente una fibra lunga.
    4. Visualizzare l'immagine di un righello di calibrazione micrometrica del microscopio con lo stesso ingrandimento. Memorizzate le immagini in formato . Formato TIFF per le analisi offline.
    5. Misurare le lunghezze e i diametri delle fibre utilizzando lo strumento di calibrazione del software gratuito per l'analisi delle immagini come segue:
      1. Stabilire una relazione tra i pixel e la distanza nota (μm) nelle immagini con l'aiuto del righello di calibrazione del micrometro del microscopio utilizzando lo strumento Analizza/Imposta scala come mostrato nella Figura supplementare S1.
      2. Misurare una volta le lunghezze da una punta all'altra della fibra e i diametri in 2-6 punti diversi lungo la fibra (1-2 misurazioni per immagine, a seconda della sua lunghezza), come nella Figura supplementare S1.
      3. Riportare il valore della lunghezza (μm o mm) e la media di tutti i diametri (μm) misurati per fibra.
  3. Studi sull'espressione delle catene pesanti della miosina
    NOTA: Per i dettagli sulla determinazione dell'MHC mediante immunofluorescenza43 ed elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)33,44,45,46 nei muscoli interi, vedere il file supplementare 1. Il protocollo per la tipizzazione delle fibre mediante determinazione in immunofluorescenza dell'MHC nella sospensione di fibre isolate da FDB è il seguente:
    1. Rivestire ciascuno dei cinque vetrini puliti con 2-3 μL di laminina e lasciarlo asciugare per 30 secondi prima di versare ~300 μL di sospensione in fibra su ciascun vetrino. Lasciare che le fibre aderiscano alla laminina per 4 ore a temperatura ambiente.
    2. Fissare le preparazioni con acetone raffreddato a congelatore per 30 minuti a temperatura ambiente.
    3. Lavare delicatamente 3 volte con PBS.
    4. Permeabilizzare le membrane cellulari con PBS integrato con Triton X-100 allo 0,7% per 15 minuti a temperatura ambiente.
    5. Lavare delicatamente 3 volte con PBS integrato con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,2% e Triton X-100 allo 0,04%, quindi bloccare con PBS con BSA al 2%, siero di capra al 2% e Triton X-100 allo 0,4% per 30 minuti a temperatura ambiente.
    6. Lavare delicatamente 3 volte con PBS integrato con lo 0,2% di BSA e lo 0,04% di Triton X-100 e incubare con gli anticorpi primari come segue:
      1. Diluire ciascun anticorpo primario anti-MHC in un flaconcino separato in PBS con l'1% di BSA e lo 0,04% di Triton X-100: anti-I (1:1.500), anti-II (1:600), anti-IIA (utilizzare l'intero terreno condizionato dell'ibridoma) e anti-IIB (1:500).
      2. Incubare ogni vetrino con un anticorpo e il vetrino rimanente con PBS come controllo per 12-16 ore a 4 °C.
        NOTA: In questo protocollo, le fibre di tipo IIX sono rimaste non marcate in tutti i campioni.
    7. Lavare delicatamente 3 volte con PBS e incubare tutti i vetrini con l'anticorpo secondario (1:800) accoppiato a una molecola verde fluorescente per 1-2 ore a temperatura ambiente.
    8. Colorare i nuclei con 1 μg/mL di Hoechst per 15 min.
    9. Lavare delicatamente 3 volte con PBS, aggiungere con cura 20-40 μL di mezzo di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti.
      NOTA: Scambi di soluzione delicati e lavaggi assicurano che dozzine di fibre rimangano attaccate al vetrino, rendendo l'esperimento statisticamente valido.
    10. Visualizzare ogni vetrino utilizzando un obiettivo 10x adatto alla fluorescenza e un set di filtri con le seguenti lunghezze d'onda per eccitazione/dicroica/emissione: 450-490/510/515 nm e contare tutte le fibre positive e negative. In alternativa, acquisire immagini a fluorescenza utilizzando le stesse condizioni tecniche e una fotocamera di almeno 5 megapixel montata su un microscopio a fluorescenza invertita e memorizzarle in . Formato TIFF per le analisi offline.
    11. Registrare le fibre positive e negative di ciascun vetrino in un database e calcolare le percentuali di fibre positive I, IIA, IIB e II totali in base al numero totale di fibre presenti nel vetrino corrispondente. Calcola la percentuale di fibre IIX sottraendo la somma di IIA+IIB dalla percentuale di fibre II totali. Stimare la percentuale di fibre ibride I/IIA sottraendo la somma di I+II da un valore del 100%. Infine, sottrai la percentuale di celle ibride dal totale di I e II per avere le fibre pure di tipo I e II.
      NOTA: Negli studi di composizione MHC, i tipi di fibre sono designati da una lettera maiuscola mentre le isoforme sono designate da una lettera minuscola46.
  4. Colorazione con ematossilina ed eosina
    1. Rivestire un vetrino pulito con 2-3 μL di laminina e lasciarlo asciugare per 30 secondi prima di versare ~300 μL di sospensione in fibra sul vetrino. Lasciare che le fibre aderiscano alla laminina per 4 ore a temperatura ambiente.
    2. Fissare il preparato con la soluzione di Carnoy (60% etanolo assoluto, 30% cloroformio, 10% acido acetico) per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Incubare con ematossilina per 90 s.
    4. Lavare delicatamente 3 volte con acqua di rubinetto.
    5. Incubare con l'1% di eosina Y preparata in etanolo al 70% per 30 s.
    6. Lavare delicatamente 3 volte con acqua di rubinetto.
    7. Immergere 3 volte nell'etanolo assoluto.
    8. Incubare nello xilolo per 60 s.
    9. Aggiungere 20-40 μL di mezzo di montaggio e visualizzare con un microscopio convenzionale. Acquisire immagini all'ingrandimento desiderato utilizzando una fotocamera a colori di almeno 5 megapixel.

5. Analisi statistiche e grafici

NOTA: L'unità sperimentale è una fibra muscolare.

  1. Esprimere i risultati come media ± deviazione standard e calcolare gli intervalli di confidenza al 95% (CI95%) per alcune analisi.
  2. Per confrontare la lunghezza, il diametro e la cinetica dei transienti Ca2+ tra i gruppi, eseguire l'analisi della varianza (ANOVA) e test post-hoc con la correzione di Bonferroni.
  3. Valutare la normalità e l'uguaglianza della varianza utilizzando rispettivamente i test di Shapiro-Wilk e Levene.
  4. Si considerino le differenze significative quando p < 0,05.

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Representative Results

Concentrazione sarcoplasmatica di Ca2+ durante una contrazione
Per dimostrare la fattibilità di esperimenti fisiologici nell'insieme delle fibre dissociate e per estendere i nostri precedenti risultati sull'accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) e sui tipi di fibre, i transitori di Ca2+ sono stati acquisiti nelle fibre di tutti i muscoli. In primo luogo, FDB (n = 5) e EDL (n = 7) hanno mostrato una cinetica di Ca2+ nota come morfologia di tipo II (MT-II). Si tratta di segnali veloci e appuntiti, il cui RT dura ~1 ms; la sua fase di decadimento può essere dotata di una funzione biesponenziale con la prima componente (A1) maggiore del 30% dell'intera ampiezza, e il suo picco [Ca2+] è compreso tra 15 e 30 μM33,47 (Figura 3B). I loro risultati sono raggruppati (n = 12) nella prima colonna della Tabella 1, mentre i risultati dei transitori di Ca2+ del soleo (n = 6) sono presentati nella seconda colonna della Tabella 1. I segnali del soleo sono stati classificati come morfologia di tipo I (MT-I, Figura 3B) -più ampia, con un RT superiore a 1,2 ms, un A1 inferiore al 30% e un picco [Ca2+] compreso tra 7 e 13 μM33,47. Queste due colonne sono state considerate come riferimenti per confrontare i transienti Ca2+ dei nuovi muscoli. Poiché tutte le fibre di PDQA (n = 4), PL (n = 6) e EHL (n = 4) condividevano l'MT-II (Figura 3B), i loro dati sono raggruppati (n = 14) nella terza colonna della Tabella 1. Questi segnali hanno mostrato un RT medio di ~1 ms, un A1 di ~45%, un picco [Ca2+] superiore a 15 μM, e si confrontano molto bene con i risultati presentati nella prima colonna ma differiscono chiaramente da quelli mostrati nella seconda colonna, come confermato dall'analisi statistica (Tabella 1). Il segnale più veloce dell'intero campione proveniva da una fibra EHL, con un ΔF/F di 0,66, [Ca2+] di 16,99 μM, RT di 0,85 ms, HW di 2,42 ms e DT di 10,56 ms. τ1 e τ2 erano rispettivamente 1,63 e 7,21 ms, mentre i valori di A1 e A2 erano 56,60% e 43,40%. Il segnale più lento proveniva da una fibra soleosa, con un ΔF/F di 0,41, [Ca2+] di 9,76 μM, RT di 1,56 ms, HW di 9,43 ms e DT di 31,88 ms. τ1 e τ2 erano rispettivamente 2,81 e 96,42 ms, mentre i valori di A1 e A2 erano del 19,55% e dell'80,45%. 

Una batteria di fibre corte, intermedie e lunghe
L'osservazione di chiare differenze tra le fibre in base alla loro fonte muscolare ha permesso una caratterizzazione morfometrica più completa. Gli istogrammi della Figura 4 mostrano notevoli variazioni nelle lunghezze delle fibre in tutti i muscoli. Ciò si evidenzia quando si confronta la fibra più corta di FDB (227,06 μm) con quella più lunga di soleo (5,69 mm). I valori medi di lunghezza sono riassunti nella tabella 2. Sono state riscontrate differenze statistiche significative tra i gruppi (p < 0,01). Questi risultati permettono di classificare le fibre FDB come corte (<1 mm); PDQA e PL come intermedi (da 1 a 3 mm); e EDL, EHL e soleo lunghi (>3 mm) (Figura supplementare S2).

Al contrario, sono state osservate piccole differenze nei diametri medi delle fibre di tutti i muscoli (Tabella 2) e nella distribuzione dei valori (Figura 4). Tuttavia, ci sono state differenze statistiche significative tra i gruppi (p < 0,01). Quando valutati in dettaglio, c'erano differenze tra FDB e tra loro muscolo e tra FDB (FDB 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) e il pool di fibre intermedie e lunghe (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). La cella più sottile dell'intero campione misurava 18,42 μm (FDB) e la più spessa raggiungeva 82,79 μm (PDQA).

Tipi di fibre utilizzate negli esperimenti fisiologici
In primo luogo, i tipi di fibre presenti in ciascun muscolo intero sono stati determinati mediante immunofluorescenza. Fatta eccezione per il soleo, i muscoli hanno mostrato una predominanza di oltre il 76% delle fibre di tipo II (Figura supplementare S3, Tabella 3 e Tabella 4). EHL, PL e PDQA sono muscoli particolarmente veloci, con oltre il 90% di fibre veloci e fino al 58,8% di fibre di tipo IIB, come si trova in PDQA. EHL e PDQA erano virtualmente privi di fibre di tipo I. Le fibre ibride I/IIA erano presenti in tutti i muscoli in basse percentuali. Come previsto, le fibre di tipo I e IIA rappresentavano oltre l'82% delle fibre totali del soleo. Questo muscolo è quasi privo delle fibre IIB più veloci. Secondo il profilo dei tipi di fibre, il soleo è il più lento e il PDQA è il muscolo più veloce dei sei analizzati.

Successivamente, e poiché è più rilevante per gli esperimenti fisiologici a fibra singola, è stata affrontata la questione di quali tipi di fibre appaiono nella sospensione cellulare derivata dall'FDB dissociato. È stato riscontrato che il profilo delle fibre nella sospensione cellulare riflette la composizione delle fibre presenti nelle criosezioni: tre fibre dissociate su quattro erano di tipo II (Figura 5 e Tabella 3).

Infine, la composizione dei muscoli è stata confermata separando le loro isoforme MHC tramite SDS-PAGE. I risultati sono stati coerenti con il modello generale osservato nei saggi di immunofluorescenza. Il soleo è stato arricchito in MHC IIa e I, mentre EDL, EHL e peronei sono stati arricchiti in MHC IIx e IIb ma erano privi di I (Figura supplementare S4).

Figure 1
Figura 1: Disegno dello studio. (A) Attrezzature e soluzioni da mettere a punto prima di iniziare la procedura di dissezione. 1. Stereoscopio numero uno. 2. Dal basso verso l'alto: un set di cinque pipette lucidate a fuoco, strumenti di dissezione e fiale di collagenasi all'interno di un frigorifero portatile (custodia gialla). 3. Custodia del filtro, camera di dissezione, fiale di vetro etichettate con tappo, rack con soluzioni filtrate. 4. Strumenti di dissezione. 5. Stereoscopio con numero di camere di dissezione, due accoppiato ad una telecamera e ad un elettrostimolatore. (B) La procedura di dissezione dell'insieme di sei muscoli degli arti posteriori dei topi, come ulteriormente spiegato nella Figura 2. (C) Dopo la dissezione, la contrazione muscolare e l'integrità devono essere verificate prima di continuare con la fase successiva del protocollo. Il muscolo sinistro nel pannello di sinistra mostra un muscolo PL ondulato, ipercontratto e non reattivo (freccia blu), che non deve essere utilizzato per ottenere fibre dissociate. Invece, il protocollo di dissezione deve essere ottimizzato e riavviato. La controparte PL ben sezionata (muscolo destro nel pannello di sinistra) mostra un aspetto allungato e si contrae visibilmente (Supplemental Video S1). Il pannello a destra mostra due muscoli EDL (freccia blu) e due muscoli FDB all'interno della soluzione di collagenasi con l'aspetto corretto e dritto. (D) Una volta dissociati i muscoli, versare le fibre isolate nella camera sperimentale e verificarne la contrazione e l'integrità. Nel pannello di sinistra, le fibre PL attive (freccia blu) e morte. Nel pannello di destra, le fibre EDL attive (freccia blu) e morte. (E-G) Sono state eseguite tre serie di esperimenti con le fibre isolate: (E) Misurazioni della concentrazione di Ca2+ sarcoplasmatica durante una contrazione (risultati nella Figura 3). (F) Analisi morfometriche (risultati presentati nella figura 4). Questo esempio mostra una fibra PL. (G) Immunofluorescenza per studi sull'espressione delle catene pesanti della miosina (risultati illustrati nella Figura 5). Questo esempio mostra una fibra FDB isolata. Barre graduate = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Riferimenti anatomici e procedura generale per sezionare l'insieme dei sei muscoli degli arti posteriori del topo. Le file, dall'alto verso il basso, presentano i muscoli secondo il miglior ordine di dissezione: FDB, soleo, EDL, EHL, PL e PDQA. Le colonne, da sinistra a destra, presentano le pietre miliari durante la dissezione. La prima colonna mostra i muscoli o i loro tendini distali esposti in modo che la dissezione possa iniziare. Ad esempio, le frecce blu puntano all'FDB e al soleo in situ e ai tendini distali dell'EDL. Le due colonne seguenti illustrano la dissezione stessa e i muscoli esposti dopo che il/i tendine/i distale/i è/sono stato tagliato/i, come etichettato, ad esempio, con la freccia blu nella riga EDL. Si consiglia di rimuovere il ramo dell'FDB diretto alla quinta cifra. La colonna più a destra presenta i muscoli una volta completamente rimossi, con i tendini prossimali orientati verso la parte superiore delle immagini. Le linee blu discontinue (colonna all'estrema destra) illustrano i tagli longitudinali o diagonali che devono essere eseguiti nei muscoli soleo e EDL per garantire che la collagenasi entri nella loro massa. Barre graduate = 5 mm. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce; PDQA = peroneus digiti quarti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Transitori di Ca2+ registrati in fibre ottenute da un insieme di sei muscoli degli arti posteriori del topo. (A) Setup utilizzato per l'acquisizione di transitori Ca2+ in condizioni di illuminazione attenuata. Pannello di sinistra: 1. PMT collegato ad un microscopio a fluorescenza invertita (2). 3. Telecamera accoppiata al microscopio. 4. Elettrostimolatore accoppiato alla camera sperimentale. 5. Il sistema di micromanipolazione può essere utilizzato quando sono pianificati saggi di elettrofisiologia e iniezione per integrare l'acquisizione dei transitori di Ca2+ . Pannello centrale: la camera sperimentale (inserto) con le cellule caricate viene montata sul tavolino del microscopio e illuminata con luce blu (450-490 nm, freccia blu) per eccitare il colorante. In questa configurazione, gli elementi da 1 a 5 sono posizionati sopra un tavolo antivibrante e all'interno di una gabbia di Faraday. Pannello di destra: Una volta verificata la qualità della contrazione e del carico del colorante con la telecamera (6), la luce emessa viene diretta al PMT, inizia la stimolazione elettrica e il segnale viene inviato al digitalizzatore (7) e al software di acquisizione (8) per registrare il transitorio Ca2+ . La funzione integrata di questi elementi durante un esperimento dal vivo può essere vista nel video supplementare S6. (B) Transitori rappresentativi e calibrati Ca2+ di FDB, PDQA, PL, EDL, EHL e fibre soleo del topo. I segnali simili, rapidi e stretti di FDB, PDQA, PL, EDL ed EHL confermano che hanno MT-II già noto per derivare dalle fibre IIX e IIB, che sono le più abbondanti in questi muscoli. Al contrario, il transitorio soleo è più lento e più piccolo, tipico di MT-I, originariamente descritto nelle fibre I e IIA. La curva rossa sui segnali EDL e soleo dimostra che la fase di decadimento di MT-I e MT-II può essere dotata di una funzione di decadimento biesponenziale. Le barre di calibrazione si applicano a tutti i pannelli. Barra verticale = 2,5 μM di [Ca2+], barra orizzontale = 10 ms. La chiave colorata in basso aiuta a identificare i muscoli. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce; PMT = tubo fotomoltiplicatore; MT-I = morfologia di tipo I; MT-II = morfologia di tipo II. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Misure morfometriche delle fibre corte, intermedie e lunghe ottenute mediante dissociazione enzimatica dell'insieme dei sei muscoli degli arti posteriori del topo. Le fibre intatte, sane e rappresentative di ciascun muscolo sono rappresentate nei pannelli della colonna più a sinistra. Le immagini sono state modificate solo per ridurre il rumore di fondo e migliorare il contrasto, senza manipolazione diretta delle fibre muscolari. Barre di scala = 100 μm (tutti i pannelli). Il protocollo di misurazione, così come l'aspetto e la qualità delle fibre lunghe complete, possono essere ulteriormente visualizzati nella Figura supplementare S1. La colonna centrale mostra la distribuzione delle lunghezze, ordinate dal muscolo che ha reso le fibre più corte (FDB), a quello con le fibre più lunghe (soleo). C'è un continuum di lunghezze in modo che ci sia una certa sovrapposizione tra i muscoli, per un totale di ~ 5,5 mm. Le distribuzioni dei diametri sono presentate nei pannelli delle colonne più a destra. La maggior parte delle fibre è compresa tra 30 e 60 μm, con piccole differenze tra i muscoli. Le analisi test-retest (n = 78 fibre, pari al 9,85% dell'intero campione di n = 792) delle misure morfometriche hanno mostrato una riproducibilità molto elevata (coefficiente medio di variazione dell'1,77%─intervallo di confidenza 95%, CI95%, 1,26-2,27%─coefficiente medio di correlazione di 0,99 (CI95% 0,98-0,99)), evidenziando la buona affidabilità dei risultati. Le curve di distribuzione gaussiane sono state aggiunte con software di creazione di grafici. La Figura S2 supplementare mostra i grafici a barre dei valori medi di lunghezza e diametro e le fusioni delle distribuzioni di lunghezza e diametro di tutti i muscoli per facilitare il confronto. La chiave colorata in basso aiuta a identificare i muscoli. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL, = estensore lungo dell'alluce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Saggi di immunofluorescenza per tipi di fibre nella sospensione cellulare nei muscoli FDB dissociati. Le immagini di diversi campi mostrano fibre FDB intatte e dissociate aderenti al fondo dei vetrini. (A) Una fibra positiva all'antimiosina II (fluorescenza verde, freccia diagonale azzurra) contrasta chiaramente con una negativa (punta di freccia azzurra), dimostrando il potere discriminatorio del saggio. La presenza di entrambe le fibre nell'immagine può essere confermata grazie alla marcatura dei nuclei (fluorescenza blu). (B) Un campo diverso mostra un'altra fibra positiva all'antimiosina II. (C) La corretta identificazione della catena pesante della miosina nelle bande A (fluorescenza verde) da parte degli anticorpi è stata confermata mediante microscopia confocale. Le più note striature nere trasversali corrispondono alle bande I, arricchite in actina, e quindi ci si aspetta che non vengano riconosciute dagli anticorpi. (D) L'ematossilina etichetta in viola i tipici nuclei periferici e abbondanti, e l'eosina etichetta il sarcoplasma della fibra, mostrando una cellula intatta e matura. Barre di scala = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Abbreviazione: FDB = flessore breve delle dita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fibre FDB e EDL Soleo PDQA, PL e EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0.68±0.15 0.46±0.06*,† 0.66±0.12 <0,01
[Ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0,01
RT (ms) 0,95±0,10 1.26±0.20*,† 0.95±0.09 <0,01
Pendenza di salita (F/ms) 5.97±1.41 3.12±0.79*,† 5.83±0.97 <0,01
HW (ms) 3.59±0.85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0,01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0,01
Pendenza di decadimento (F/ms) -0,24±0,07 -0.10±0.03*,† -0,35±0,08* <0,01
τ1 (ms) 1.86±0.37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0,05
τ2 (ms) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0,01
A1 (%) 48.14±7.27 25.94±8.98*,† Codice: 44.59±8.29 <0,01
A2 (%) 51.86±7.27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0,01
Morfologia MT-II MT-I MT-II

Tabella 1: Cinetica dei transienti Ca2+ in fibre enzimaticamente dissociate ottenute da un insieme di sei muscoli degli arti posteriori del topo. I valori sono medi ± deviazione standard. p corrispondono al test di analisi della varianza. *Significativamente diverso dai gruppi FDB e EDL. †Significativamente diverso dai gruppi PDQA, PL ed EHL. Abbreviazioni: F = fluorescenza; [Ca2+] = concentrazione di picco citosolico di Ca2+ ; RT = tempo di salita; HW = durata a metà massimo; DT = tempo di decadimento; τ1 e τ2 = costanti di tempo di decadimento; A1 e A2 = ampiezze di decadimento; FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce; MT-I = morfologia di tipo I; MT-II = morfologia di tipo II.

Fibre FDB (S.p. PDQA PL EDL EHL Soleo p
n 370 142 80 70 87 43
Lunghezza (mm) 0,42±0,05* 2,20±0,26** 2,69±0,26† 3,51±0,53†† 3,83±0,44‡ 4.62±0.64 <0,01
Diametro (μm) 38.40±9.40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 Codice: 46.36±12.85 <0,01

Tabella 2: Misure morfometriche delle fibre corte, intermedie e lunghe ottenute mediante dissociazione enzimatica dell'insieme dei sei muscoli degli arti posteriori del topo. I valori sono medi ± deviazione standard. p corrispondono al test di analisi della varianza. *Statisticamente diverso da PDQA, PL, EDL, EHL e soleus. **Significativamente diverso da PL, EDL, EHL e soleo. †Significativamente diverso da EDL, EHL e soleo. ††Significativamente diverso da EHL e soleo. ‡Significativamente diverso dal soleo. Significativamente diverso da EHL. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce.

Muscolo/Fibre N n Totale tipo I + I/IIA (%) Totale di tipo II (%)
FDB (S.p. 5 747 21.94±11.47 Codice: 78.06±11.47
*FDB 8 1483 Tabella 23.46±2.51 Codice: 76.54±2.51

Tabella 3: Tipi di fibre nelle criosezioni e nella sospensione cellulare nei muscoli FDB dissociati del topo. I valori sono medi ± deviazione standard. N si riferisce al numero di animali, mentre n si riferisce al numero totale di fibre analizzate negli esperimenti. La riga FDB presenta i dati dell'intero muscolo come determinato nelle criosezioni, mentre la riga *FDB corrisponde alle fibre isolate nella sospensione cellulare dopo la dissociazione del muscolo. La colonna "Total type II" riflette fibre pure di tipo IIA, IIX e IIB. Abbreviazione: FDB = flessore breve delle dita.

Muscolo N n Tipo I (%) Tipo I/IIA (%) Tipo IIA (%) Tipo IIX (%) Tipo IIB (%) Totale di tipo II (%)
PDQA 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 ore 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 Dal 23.01±7.03 35.85±5.66 35.66±9.36 94.52±3.90
EDL 4 826 0.00±0.00 ore 10.44±8.33 5.67±5.07 Ore 24.75±10.93 Visualizzazione del materiale 59.15±11.36 89.56±8.33
EHL 5 618 0.24±0.76 5.29±3.31 Dal 19.04±6.83 Ore 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
Soleo 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 Versione 66.08±5.59

Tabella 4: Tipi di fibre nelle criosezioni dei muscoli che danno fibre intermedie e lunghe del topo. I valori sono medi ± deviazione standard. N si riferisce al numero di animali, mentre n si riferisce al numero totale di fibre analizzate negli esperimenti. Tutte le file presentano i dati dell'intero muscolo come determinato nelle criosezioni. Le colonne di tipo I, IIA, IIX e IIB riflettono fibre pure, mentre la colonna I/IIA si riferisce alle fibre ibride. La colonna "Totale tipo II" è la somma delle colonne di tipo IIA, IIX e IIB. Abbreviazioni: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce.

File supplementare 1: Studi sull'espressione della catena pesante della miosina nei muscoli interi. I protocolli presentano dettagli per la determinazione delle isoforme delle catene pesanti della miosina mediante immunofluorescenza in criosezioni e mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide in omogenati di muscoli interi. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare S1: Dettagli della morfologia delle fibre ottenute dalla dissociazione enzimatica dell'insieme dei sei muscoli degli arti posteriori del topo. (A) A sinistra è mostrato il righello di calibrazione del micrometro del microscopio aperto per impostare la scala nel software di analisi delle immagini. Il pannello di destra mostra come il diametro sia stato misurato ripetutamente come indicato dalle linee blu perpendicolari all'asse lungo della fibra (frecce blu), mentre la lunghezza è stata misurata una volta da punta a punta come illustrato dalla linea blu lungo l'asse maggiore della fibra. (B) Diverse immagini sono state assemblate con piccole modifiche per dimostrare l'aspetto lungo e sano delle fibre PDQA, PL, EDL, EHL e soleo (piccoli inserti blu, verdi, gialli, arancioni e rosa). Le immagini assemblate sono state ulteriormente modificate per dare alle fibre un aspetto migliore (immagini grandi, in bianco e nero). (C) Immagini DIC di fibre FDB, PDQA, PL e soleo che evidenzino la normale irregolarità della loro punta e le loro ben note striature trasversali. L'aspetto DIC delle restanti fibre EDL ed EHL può essere visto nel video supplementare S3 e nel video supplementare S4. Barre di scala = 100 μm. La chiave colorata in basso aiuta a identificare i muscoli. Abbreviazioni: FDB, flessore breve delle dita; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, estensore lungo delle dita; EHL, estensore lungo dell'alluce; DIC = Contrasto di interferenza differenziale. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare S2: Grafici a barre e distribuzioni di lunghezza e diametro delle fibre ottenute dalla dissociazione enzimatica dell'insieme dei sei muscoli degli arti posteriori del topo. (A) I grafici a barre (medie ± deviazioni standard) e (B) gli istogrammi uniti confermano la disparità delle lunghezze ma la somiglianza dei diametri in tutti i gruppi. *Significativamente diverso da PDQA, PL, EDL, EHL e soleo. **Significativamente diverso da PL, EDL, EHL e soleo. †Significativamente diverso da EDL, EHL e soleo. ††Significativamente diverso da EHL e soleo. ‡Significativamente diverso dal soleo. Significativamente diverso da EHL. La chiave colorata in basso aiuta a identificare i muscoli. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare S3: Studi di immunofluorescenza per la composizione del tipo di fibra dell'insieme dei sei muscoli degli arti posteriori del topo. Le criosezioni rappresentative marcate con anticorpi utilizzate per le analisi dimostrano la buona qualità e l'integrità dei campioni. C'è una chiara predominanza di fibre di tipo II in tutti i muscoli, ad eccezione del soleo in cui la quantità di fibre di tipo I è considerevole. Barre di scala = 100 μm. La chiave colorata in basso aiuta a identificare i muscoli. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura supplementare S4: Separazione elettroforetica delle isoforme MHC nell'insieme di sei muscoli degli arti posteriori del topo. (A) Due gel completi rappresentativi eseguiti in giorni diversi con campioni diversi dimostrano la qualità, la pulizia e la riproducibilità della distanza di separazione e migrazione delle isoforme MHC quando colorate con blu di Coomassie. Sebbene queste due immagini siano state leggermente modificate per migliorare il contrasto e la chiarezza per il lettore, le analisi sono state eseguite in gel non modificati. (B) Esempi di analisi delle bande per ciascuno dei sei muscoli. Dopo aver selezionato un ROI nelle corsie del gel, viene generato un profilo grafico e viene utilizzato un adattamento gaussiano per stimare la proporzione di isoforme MHC nell'insieme di sei muscoli. La composizione MHC riscontrata è stata: FDB: I 9,0 ± 5,0%, IIa + IIx 91,0 ± 5,0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4%, IIb 74,1 ± 2,4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2%, IIb 75,1 ± 2,2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3%, IIb 78,0 ± 2,3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0%, IIb 72,5 ± 1,0% (n = 3); soleo: I 35,8 ± 2,5%, IIa (+IIx + IIb quando presente) 64,2 ± 2,5% (n = 4). La chiave colorata in basso aiuta a identificare i muscoli. Il rettangolo grigio sotto il gel più a destra in A si riferisce al marcatore di peso molecolare che indica la migrazione dell'IIa a ~ 200 KDa. Abbreviazioni: FDB = flessore breve delle dita; PDQA = peroneo digiti quarti; PL = peroneo lungo; EDL = estensore lungo delle dita; EHL = estensore lungo dell'alluce; MHC = catena pesante della miosina; ROI = regione di interesse. Fare clic qui per scaricare il file.

Video supplementare S1: Il lungo peroneo danneggiato e ondulato (PL, a sinistra) non si contrae alla stimolazione, mentre il PL intatto (a destra) si contrae bene, anche quando è più lontano dagli elettrodi. Ingrandimento 0,8x. Il protocollo di stimolazione rilascia impulsi di corrente rettangolari di 1,2 ms, 0,7 Hz e 50 V attraverso due elettrodi. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S2: Contrazione della fibra peronea lunga. Ingrandimento 20x. Modalità di contrasto a interferenza differenziale. Il protocollo di stimolazione rilascia impulsi di corrente rettangolari di 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V attraverso due elettrodi di platino. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S3: Contrazione della fibra estensore lungo delle dita. Ingrandimento 20x. Modalità di contrasto a interferenza differenziale. Il protocollo di stimolazione rilascia impulsi di corrente rettangolari di 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V attraverso due elettrodi di platino. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S4: Contrazione della fibra estensore lungo dell'alluce. Ingrandimento 20x. Modalità di contrasto a interferenza differenziale. Il protocollo di stimolazione rilascia impulsi di corrente rettangolari di 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V attraverso due elettrodi di platino. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S5. Contrazione della fibra soleosa. Ingrandimento 20x. Modalità di contrasto a interferenza differenziale. Il protocollo di stimolazione rilascia impulsi di corrente rettangolari di 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V, attraverso due elettrodi di platino. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S6: Registrazione dal vivo di un transiente Ca2+ da una fibra estensore lungo delle dita caricata con Mag-Fluo-4, AM come descritto al punto 4.1.4. Il protocollo di stimolazione rilascia impulsi di corrente rettangolari di 1,2 ms, 0,5 Hz e 50 V attraverso due elettrodi di platino. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

A complemento dei modelli disponibili per lo studio della biologia del muscolo scheletrico maturo, qui dimostriamo la dissociazione enzimatica di successo di una serie di muscoli di topo con fibre corte, intermedie e lunghe. Queste fibre permettono di dimostrare la generalizzabilità della cinetica MT-II dei transienti Ca2+ nel muscolo scheletrico. Inoltre, sono stati classificati i tipi di fibre nei muscoli intatti e interi. Dato che l'FDB è il muscolo più utilizzato per gli esperimenti fisiologici, sono stati valutati i tipi di fibre presenti nella sospensione cellulare dopo la dissociazione.

Una batteria di fibre intatte corte, intermedie e lunghe per studi di biologia muscolare
La tecnica di dissezione, la durata del trattamento enzimatico, il tipo di enzima utilizzato e la procedura di triturazione sono passaggi critici all'interno del protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate intatte. La dissezione deve essere eseguita il più velocemente possibile per ridurre il tempo in ipossia evitando inutili stiramenti. Quest'ultimo punto è particolarmente rilevante per il soleo, che non deve essere rimosso tirando verso l'alto il complesso gastrocnemio-soleo. Inoltre, un trattamento enzimatico estensivo (~3 h)20,48 e procedure di triturazione scadenti (ad esempio, durezza, scarsa esperienza del ricercatore) danneggiano le cellule, come confermato empiricamente in diversi laboratori. La collagenasi di tipo 2 è raccomandata rispetto ad altri tipi di collagenasi. La formazione di bolle durante la triturazione deve essere evitata e i muscoli o le fibre devono essere manipolati solo con pipette di vetro invece che con puntali di plastica. L'uso di fiale di vetro è preferito durante l'intera procedura rispetto alle fiale coniche di plastica, perché le prime danno maggiore visibilità, possono essere posizionate verso l'alto sullo stereoscopio per un'osservazione dall'alto del muscolo quando si trovano nelle soluzioni, danno più spazio per la triturazione dei muscoli più lunghe e più voluminose rispetto alle FDB e sono resistenti ai graffi causati dalle pipette Pasteur in vetro. Poiché l'età, il peso e le condizioni metaboliche (ad esempio, obesità sana rispetto a obesità ad alto contenuto di grassi) influenzano l'efficienza del metodo, diversi parametri potrebbero richiedere un'ottimizzazione quando si lavora con animali al di fuori dell'intervallo utilizzato in questo manoscritto. È importante sottolineare che una lieve esposizione di un muscolo a determinati enzimi come quelli qui utilizzati e una corretta procedura di dissociazione non influenzano funzionalmente le fibre, come dimostrato dalle prove raccolte nel corso di decenni da più gruppi, alcune delle quali sono state riassunte alcuni anni fa49. Ciò è ulteriormente supportato dal fatto che il picco [Ca2+] misurato con coloranti veloci di Ca2+ durante una contrazione ottenuta in fasci sezionati manualmente e fibre enzimaticamente dissociate di topi può essere considerato comparabile (esaminato in 47).

Sebbene esistano altri modelli per gli studi di biologia muscolare, come i miotubi C2C12, le linee cellulari di mioblasti umani normali e mutati o le fibrederivate da cellule staminali pluripotenti (iPSC) 31,39,50,51,52,53, sono immaturi e non sono discussi qui. Anche le fibre permeabilizzate o scuoiate sono modelli informativi e ben caratterizzati54,55, ma non sono intatte. Il modello di fibre isolate manualmente offre diversi vantaggi, come presentato altrove20, ma ha una bassa efficienza e richiede un elevato addestramento. Questi fatti evidenziano che il modello di interesse qui – fibre ottenute per dissociazione enzimatica – offre la possibilità di ottenere fibre muscolari scheletriche intatte, abbondanti, mature di diverso tipo. Un limite del modello, tuttavia, è che la mancanza di tendini limita la valutazione diretta delle proprietà contrattili nelle fibre isolate.

Dato che la lunghezza delle fibre non è la stessa della lunghezza dei muscoli14,42 e che le fibre sono l'unità di sperimentazione, è più pertinente classificare la lunghezza delle fibre, non dei muscoli. Dati i nostri risultati e le loro potenziali implicazioni sperimentali, le fibre FDB possono essere classificate come corte (<1 mm); PDQA e PL come intermedi (da 1 a 3 mm); e EDL, EHL e soleo lunghi (>3 mm). Le fibre corte sono le più facili e più abbondantemente ottenute (~400-500 fibre per topo) e sono adatte per esperimenti di microscopia a fluorescenza in cui l'attaccamento della fibra alla camera inferiore è fondamentale, o quando è necessario evitare artefatti di movimento (ad esempio, transitori Ca2+). Le fibre lunghe sono le più difficili da ottenere, hanno la resa più bassa e sono migliori per l'espressione proteica utilizzando tecniche di separazione o studi di biologia molecolare a singola cellula. Le fibre intermedie possono essere ottenute in buona quantità (~50 fibre per topo) dopo un addestramento moderato e sono adatte a molti approcci sperimentali, come mostrato ad esempio con gli esperimenti sui transienti Ca2+. Riconoscendo che FDB, EDL e soleo sono stati utilizzati in precedenza, questo è il primo lavoro a isolare con successo le fibre dai muscoli PDQA, PL ed EHL, aumentando così la disponibilità di modelli per gli studi sui muscoli scheletrici maturi. Inoltre, l'ottenimento di fibre da muscoli diversi assicura che si ottengano più informazioni dallo stesso animale, riducendo la variabilità sperimentale, aumentando la potenza statistica e la solidità biologica delle conclusioni e riducendo il numero di animali utilizzati nella sperimentazione.

Generalizzabilità della cinetica dei transienti Ca2+
Analizzando la cinetica dei transienti Ca2+ nelle fibre muscolari scheletriche mature dei mammiferi, abbiamo precedentemente dimostrato che le fibre di tipo I e IIA condividono la cosiddetta morfologia di tipo I (MT-I), mentre le fibre IIX e IIB condividono la morfologia MT-II. Tipicamente, i segnali MT-II hanno un RT inferiore a 1,2 ms, DT inferiore a 25 ms, A1 superiore al 30%, [Ca2+] superiore a 15 μM e si trovano facilmente nelle fibre FDB ed EDL33,47. Dopo aver confrontato i risultati dei nuovi transienti Ca2+ di PDQA, PL ed EHL con quelli trovati qui e quelli precedentemente pubblicati per FDB e EDL, è facile concludere che sono tutti MT-II. Un'ulteriore osservazione interessante è che l'aumento della disponibilità di nuovi muscoli arricchiti in fibre di tipo IIX e IIB come modelli per ottenere fibre dissociate permette di confermare che la cinetica dei transienti Ca2+ può essere generalizzata: le fibre di tipo IIX e IIB hanno la MT-II indipendentemente dalla loro fonte (i.e., flessori (FDB), estensori (EDL e EHL), o peronei (PDQA e PL)). Ciò rafforza l'idea di un programma o profilo cellulare genico stabilito del meccanismo ECC, che è piuttosto simile all'interno di tutte le fibre dello stesso tipo, e che le differenze nel macchinario molecolare (cioè le isoforme e la quantità di proteine) che sono alla base della generazione di transitori di Ca2+ spiegano le differenze nelle morfologie riportate tra le fibre33. Infine, un'implicazione pratica è che registrando con Mag-Fluo-4 il transitorio Ca2+ di una fibra, è possibile conoscerne in modo affidabile il tipo.

Espressione di MHC nei muscoli e nelle fibre isolate: implicazioni per i tipi di fibre utilizzate negli esperimenti fisiologici
Conoscere il tipo di fibra aumenta l'affidabilità della ricerca muscolare. Ad esempio, nei topi knockout di qualsiasi proteina espressa in modo differenziale in base ai tipi di fibre, l'utilizzo di fibre dell'FDB senza alcuna tipizzazione può portare a risultati fuorvianti. I nostri dati confermano che l'FDB è un muscolo misto con una predominanza di fibre di tipo IIX, in accordo con i precedenti articoli 25,31,56. Ancora più importante, c'era un'alta concordanza tra la proporzione di tipi di fibre presenti in tutto il muscolo e quella ottenuta dopo la dissociazione. Poiché queste informazioni sono nuove e di solito non vengono discusse negli articoli che utilizzano fibre FDB, si può ipotizzare che, per caso, molti risultati ottenuti nelle fibre FDB dissociate possano davvero riflettere informazioni miste di ~20-25% provenienti da fibre di tipo I e 75-80% da fibre di tipo II. Gli studi futuri che utilizzano il muscolo FDB dovrebbero presentare i dati e la loro discussione corrispondente, relativi ai tipi di fibre.

Poiché il soleo è altamente arricchito in fibre ossidative di tipo I, IIA e I/IIA 57,58,59, queste sono le fibre che si trovano nella sospensione dopo la dissociazione33. L'EDL, un altro muscolo ben noto, è quasi privo di fibre di tipo I 57,58,59, rendendo quindi solo fibre veloci dopo la dissociazione 33. Seguendo la stessa logica e in base ai risultati di tipizzazione che mostrano l'arricchimento delle fibre di tipo II nei tre nuovi muscoli, ulteriormente supportato dal fatto che le poche fibre di tipo I presenti nei muscoli peronei del topo sonocentrali 60 e non ci si aspetta che vengano raggiunte durante una lieve dissociazione, ipotizziamo che la probabilità di impiegare una fibra veloce IIX o IIB in un esperimento con fibre dissociate di PDQA, PL o EHL può arrivare fino all'80-90%. Questo sembra essere vero in base ai dati dei transienti Ca2+ in cui non sono stati trovati segnali MT-I. Date le loro dimensioni, queste fibre offrono il vantaggio di essere adatte alla digitazione dopo aver terminato un esperimento funzionale. Inoltre, la specificità di BTS per MHC II aiuta a discriminare tra i tipi di fibre rimuovendo gli artefatti di movimento. Infine, sebbene questo metodo di tipizzazione delle fibre sia stato più laborioso di quelli ottimizzati recentemente descritti61,62, non ha influenzato i risultati del presente lavoro.

Conclusioni
I dettagli metodologici presentati possono favorire l'uso di una varietà di fibre muscolari enzimaticamente dissociate nello studio della biologia muscolare. La versatilità del modello è supportata dalla possibilità di ottenere fibre all'interno di un'ampia gamma di lunghezze e tipi e dal loro utilizzo in diverse applicazioni sperimentali. Oltre a FDB, EDL e soleo la cui dissociazione è stata segnalata anni fa, abbiamo dimostrato la fattibilità di ottenere fibre intermedie e lunghe da altri muscoli come PDQA, PL ed EHL. Data la facilità con cui la dissezione può essere eseguita e il numero di fibre che si possono ottenere, nonché l'omogeneità e la dimensione delle fibre, proponiamo la PL come modello di routine, adatto per gli studi del muscolo scheletrico maturo. Ciò è supportato dai nostri risultati che la cinetica dei transitori Ca2+ nel muscolo scheletrico può essere generalizzata indipendentemente dalla loro fonte.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori esprimono la loro gratitudine al professor Robinson Ramírez di UdeA per l'aiuto con gli animali e alcune foto e a Carolina Palacios per il supporto tecnico. Johan Pineda di Kaika ci ha aiutato a configurare le telecamere a colori e a fluorescenza. Shyuan Ngo, dell'Università del Queensland, ha gentilmente corretto il manoscritto. Questo studio è stato finanziato dal CODI-UdeA (2020-34909 dal 22 febbraio 2021 e 2021-40170 dal 31 marzo 2022, SIU) e dall'Ufficio dipianificazione-UdeA (E01708-K e ES03180101), Medellín, Colombia, al JCC. I finanziatori non hanno partecipato alla raccolta e all'analisi dei dati, alla stesura o alla presentazione dei manoscritti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologia Numero 202 muscolo scheletrico fibre muscolari tipi di fibre Ca2+ accoppiamento eccitazione-contrazione immunofluorescenza catena pesante della miosina
Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita
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Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

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