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Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Abstract

Las fibras musculares esqueléticas obtenidas por disociación enzimática de los músculos de ratón son un modelo útil para experimentos fisiológicos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos se ocupan de las fibras cortas del flexor corto de los dedos (FDB), lo que restringe el alcance de los resultados relacionados con los tipos de fibras, limita la cantidad de material biológico disponible e impide una conexión clara entre los fenómenos fisiológicos celulares y los conocimientos bioquímicos y dinámicos previos obtenidos en otros músculos.

Este artículo describe cómo obtener fibras intactas de seis músculos con diferentes perfiles y longitudes de tipo de fibra. Utilizando ratones adultos C57BL/6, mostramos el protocolo de disección muscular y aislamiento de fibras y demostramos la idoneidad de las fibras para estudios transitorios de Ca2+ y su caracterización morfométrica. También se presenta la composición de tipo de fibra de los músculos. Cuando se disociaron, todos los músculos quedaron intactos, fibras vivas que se contraen enérgicamente durante más de 24 h. La BDF dio fibras cortas (<1 mm), peroneo corto (PDQA) y peroneo largo (PL) intermedias (1-3 mm), mientras que los músculos extensor largo de los dedos (EDL), extensor largo de los dedos (EHL) y sóleo liberaron fibras largas (3-6 mm).

Cuando se registraron con el colorante rápido Mag-Fluo-4, los transitorios de Ca2+ de las fibras PDQA, PL y EHL mostraron una cinética rápida y estrecha que recuerda a la morfología tipo II (MT-II), que se sabe que corresponde a las fibras tipo IIX y IIB. Esto es consistente con el hecho de que estos músculos tienen más del 90% de fibras tipo II en comparación con FDB (~80%) y sóleo (~65%). Más allá de la FDB, demostramos por primera vez la disociación de varios músculos, que dan lugar a fibras que abarcan un rango de longitudes entre 1 y 6 mm. Estas fibras son viables y dan transitorios rápidos de Ca2+ , lo que indica que el MT-II se puede generalizar a fibras rápidas IIX y IIB, independientemente de su fuente muscular. Estos resultados aumentan la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

Introduction

El músculo esquelético maduro de los mamíferos es un tejido multifuncional. Regula fuertemente el metabolismo, es la principal fuente de producción de calor y sus propiedades dinámicas le confieren un papel clave en la respiración, el movimiento de segmentos corporales o el desplazamiento de un punto a otro 1,2,3. El músculo esquelético también es relevante para la fisiopatología de muchas enfermedades, incluidas las hereditarias y crónicas, como las miopatías, las distrofias o la sarcopenia, así como muchas afecciones crónicas no musculares, como las enfermedades cardiometabólicas 3,4,5,6,7,8.

El estudio ex vivo de las propiedades estructurales y funcionales del músculo esquelético maduro en el contexto de la salud y la enfermedad ha sido posible principalmente a través de dos modelos experimentales: músculo entero y fibras aisladas. Enel siglo XX, los investigadores explotaron las propiedades de los músculos extensor largo de los dedos (EDL) intactos, el sóleo, el tibial anterior y el gastrocnemio de diferentes especies pequeñas como modelos fundamentales para aprender sobre las unidades motoras, los tipos de fibras y las propiedades dinámicas, como la fuerza y la cinética de contracción yrelajación.16. Sin embargo, el advenimiento de estudios de biología celular más refinados movió el área hacia el estudio de fibras musculares individuales. Un trabajo pionero permitió entonces aislar fibras intactas del flexor corto de los dedos (FDB) de ratas mediante disociación enzimática para su posterior caracterización 17,18,19. Aunque las fibras FDB también pueden obtenerse por disección manual20, la facilidad y el alto rendimiento de la disociación enzimática de los músculos murinos, además de su idoneidad para una variedad de enfoques experimentales, han hecho que este último modelo sea ampliamente utilizado durante las últimas dos décadas.

Las fibras cortas FDB son adecuadas para estudios electrofisiológicos y otros estudios biofísicos, análisis bioquímicos, metabólicos y farmacológicos, experimentos de microscopía electrónica y de fluorescencia, transfección para enfoques de biología celular o como fuente de células madre en estudios de miogénesis 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Sin embargo, el uso exclusivo de fibras FDB en experimentos musculares reduce el alcance de la investigación que se ocupa de los tipos de fibras y limita la cantidad de material biológico disponible para algunas técnicas metodológicas o para obtener más información de un animal. Estas limitaciones dificultan una clara correlación de los fenómenos fisiológicos celulares con estudios bioquímicos y dinámicos previos realizados en diferentes músculos enteros e intactos (por ejemplo, EDL, sóleo, peroneo).

Superando estas limitaciones, algunos grupos lograron disociar los músculos EDL y sóleo más largos 24,33,34,35,36,37,38,39,40, abriendo la puerta a extender aún más el método a otros músculos relevantes. Sin embargo, el uso de EDL y fibras de sóleo es aún escaso, probablemente debido a la falta de detalles metodológicos para obtenerlas como fibras intactas. Aquí, describimos en detalle cómo aislar fibras de diferentes longitudes y tipos de seis músculos: tres de ellos ya descritos (FDB, EDL y sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo [EHL], peroneo largo [PL] y peroneo de los dedos del cuarto [PDQA]). Los resultados del presente trabajo confirman que el modelo de fibras disociadas enzimáticamente es apto para una amplia gama de estudios y futuras correlaciones con datos publicados previamente, aumentando así la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro.

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Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética en Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia (UdeA) (actas 104 del 21 de junio de 2016 y 005 del 15 de abril de 2021), de acuerdo con la Ley 84 de 1989 y la Resolución 8430 de 1993 expedida por el Gobierno de Colombia y fueron realizados y reportados en cumplimiento de la Zootecnia: Directrices para la presentación de informes sobre experimentos in vivo (ARRIVE)41. Todos los resultados presentados aquí provienen de ratones machos sanos, de 7 a 13 semanas de edad, de 20 a 26 g, C57BL/6. En la Figura 1 se muestra el diseño general de este estudio y el orden de los procedimientos. Todos los detalles de los reactivos, materiales y equipos se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Animales

  1. Aloje un máximo de seis ratones por jaula acrílica, transparente, rectangular, con cama derivada de la madera, en condiciones de temperatura controlada (21 ± 2 °C) y ciclos luz-oscuridad (12:12 h).
  2. Dar a los animales libre acceso a alimentos y agua del grifo en instalaciones específicas para animales libres de patógenos sin enriquecimiento ambiental.

2. Disección

  1. Soluciones, materiales y reactivos
    1. Preparar y filtrar (0,22 μm) las soluciones de trabajo con la siguiente composición (todas las concentraciones en mM):
      1. Tilode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glucosa, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Disociación: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Preparar dos cámaras de disección; estereoscopio; tijeras de funcionamiento; tijeras finas; pinzas finas; y viales de vidrio limpios, transparentes, no cónicos, de 1-1,5 cm de ancho, de 3-4 mL de volumen total con tapones. Disponer de un sistema de estimulación eléctrica de los músculos de las cámaras de disección.
    3. Prepare pipetas de vidrio Pasteur pulidas al fuego de diferentes puntas de ancho: 5, 4, 3, 2 y 1 mm.
    4. Ajuste el baño de agua a 37 °C. Pesar alícuotas de 3 mg de colagenasa tipo 2.
  2. Procedimiento
    1. Sacrificar el ratón utilizando métodos aprobados por el Comité de Ética local. Se recomienda la luxación cervical porque es rápida, menos estresante y evita la exposición a fármacos, que pueden afectar al tejido muscular (como el CO2 o algunos anestésicos). Inicie la disección inmediatamente para obtener mejores resultados.
    2. Coloque el ratón sobre una superficie de espuma y pegue con cinta adhesiva o alfiler las extremidades delanteras. Cortar ambas extremidades traseras por encima de las rodillas con las tijeras de operación, transferir cada una de ellas a una cámara de disección separada y agregar Tyrode frío (10-20 °C) para cubrir el tejido.
      NOTA: Cada extremidad posterior dará seis músculos diferentes en el siguiente orden: FDB, sóleo, EDL, EHL, PL y PDQA. En la Figura 2 y en otros lugares se dan referencias anatómicas detalladas para diseccionar los seis músculos intactos de tendón a tendón42.
    3. Sujete la primera extremidad posterior a la cámara de disección en una posición en la que la cara posterior de las piernas sea visible. Retire la piel con aumento; luego exponga y retire el FDB (Figura 2). Guárdelo en un frasco de vidrio etiquetado con 1 ml de solución de Tyrode.
      NOTA: Se requiere un aumento adecuado y un entrenamiento previo para evitar cualquier corte no deseado en el tejido muscular.
    4. Exponga, retire y guarde el sóleo en un frasco separado con 1 ml de Tyrode. Utilice unas tijeras finas para separar primero el gastrocnemio y luego para retirar el sóleo, como se indica en la Figura 2.
    5. Exponga la cara anterior de la pierna, retire la piel e identifique los tendones distales del tibial anterior y los músculos EDL en el tobillo. Retire y deseche los tibialis; luego corte los tendones distales de la EDL (Figura 2). Continúe la disección hasta retirar el EDL y colóquelo en un vial de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    6. Extirpe el músculo EHL, que se encuentra justo posterior y medial a la EDL. Comience la disección identificando y siguiendo el tendón hasta el1er dedo, como se indica en el panel correspondiente de la Figura 2. Mantenga el músculo en un frasco de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    7. Identificar y seguir el tendón más externo del peroneo para cortarlo y extraer el músculo PL (Figura 2). Coloque el músculo en un frasco de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    8. Identificar y seguir el tendón hasta el4º dígito; córtelo y retire el músculo PDQA (Figura 2). Colóquelo en un frasco de vidrio separado con 1 ml de Tyrode.
    9. Repita el procedimiento con la segunda extremidad posterior.
    10. Reúna ambos músculos del mismo tipo en un frasco de vidrio etiquetado o en una pequeña placa de Petri con solución de Tyrode.
      NOTA: Si se planea diseccionar más de dos pares de músculos durante una sesión de trabajo, contrate a dos investigadores para el procedimiento de disección.

3. Protocolo de aislamiento de fibras musculares

  1. Renueve la solución Tyrode en las cámaras de disección para eliminar los residuos y el pelo de ratón. Vierta los músculos FDB en una cámara de disección, verifique su integridad y transfiéralos a un nuevo frasco de vidrio con 1 ml de solución de disociación. Repita este procedimiento con los músculos EHL, PL y PDQA.
    NOTA: Si un músculo se ve hipercontraído, cortado o no responde a la estimulación eléctrica, no continúe con el siguiente paso del protocolo. En su lugar, optimice el protocolo de disección verificando la calidad de las soluciones (pH, contaminación, osmolaridad) y adquiriendo más habilidades de disección (Figura 1C y Video Suplementario S1).
  2. Realizar cortes longitudinales o diagonales en los músculos sóleo y EDL, siguiendo la orientación de las fibras (Figura 2). Para el sóleo, sigue el tendón central, cortando ~80% de su longitud. Para EDL, simplemente siga uno o dos tendones y corte aproximadamente la misma longitud que para el sóleo. Coloque cada par de músculos en frascos de vidrio con 1 ml de solución de disociación.
    NOTA: Este procedimiento hace que la EDL y el sóleo sean más pequeños y permite que la colagenasa ingrese mejor al tejido. Es obligatorio un aumento suficiente (40-50x), así como tijeras finas y fórceps. Compruebe siempre la integridad de la muestra mediante inspección visual y estimulación eléctrica antes de continuar con el siguiente paso del protocolo de disociación.
  3. Añadir 3 mg de colagenasa tipo 2 (con una actividad de 250-300 U/mg) a cada vial que contenga 1 mL de solución de disociación y un par de músculos. Estandarizar la cantidad exacta de colagenasa teniendo en cuenta la actividad del lote enzimático utilizado.
  4. Incubar los pares de músculos en el baño de agua durante 65-90 min a 36,8-37 °C, agitando suavemente.
    NOTA: Sea riguroso con el control de temperatura. Estandarizar el procedimiento para que los músculos no permanezcan en colagenasa por más de 100 min para evitar daños.
  5. Compruebe los viales con aumento estereoscópico cada 5 minutos después de los 65º minutos de incubación. Cuando los músculos se vean ligeramente ondulados, irregulares y sueltos, agite suavemente el vial y verifique si algunas fibras comienzan a desprenderse fácilmente. Si este es el caso, lavar los músculos con Tyrode a temperatura ambiente para inactivar y eliminar la colagenasa.
    NOTA: El lavado debe hacerse con cuidado, sin tocar los músculos con las pipetas. Comience agregando 0,8 ml de Tyrode y luego retire 0,8 ml de la solución. Repita este procedimiento 4-5 veces y verifique que la solución se vuelva completamente transparente.
  6. Separe más fibras de la mayor parte de los músculos con una trituración muy suave en Tyrode con la ayuda del juego de pipetas Pasteur pulidas al fuego. Comience agitando la solución alrededor del músculo con la pipeta más ancha (punta de 5 mm) y luego tire suavemente de los músculos hacia adentro y hacia afuera de la pipeta 3-4x. Cuando el músculo comience a liberar fibras y se vuelva más delgado, repita el procedimiento con la siguiente pipeta (punta de 4 mm).
    NOTA: Las fibras renderizadas a través de este procedimiento permanecen excitables y se contraen enérgicamente durante más de 24 h, como se ejemplifica con fibras PL, EDL, EHL y sóleo en el vídeo complementario S2, el vídeo complementario S3, el vídeo suplementario S4 y el vídeo complementario S5.

4. Procedimientos experimentales

NOTA: Las fibras aisladas se utilizaron para las estimaciones de la concentración sarcoplásmica de Ca2+ , las mediciones morfométricas y los estudios de expresión de cadenas pesadas de miosina (MHC).

  1. Medición del Ca sarcoplásmico2+ Concentración durante una contracción
    1. Monta un portaobjetos de vidrio limpio en la cámara de baño experimental. Cubra el portaobjetos con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~400 μL de la suspensión de fibra sobre el portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
    2. Monte la cámara experimental en la platina de un microscopio invertido equipado para la epifluorescencia (Figura 3A).
    3. Evocar espasmos individuales para verificar la viabilidad de las fibras mediante la aplicación de pulsos de corriente rectangulares (0,8-1,2 ms) a través de los dos electrodos de platino colocados a ambos lados de la cámara experimental. Incluso cuando se adhiere a la laminina, la contracción de las fibras sigue siendo visible principalmente en los extremos.
    4. Cargue las fibras con 3,5-4,5 μM del colorante rápido Ca2+ Mag-Fluo-4, AM durante 4-5 min en solución de Tyrode. Pasado este tiempo, lavar suavemente con Tyrode para eliminar el tinte extracelular. Deje que el tinte intracelular se desesterifique durante ~ 15-20 minutos en condiciones de oscuridad. Mantenga siempre la temperatura por debajo de 22 °C para evitar la compartimentación del tinte.
      NOTA: Prepare un stock de Mag-Fluo-4, AM en dimetilsulfóxido (DMSO) solamente, de modo que la concentración final de DMSO en la solución de Tyrode de carga sea inferior al 0,5%.
    5. Ilumine la fibra con un diodo emisor de luz (LED) blanco y un conjunto de filtros con las siguientes longitudes de onda para excitación/dicroica/emisión: 450-490/510/515 nm (Figura 3A).
      NOTA: Las fuentes alternativas de excitación incluyen lámparas de fluorescencia de mercurio y xenón. Utilice la intensidad y el tamaño más bajos posibles del punto de excitación para evitar el fotoblanqueo del tinte y el daño a la célula.
    6. Evocar la respuesta de Ca2+ de la fibra (transitorios sarcoplásmicos de Ca2+ ) aplicando pulsos de corriente rectangulares (0,8-1,2 ms) a través de los dos electrodos de platino colocados a ambos lados de la cámara experimental a 20-22 °C.
    7. Recopile y guarde las señales luminosas con un objetivo de larga distancia de inmersión en aceite 40x adecuado para fluorescencia y un tubo fotomultiplicador (PMT) conectado a un digitalizador (Figura 3A y Video complementario S6). Asegure una escala en el software de adquisición de 0-200 unidades arbitrarias (UA) y establezca la fluorescencia en reposo (Frest) del experimento en 10 UA en esa escala modulando el tamaño del punto de excitación y la ganancia del PMT. Una vez estandarizado el procedimiento, mantenga la ganancia sin modificar de un experimento a otro y establezca la escala solo mediante ajustes menores en el tamaño del punto.
      NOTA: Si surgen artefactos de movimiento, use 20-30 μM de N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS) en la solución de Tyrode.
    8. Analice y calibre las señales de la siguiente manera:
      1. Filtro de paso bajo de toda la traza a 1 kHz.
      2. Calcule el reposo F en 1 s de la traza, ajuste el reposo F a 0 y mida la amplitud de los transitorios Sarcoplásmicos Ca2+ (pico F). Presente la amplitud como en la ecuación (1):
        Equation 1(1)
      3. Calcular la concentración máxima de Ca2+ ([Ca2+], μM) utilizando la ecuación (2)26 y los siguientes parámetros: constante de disociación in situ (Kd) = 1,65 × 105 μM2, fluorescencia máxima (Fmáx.) de 150,9 UA, fluorescencia mínima (Fmin) de 0,14 UA, concentración de Mag-Fluo-4 [D]T de 229,1 μM 26. Elpico F ya se obtuvo en el paso 4.1.8.2.
        Equation 2(2)
      4. Mida el tiempo de subida del 10 % al 90 % de la amplitud (RT, ms), la duración a la mitad del máximo (HW, ms) y el tiempo de decaimiento del 90 % al 10 % de la amplitud (DT, ms). A continuación, estimamos la cinética de decaimiento de acuerdo con un ajuste con la función biexponencial (ecuación 3):
        Equation 3(3)
      5. Guarde los valores de las constantes de tiempo de decaimiento τ1 y τ2 (ms) y las amplitudes A1 y A226.
  2. Medidas morfométricas
    1. Monta un portaobjetos de vidrio limpio en la cámara de baño experimental. Cubra el portaobjetos con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~400 μL de la suspensión de fibra sobre el portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
    2. Evocar espasmos individuales para verificar la viabilidad de las fibras mediante la aplicación de pulsos de corriente rectangulares (0,8-1,2 ms) a través de los dos electrodos de platino colocados a ambos lados de la cámara experimental. Incluso cuando se adhiere a la laminina, la contracción de las fibras sigue siendo visible principalmente en los extremos.
    3. Adquiera imágenes de las fibras vivas utilizando objetivos de 10x y 20x y una cámara de al menos 5 megapíxeles montada en un microscopio de fluorescencia invertida. Almacene las imágenes en archivos . Formato TIFF para análisis offline.
      NOTA: Es posible que se necesite un conjunto de ~ 2-6 imágenes para capturar completamente una fibra larga.
    4. Imagine una regla de calibración de micrómetro de microscopio con el mismo aumento. Almacene las imágenes en archivos . Formato TIFF para análisis offline.
    5. Mida las longitudes y diámetros de las fibras utilizando la herramienta de calibración del software gratuito para análisis de imágenes de la siguiente manera:
      1. Establezca una relación entre los píxeles y la distancia conocida (μm) en las imágenes con la ayuda de la regla de calibración del micrómetro del microscopio utilizando la herramienta Analizar/Establecer escala como se muestra en la Figura Suplementaria S1.
      2. Mida las longitudes una vez de una punta a la otra de la fibra y los diámetros en 2-6 lugares diferentes a lo largo de la fibra (1-2 medidas por imagen, dependiendo de su longitud), como en la Figura Suplementaria S1.
      3. Indique el valor de la longitud (μm o mm) y el promedio de todos los diámetros (μm) medidos por fibra.
  3. Estudios de expresión de cadenas pesadas de miosina
    NOTA: Para obtener detalles sobre la determinación del MHC por inmunofluorescencia43 y electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE)33,44,45,46 en músculos completos, consulte el Archivo Suplementario 1. El protocolo para la tipificación de fibras mediante la determinación por inmunofluorescencia del MHC en la suspensión de fibras aisladas con FDB es el siguiente:
    1. Cubra cada uno de los cinco portaobjetos de vidrio limpios con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~ 300 μL de la suspensión de fibra en cada portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 4 h a temperatura ambiente.
    2. Fije las preparaciones con acetona enfriada por congelación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    3. Lavar suavemente 3 veces con PBS.
    4. Permeabilizar las membranas celulares con PBS suplementado con Triton X-100 al 0,7% durante 15 min a temperatura ambiente.
    5. Lavar suavemente 3 veces con PBS suplementado con 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,04% de Triton X-100, y posteriormente bloquear con PBS con 2% de BSA, 2% de suero de cabra y 0,4% de Triton X-100 durante 30 min a temperatura ambiente.
    6. Lavar suavemente 3 veces con PBS suplementado con 0,2% de BSA y 0,04% de Triton X-100 e incubar con los anticuerpos primarios de la siguiente manera:
      1. Diluir cada anticuerpo primario anti-MHC en un vial separado en PBS con BSA al 1 % y Triton X-100 al 0,04 %: anti-I (1:1.500), anti-II (1:600), anti-IIA (utilice medios acondicionados completos del hibridoma) y anti-IIB (1:500).
      2. Incubar cada portaobjetos con un anticuerpo y el portaobjetos restante con PBS como control durante 12-16 h a 4 °C.
        NOTA: En este protocolo, las fibras tipo IIX permanecieron sin etiquetar en todas las muestras.
    7. Lavar suavemente 3 veces con PBS e incubar todos los portaobjetos con el anticuerpo secundario (1:800) acoplado a una molécula verde fluorescente durante 1-2 h a temperatura ambiente.
    8. Tiñir los núcleos con 1 μg/mL de Hoechst durante 15 min.
    9. Lave suavemente 3 veces con PBS, agregue con cuidado 20-40 μL de medio de montaje y coloque un cubreobjetos.
      NOTA: Los intercambios suaves de soluciones y el lavado aseguran que docenas de fibras permanezcan adheridas al portaobjetos, lo que hace que el experimento sea estadísticamente sólido.
    10. Visualice cada portaobjetos utilizando un objetivo de 10x adecuado para fluorescencia y un conjunto de filtros con las siguientes longitudes de onda para excitación/dicroica/emisión: 450-490/510/515 nm y cuente todas las fibras positivas y negativas. Alternativamente, adquiera imágenes de fluorescencia utilizando las mismas condiciones técnicas y una cámara de al menos 5 megapíxeles montada en un microscopio de fluorescencia invertida y guárdelas en . Formato TIFF para análisis offline.
    11. Registre las fibras positivas y negativas de cada portaobjetos en una base de datos y calcule los porcentajes de fibras positivas I, IIA, IIB y II totales en función del número total de fibras presentes en el portaobjetos correspondiente. Calcule el porcentaje de fibras IIX restando la suma de IIA+IIB del porcentaje de fibras II totales. Estimar el porcentaje de fibras híbridas I/IIA restando la suma de I+II de un valor del 100%. Por último, resta el porcentaje de células híbridas del total de I y II para tener las fibras puras de tipo I y II.
      NOTA: En los estudios de composición MHC, los tipos de fibra se designan con una letra mayúscula, mientras que las isoformas se designan con una letra minúscula46.
  4. Tinción de hematoxilina y eosina
    1. Cubra un portaobjetos de vidrio limpio con 2-3 μL de laminina y déjelo secar durante 30 s antes de verter ~300 μL de la suspensión de fibra en el portaobjetos. Deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 4 h a temperatura ambiente.
    2. Fijar la preparación con la solución de Carnoy (60% de etanol absoluto, 30% de cloroformo, 10% de ácido acético) durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Incubar con hematoxilina durante 90 s.
    4. Lavar suavemente 3 veces con agua del grifo.
    5. Incubar con eosina Y al 1% preparada en etanol al 70% durante 30 s.
    6. Lavar suavemente 3 veces con agua del grifo.
    7. Sumergir 3 veces en etanol absoluto.
    8. Incubar en xilol durante 60 s.
    9. Agregue 20-40 μL de medio de montaje y visualice con un microscopio convencional. Adquiera imágenes con el aumento deseado utilizando una cámara a color de al menos 5 megapíxeles.

5. Análisis estadísticos y gráficos

NOTA: La unidad experimental es una fibra muscular.

  1. Exprese los resultados como media ± desviación estándar y calcule intervalos de confianza del 95% (IC95%) para algunos análisis.
  2. Para comparar la longitud, el diámetro y la cinética de los transitorios de Ca2+ entre los grupos, se realizaron análisis de varianza (ANOVA) y pruebas post-hoc con la corrección de Bonferroni.
  3. Evaluar la normalidad y la igualdad de varianza utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente.
  4. Considere que las diferencias son significativas cuando p < 0,05.

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Representative Results

Concentración de Ca2+ sarcoplasmática durante una contracción
Para demostrar la viabilidad de los experimentos fisiológicos en el conjunto de fibras disociadas y ampliar nuestros hallazgos previos sobre el acoplamiento excitación-contracción (ECC) y los tipos de fibras, se adquirieron transitorios de Ca2+ en fibras de todos los músculos. En primer lugar, FDB (n = 5) y EDL (n = 7) mostraron una cinética de Ca2+ conocida como morfología tipo II (MT-II). Se trata de señales rápidas y puntiagudas, cuyo RT dura ~1 ms; su fase de decaimiento puede equiparse con una función biexponencial con el primer componente (A1) mayor que el 30% de la amplitud total, y su pico [Ca2+] está entre 15 y 30 μM33,47 (Figura 3B). Sus resultados se agrupan (n = 12) en la primera columna de la Tabla 1, mientras que los resultados de los transitorios de Ca2+ del sóleo (n = 6) se presentan en la segunda columna de la Tabla 1. Las señales del sóleo se clasificaron como morfología tipo I (MT-I, Figura 3B) -más ancha, con un RT superior a 1,2 ms, un A1 inferior al 30% y un pico [Ca2+] entre 7 y 13 μM33,47. Estas dos columnas se consideraron como referencias para comparar los transitorios de Ca2+ de los nuevos músculos. Dado que todas las fibras de PDQA (n = 4), PL (n = 6) y EHL (n = 4) compartieron el MT-II (Figura 3B), sus datos se agrupan (n = 14) en la tercera columna de la Tabla 1. Estas señales mostraron un RT promedio de ~1 ms, un A1 de ~45%, un pico [Ca2+] superior a 15 μM, y se comparan muy bien con los resultados presentados en la primera columna, pero difieren claramente de los mostrados en la segunda columna, como lo confirma el análisis estadístico (Tabla 1). La señal más rápida de toda la muestra provino de una fibra EHL, con un ΔF/F de 0,66, [Ca2+] de 16,99 μM, RT de 0,85 ms, HW de 2,42 ms y DT de 10,56 ms. τ1 y τ2 fueron de 1,63 y 7,21 ms, respectivamente, mientras que los valores de A1 y A2 fueron de 56,60% y 43,40%. La señal más lenta provino de una fibra sóleo, con un ΔF/F de 0,41, [Ca2+] de 9,76 μM, RT de 1,56 ms, HW de 9,43 ms y DT de 31,88 ms. τ1 y τ2 fueron de 2,81 y 96,42 ms, respectivamente, mientras que los valores de A1 y A2 fueron de 19,55% y 80,45%. 

Una batería de fibras cortas, intermedias y largas
La observación de claras diferencias entre las fibras según su fuente muscular permitió una caracterización morfométrica más completa. Los histogramas de la Figura 4 muestran variaciones sorprendentes en las longitudes de las fibras en todos los músculos. Esto se pone de manifiesto al comparar la fibra más corta de FDB (227,06 μm) con la más larga de sóleo (5,69 mm). Los valores medios de longitud se resumen en la Tabla 2. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p < 0,01). Estos resultados permiten clasificar las fibras FDB como cortas (<1 mm); PDQA y PL como intermedios (1 a 3 mm); y EDL, EHL y sóleo de hasta cierto punto de longitud (>3 mm) (Figura suplementaria S2).

Por el contrario, se observaron pequeñas diferencias en los diámetros medios de las fibras de todos los músculos (Tabla 2) y en la distribución de los valores (Figura 4). Aun así, hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p < 0,01). Cuando se evaluó en detalle, hubo diferencias entre la BDF y el músculo de los demás y entre la BDF (BDF 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) y el conjunto de fibras intermedias y largas (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). La célula más delgada de toda la muestra midió 18,42 μm (FDB) y la más gruesa alcanzó 82,79 μm (PDQA).

Tipos de fibra utilizados en experimentos fisiológicos
En primer lugar, se determinaron los tipos de fibras presentes en cada músculo completo mediante inmunofluorescencia. A excepción del sóleo, los músculos mostraron un predominio de más del 76% de fibras tipo II (Figura suplementaria S3, Tabla 3 y Tabla 4). EHL, PL y PDQA son músculos particularmente rápidos, con más del 90% de fibras rápidas y hasta un 58,8% de fibras tipo IIB, como se encuentra en PDQA. EHL y PDQA estaban prácticamente desprovistos de fibras tipo I. Las fibras híbridas I/IIA estuvieron presentes en todos los músculos en porcentajes bajos. Como era de esperar, las fibras tipo I y IIA representaron más del 82% del total de fibras del sóleo. Este músculo está casi desprovisto de las fibras IIB más rápidas. De acuerdo con el perfil de tipos de fibra, el sóleo es el más lento y el PDQA es el músculo más rápido de los seis analizados.

A partir de entonces, y debido a que es más relevante para los experimentos fisiológicos de una sola fibra, se abordó la cuestión de qué tipos de fibras aparecen en la suspensión celular derivada de la FDB disociada. Se encontró que el perfil de fibras en la suspensión celular refleja la composición de las fibras presentes en las criosecciones: tres de cada cuatro fibras disociadas eran de tipo II (Figura 5 y Tabla 3).

Finalmente, se confirmó la composición de los músculos mediante la separación de sus isoformas MHC a través de SDS-PAGE. Los resultados fueron consistentes con el patrón general observado en los ensayos de inmunofluorescencia. El sóleo se enriqueció en MHC IIa e I, mientras que el EDL, el EHL y el peronei se enriquecieron en MHC IIx y IIb, pero carecieron de I (Figura suplementaria S4).

Figure 1
Figura 1: Diseño del estudio. (A) Equipos y soluciones que deben configurarse antes de iniciar el procedimiento de disección. 1. Estereoscopio número uno. 2. De abajo hacia arriba: un juego de cinco pipetas pulidas al fuego, herramientas de disección y viales de colagenasa dentro de una nevera portátil (estuche amarillo). 3. Caja de filtro, cámara de disección, viales de vidrio etiquetados con tapa, rejilla con soluciones filtradas. 4. Herramientas de disección. 5. Estereoscopio con cámara de disección número dos acoplado a una cámara y un estimulador eléctrico. (B) El procedimiento de disección del conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de los ratones, como se explica con más detalle en la Figura 2. (C) Después de la disección, se debe verificar la contracción y la integridad muscular antes de continuar con el siguiente paso del protocolo. El músculo izquierdo en el panel izquierdo muestra un músculo PL ondulado, hipercontraído y que no responde (flecha azul), que no debe usarse para obtener fibras disociadas. En su lugar, el protocolo de disección debe optimizarse y comenzar de nuevo. La contraparte PL bien diseccionada (músculo derecho en el panel izquierdo) muestra una apariencia alargada y se contrae visiblemente (Video Suplementario S1). El panel de la derecha muestra dos músculos EDL (flecha azul) y dos FDB dentro de la solución de colagenasa con la apariencia correcta y recta. (D) Una vez disociados los músculos, verter las fibras aisladas en la cámara experimental y comprobar su contracción e integridad. En el panel izquierdo, fibras PL vivas (flecha azul) y muertas. En el panel derecho, fibras EDL vivas (flecha azul) y muertas. (E-G) Se realizaron tres conjuntos de experimentos con las fibras aisladas: (E) Mediciones de la concentración de Ca2+ sarcoplasmática durante una contracción (resultados en la Figura 3). (F) Análisis morfométricos (resultados presentados en la Figura 4). Este ejemplo muestra una fibra PL. (G) Inmunofluorescencia para estudios de expresión de cadenas pesadas de miosina (resultados ilustrados en la Figura 5). En este ejemplo se muestra una fibra FDB aislada. Barras de escala = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Referencias anatómicas y procedimiento general para diseccionar el conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. Las filas, de arriba a abajo, presentan los músculos según el mejor orden de disección: FDB, sóleo, EDL, EHL, PL y PDQA. Las columnas, de izquierda a derecha, presentan los hitos durante la disección. La primera columna muestra los músculos o sus tendones distales expuestos para que pueda comenzar la disección. Por ejemplo, las flechas azules apuntan a la FDB y al sóleo in situ y a los tendones distales de la EDL. Las siguientes dos columnas ilustran la disección en sí y los músculos expuestos después de que se cortan los tendones distales, como se indica, por ejemplo, con la flecha azul en la fila EDL. Se recomienda eliminar la rama del FDB dirigida al quinto dígito. La columna más a la derecha presenta los músculos una vez retirados por completo, con los tendones proximales orientados a la parte superior de las imágenes. Las líneas discontinuas azules (columna del extremo derecho) ilustran los cortes longitudinales o diagonales que deben realizarse en los músculos sóleo y EDL para garantizar que la colagenasa entre en su volumen. Barras de escala = 5 mm. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo; PDQA = peroneus digiti quarti. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Transitorios de Ca2+ registrados en fibras obtenidas de un conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. (A) Configuración utilizada para la adquisición de transitorios de Ca2+ bajo iluminación atenuada. Panel izquierdo: 1. PMT conectado a un microscopio de fluorescencia invertida (2). 3. Cámara acoplada al microscopio. 4. Estimulador eléctrico acoplado a la cámara experimental. 5. El sistema de micromanipulación se puede utilizar cuando se planifican ensayos de electrofisiología e inyección para complementar la adquisición de transitorios de Ca2+ . Panel central: la cámara experimental (inserto) con las células cargadas se monta en la platina del microscopio y se ilumina con luz azul (450-490 nm, flecha azul) para excitar el colorante. En esta configuración, los elementos 1 a 5 se colocan sobre una mesa antivibratoria y dentro de una jaula de Faraday. Panel derecho: Una vez verificada la calidad de la contracción y la carga de colorante con la cámara (6), la luz emitida se dirige al PMT, se inicia la estimulación eléctrica y se alimenta la señal al digitalizador (7) y al software de adquisición (8) para registrar el transitorio de Ca2+ . La función integrada de estos elementos durante un experimento en vivo se puede ver en el Video Suplementario S6. (B) Transitorios representativos y calibrados de Ca2+ de FDB, PDQA, PL, EDL, EHL y fibras de sóleo de ratón. Las señales similares, rápidas y estrechas de FDB, PDQA, PL, EDL y EHL confirman que ya se sabe que tienen MT-II que deriva de las fibras IIX y IIB, que son las más abundantes en estos músculos. Por el contrario, el transitorio del sóleo es más lento y más pequeño, típico de MT-I, descrito originalmente en las fibras I y IIA. La curva roja sobre las señales EDL y sóleo demuestra que la fase de decaimiento de MT-I y MT-II puede equiparse con una función de decaimiento biexponencial. Las barras de calibración se aplican a todos los paneles. Barra vertical = 2,5 μM de [Ca2+], barra horizontal = 10 ms. La clave de color en la parte inferior ayuda a identificar los músculos. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo; PMT = tubo fotomultiplicador; MT-I = morfología tipo I; MT-II = morfología tipo II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Medidas morfométricas de las fibras cortas, intermedias y largas obtenidas por disociación enzimática del conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores del ratón. Las fibras intactas, sanas y representativas de cada músculo se representan en los paneles de la columna más a la izquierda. Las imágenes se editaron solo para reducir el ruido de fondo y mejorar el contraste, sin manipulación directa de las fibras musculares. Barras de escala = 100 μm (todos los paneles). El protocolo de medición, así como la apariencia y calidad de las fibras largas completas, se pueden ver con más detalle en la Figura Suplementaria S1. La columna central muestra las distribuciones de longitudes, ordenadas desde el músculo que produjo las fibras más cortas (FDB), hasta el que tiene las fibras más largas (sóleo). Hay un continuo de longitudes, por lo que hay cierta superposición entre los músculos, que abarca un total de ~ 5,5 mm. Las distribuciones de diámetro se presentan en los paneles de columnas situados más a la derecha. La mayoría de las fibras miden entre 30 y 60 μm, con pequeñas diferencias entre los músculos. Los análisis test-retest (n = 78 fibras, equivalente al 9,85% de toda la muestra de n = 792) de las medidas morfométricas mostraron una reproducibilidad muy alta (coeficiente medio de variación de 1,77%─intervalo de confianza 95%, IC95%, 1,26-2,27%─coeficiente medio de correlación de 0,99 (IC95% 0,98-0,99)), destacando la buena fiabilidad de los resultados. Las curvas de distribución gaussianas se agregaron con software de graficación con licencia. La Figura Suplementaria S2 muestra gráficos de barras de los valores medios de longitud y diámetro y las fusiones de las distribuciones de longitud y diámetro de todos los músculos para facilitar la comparación. La clave de color en la parte inferior ayuda a identificar los músculos. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL, = extensor largo del dedo gordo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensayos de inmunofluorescencia para tipos de fibras en la suspensión celular en músculos FDB disociados. Las imágenes de diferentes campos muestran fibras FDB intactas y disociadas adheridas a la parte inferior de los portaobjetos. (A) Una fibra positiva para antimiosina II (fluorescencia verde, flecha diagonal azul claro) contrasta claramente con una negativa (punta de flecha azul claro), lo que demuestra el poder de discriminación del ensayo. La presencia de ambas fibras en la imagen se puede confirmar debido al marcaje de los núcleos (fluorescencia azul). (B) Un campo diferente muestra otra fibra antimiosina II positiva. (C) La correcta identificación de la cadena pesada de miosina en las bandas A (fluorescencia verde) por los anticuerpos se confirmó mediante microscopía confocal. Las estrías negras transversales más notorias corresponden a las bandas I, enriquecidas en actina, por lo que se espera que no sean reconocidas por los anticuerpos. (D) La hematoxilina marca en púrpura los núcleos periféricos y abundantes típicos, y la eosina marca el sarcoplasma de la fibra, mostrando una célula intacta y madura. Barras de escala = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Abreviatura: FDB = flexor corto de los dedos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fibras FDB y EDL Sóleo PDQA, PL y EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0.68±0.15 0,46±0,06*,† 0.66±0.12 <0.01
[Ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0.01
RT (ms) 0.95±0.10 1,26±0,20*,† 0.95±0.09 <0.01
Pendiente de subida (F/ms) 5,97±1,41 3,12±0,79*,† 5.83±0.97 <0.01
HW (ms) 3.59±0.85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0.01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0.01
Pendiente de decaimiento (F/ms) -0,24±0,07 -0,10±0,03*,† -0,35±0,08* <0.01
τ1 (ms) 1.86±0.37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0.05
τ2 (ms) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0.01
A1 (%) 48.14±7.27 25,94±8,98*,† 44.59±8.29 <0.01
A2 (%) 51.86±7.27 74,06±8,98*,† 55.41±8.29 <0.01
Morfología MT-II MT-I MT-II

Tabla 1: Cinética de transitorios de Ca2+ en fibras disociadas enzimáticamente obtenidas de un conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. Los valores son la media ± la desviación estándar. p corresponden a la prueba de Análisis de varianza. *Significativamente diferente de los grupos FDB y EDL. †Significativamente diferente de los grupos PDQA, PL y EHL. Abreviaturas: F = fluorescencia; [Ca2+] = concentración máxima citosólica de Ca2+ ; RT = tiempo de subida; HW = duración a la mitad del máximo; DT = tiempo de decaimiento; τ1 y τ2 = constantes de tiempo de decaimiento; A1 y A2 = amplitudes de decaimiento; FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo; MT-I = morfología tipo I; MT-II = morfología tipo II.

Fibras FDB PDQA PL EDL EHL Sóleo p
n 370 142 80 70 87 43
Longitud (mm) 0,42±0,05* 2.20±0.26** 2.69±0.26† 3.51±0.53†† 3.83±0.44‡ 4.62±0.64 <0.01
Diámetro (μm) 38,40±9,40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0.01

Tabla 2: Medidas morfométricas de las fibras cortas, intermedias y largas obtenidas por disociación enzimática del conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. Los valores son la media ± la desviación estándar. p corresponden a la prueba de Análisis de varianza. *Estadísticamente diferente de PDQA, PL, EDL, EHL y sóleo. **Significativamente diferente de PL, EDL, EHL y sóleo. †Significativamente diferente de EDL, EHL y sóleo. ††Significativamente diferente de EHL y sóleo. ‡Significativamente diferente del sóleo. Significativamente diferente de EHL. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo.

Músculos/Fibras N n Total tipo I + I/IIA (%) Total tipo II (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

Tabla 3: Tipos de fibras en criosecciones y en la suspensión celular en músculos FDB disociados de ratón. Los valores son la media ± la desviación estándar. N se refiere al número de animales, mientras que n se refiere al número total de fibras analizadas en los experimentos. La fila FDB presenta datos de todo el músculo según lo determinado en criosecciones, mientras que la fila *FDB corresponde a fibras aisladas en la suspensión celular después de disociar el músculo. La columna "Total tipo II" refleja las fibras puras tipo IIA, IIX y IIB. Abreviatura: FDB = flexor corto de los dedos.

Músculo N n Tipo I (%) Tipo I/IIA (%) Tipo IIA (%) Tipo IIX (%) Tipo IIB (%) Total tipo II (%)
PDQA 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35,85±5,66 35.66±9.36 94.52±3.90
EDL 4 826 0.00±0.00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89.56±8.33
EHL 5 618 0.24±0.76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
Sóleo 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

Tabla 4: Tipos de fibras en criosecciones de los músculos que dan fibras intermedias y largas de ratón. Los valores son la media ± la desviación estándar. N se refiere al número de animales, mientras que n se refiere al número total de fibras analizadas en los experimentos. Todas las filas presentan datos de todo el músculo según lo determinado en criosecciones. Las columnas de tipo I, IIA, IIIX y IIB reflejan fibras puras, mientras que la columna I/IIA se refiere a fibras híbridas. La columna "Total tipo II" es la suma de las columnas de tipo IIA, IIX y IIB. Abreviaturas: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo.

Archivo suplementario 1: Estudios de expresión de cadenas pesadas de miosina en músculos completos. Los protocolos presentan detalles para la determinación de isoformas de cadena pesada de miosina por inmunofluorescencia en criosecciones y por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida en homogeneizados de músculos enteros. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1: Detalles de la morfología de las fibras obtenidas por disociación enzimática del conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. (A) A la izquierda se muestra la regla de calibración del micrómetro del microscopio abierta para establecer la escala en el software de análisis de imágenes. El panel derecho muestra cómo se midió repetidamente el diámetro como lo indican las líneas azules perpendiculares al eje largo de la fibra (flechas azules), mientras que la longitud se midió una vez de punta a punta, como lo ilustra la línea azul a lo largo del eje mayor de la fibra. (B) Se ensamblaron varias imágenes con una edición menor para demostrar la apariencia larga y saludable de PDQA, PL, EDL, EHL y fibras de sóleo (pequeñas inserciones azules, verdes, amarillas, naranjas y rosas). Las imágenes ensambladas se editaron aún más para dar a las fibras un mejor aspecto (imágenes grandes, en blanco y negro). (C) Imágenes DIC de fibras FDB, PDQA, PL y sóleo que resaltan la irregularidad normal de su punta y sus conocidas estrías transversales. La apariencia DIC de las fibras EDL y EHL restantes se puede ver en el Video Suplementario S3 y en el Video Suplementario S4. Barras de escala = 100 μm. La clave de color en la parte inferior ayuda a identificar los músculos. Abreviaturas: FDB, flexor corto de los dedos; PDQA, peroneus digiti quarti; PL: peroneo largo; EDL: extensor largo de los dedos; EHL: extensor largo del dedo gordo; DIC = Contraste de interferencia diferencial. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Gráficos de barras y distribuciones combinadas de longitud y diámetro de las fibras obtenidas por disociación enzimática del conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores del ratón. (A) Los diagramas de barras (media ± desviaciones estándar) y (B) los histogramas combinados confirman la disparidad de las longitudes, pero la similitud de los diámetros en todos los grupos. *Significativamente diferente de PDQA, PL, EDL, EHL y sóleo. **Significativamente diferente de PL, EDL, EHL y sóleo. †Significativamente diferente de EDL, EHL y sóleo. ††Significativamente diferente de EHL y sóleo. ‡Significativamente diferente del sóleo. Significativamente diferente de EHL. La clave de color en la parte inferior ayuda a identificar los músculos. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Estudios de inmunofluorescencia para la composición del tipo de fibra del conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. Las criosecciones representativas marcadas con anticuerpos utilizadas para los análisis demuestran la buena calidad e integridad de las muestras. Existe un claro predominio de la fibra tipo II en todos los músculos, excepto en el sóleo en el que la cantidad de fibra tipo I es considerable. Barras de escala = 100 μm. La clave de color en la parte inferior ayuda a identificar los músculos. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S4: Separación electroforética de las isoformas MHC en el conjunto de seis músculos de las extremidades posteriores de ratón. (A) Dos geles completos representativos ejecutados en diferentes días con diferentes muestras demuestran la calidad, limpieza y reproducibilidad de la distancia de separación y migración de las isoformas MHC cuando se tiñen con azul de Coomassie. Aunque estas dos imágenes fueron ligeramente editadas para mejorar el contraste y la claridad para el lector, los análisis se realizaron en geles sin editar. (B) Ejemplos de los análisis de las bandas para cada uno de los seis músculos. Después de seleccionar un ROI en los carriles del gel, se genera un perfil de gráfico y se utiliza un ajuste gaussiano para estimar la proporción de isoformas MHC en el conjunto de seis músculos. La composición del MHC encontrada fue: FDB: I 9.0 ± 5.0%, IIa + IIx 91.0 ± 5.0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4%, IIb 74,1 ± 2,4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2%, IIb 75,1 ± 2,2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3%, IIb 78,0 ± 2,3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0%, IIb 72,5 ± 1,0% (n = 3); sóleo: I 35,8 ± 2,5%, IIa (+IIx + IIb cuando está presente) 64,2 ± 2,5% (n = 4). La clave de color en la parte inferior ayuda a identificar los músculos. El rectángulo gris debajo del gel más a la derecha en A se refiere al marcador de peso molecular que indica la migración del IIa a ~ 200 KDa. Abreviaturas: FDB = flexor corto de los dedos; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneo largo; EDL = extensor largo de los dedos; EHL = extensor largo del dedo gordo; MHC = cadena pesada de miosina; ROI = región de interés. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario S1: El peroneo largo dañado y ondulado (PL, izquierda) no se contrae con la estimulación, mientras que el PL intacto (derecha) se contrae bien, incluso cuando está más lejos de los electrodos. Aumento de 0,8x. El protocolo de estimulación libera pulsos de corriente rectangulares de 1,2 ms, 0,7 Hz y 50 V a través de dos electrodos. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario S2: Contracción de la fibra del peroneo largo. Aumento de 20x. Modo de contraste de interferencia diferencial. El protocolo de estimulación libera pulsos de corriente rectangulares de 1,2 ms, 0,5 Hz y 50 V a través de dos electrodos de platino. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario S3: Contracción de la fibra extensora larga de los dedos. Aumento de 20x. Modo de contraste de interferencia diferencial. El protocolo de estimulación libera pulsos de corriente rectangulares de 1,2 ms, 0,5 Hz y 50 V a través de dos electrodos de platino. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario S4: Contracción de la fibra extensora larga del dedo gordo. Aumento de 20x. Modo de contraste de interferencia diferencial. El protocolo de estimulación libera pulsos de corriente rectangulares de 1,2 ms, 0,5 Hz y 50 V a través de dos electrodos de platino. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario S5. Contratación de la fibra del sóleo. Aumento de 20x. Modo de contraste de interferencia diferencial. El protocolo de estimulación libera pulsos de corriente rectangulares de 1,2 ms, 0,5 Hz y 50 V, a través de dos electrodos de platino. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario S6: Grabación en directo de un transitorio de Ca2+ procedente de una fibra extensora larga de los dedos cargada con Mag-Fluo-4, AM, como se describe en el paso 4.1.4. El protocolo de estimulación libera pulsos de corriente rectangulares de 1,2 ms, 0,5 Hz y 50 V a través de dos electrodos de platino. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Para complementar los modelos disponibles para estudiar la biología del músculo esquelético maduro, aquí demostramos la disociación enzimática exitosa de una variedad de músculos de ratón con fibras cortas, intermedias y largas. Estas fibras permiten la demostración de la generalización de la cinética MT-II de los transitorios de Ca2+ en el músculo esquelético. Además, se clasificaron los tipos de fibras en los músculos enteros intactos. Dado que el FDB es el músculo más utilizado para experimentos fisiológicos, se evaluaron los tipos de fibras presentes en la suspensión celular después de la disociación.

Una batería de fibras intactas cortas, intermedias y largas para estudios de biología muscular
La técnica de disección, la duración del tratamiento enzimático, el tipo de enzima utilizada y el procedimiento de trituración son pasos críticos dentro del protocolo para obtener fibras intactas disociadas enzimáticamente. La disección debe realizarse lo más rápido posible para reducir el tiempo bajo hipoxia y evitar estiramientos innecesarios. Este último punto es particularmente relevante para el sóleo, que no debe eliminarse tirando hacia arriba del complejo gastrocnemio-sóleo. Además, un tratamiento enzimático extenso (~3 h)20,48 y procedimientos de trituración deficientes (por ejemplo, duros, poca experiencia del investigador) dañan las células, como se ha confirmado empíricamente en varios laboratorios. La colagenasa tipo 2 se recomienda sobre otros tipos de colagenasa. Debe evitarse la formación de burbujas durante la trituración y los músculos o las fibras deben manipularse solo con pipetas de vidrio en lugar de puntas de pipeta de plástico. Se prefiere el uso de viales de vidrio durante todo el procedimiento en lugar de viales cónicos de plástico, ya que los primeros dan más visibilidad, se pueden colocar hacia arriba en el estereoscopio para una observación de vista superior del músculo cuando están en las soluciones, dan más espacio para la trituración de los músculos más largos y voluminosos que el FDB, y son resistentes a los arañazos causados por las pipetas Pasteur de vidrio. Dado que la edad, el peso y la condición metabólica (p. ej., obesidad saludable vs. obesidad alta en grasas) afectan la eficiencia del método, varios parámetros podrían necesitar optimización cuando se trabaja con animales fuera del rango utilizado en este manuscrito. Es importante destacar que una exposición leve de un músculo a ciertas enzimas como las utilizadas aquí y un correcto procedimiento de disociación no afectan funcionalmente a las fibras, como lo demuestran las evidencias recogidas durante décadas por múltiples grupos, algunas de las cuales se resumieron hace unos años49. Esto se ve respaldado por el hecho de que el pico [Ca2+] medido con colorantes rápidos de Ca2+ durante una contracción obtenida en haces disecados manualmente y fibras disociadas enzimáticamente de ratones puede considerarse comparable (revisado en 47).

Aunque existen otros modelos para estudios de biología muscular, como los miotubos C2C12, las líneas celulares de mioblastos humanos normales y mutados, o las fibras derivadas de células madre pluripotentes (iPSC) 31,39,50,51,52,53, son inmaduros y no se discuten aquí. Las fibras permeabilizadas o peladas también son modelos informativos y bien caracterizados54,55, pero no están intactos. El modelo de fibras aisladas manualmente ofrece varias ventajas, como se presenta en otro lugar20, pero tiene una baja eficiencia y requiere un alto entrenamiento. Estos hechos ponen de manifiesto que el modelo de interés aquí -fibras obtenidas por disociación enzimática- ofrece la posibilidad de obtener fibras musculares esqueléticas intactas, abundantes y maduras de diferentes tipos. Sin embargo, una limitación del modelo es que la falta de tendones limita la evaluación directa de las propiedades contráctiles en las fibras aisladas.

Dado que la longitud de las fibras no es la misma que la longitud de los músculos14,42 y que las fibras son la unidad de experimentación, es más relevante clasificar la longitud de las fibras, no de los músculos. Dados nuestros resultados y sus potenciales implicaciones experimentales, las fibras FDB se pueden clasificar en cortas (<1 mm); PDQA y PL como intermedios (1 a 3 mm); y EDL, EHL y sóleo tan largos (>3 mm). Las fibras cortas son las más fáciles y abundantes de obtener (~400-500 fibras por ratón) y son adecuadas para experimentos de microscopía de fluorescencia en los que la unión de la fibra a la cámara inferior es clave, o cuando se deben evitar los artefactos de movimiento (por ejemplo, transitorios de Ca2+). Las fibras largas son las más difíciles de obtener, tienen la menor representación y son mejores para la expresión de proteínas mediante técnicas de separación o estudios de biología molecular de una sola célula. Las fibras intermedias se pueden obtener en una buena cantidad (~50 fibras por ratón) después de un entrenamiento moderado y son adecuadas para muchos enfoques experimentales, como se muestra, por ejemplo, con los experimentos de transitorios de Ca2+. Reconociendo que FDB, EDL y sóleo se han utilizado antes, este es el primer trabajo que aísla con éxito las fibras de los músculos PDQA, PL y EHL, aumentando así la disponibilidad de modelos para estudios de músculo esquelético maduro. Además, la obtención de fibras de diferentes músculos asegura que se obtenga más información del mismo animal, reduciendo la variabilidad experimental, aumentando el poder estadístico y la solidez biológica de las conclusiones, y reduciendo el número de animales utilizados en la experimentación.

Generalización de la cinética de transitorios de Ca2+
Al analizar la cinética de los transitorios de Ca2+ en fibras musculares esqueléticas maduras de mamíferos, hemos demostrado previamente que las fibras tipo I y IIA comparten la denominada morfología tipo I (MT-I), mientras que las fibras IIX y IIB comparten la morfología MT-II. Típicamente, las señales MT-II tienen un RT de menos de 1,2 ms, DT de menos de 25 ms, A1 superior al 30%, [Ca2+] superior a 15 μM, y se encuentran fácilmente en las fibras FDB y EDL33,47. Después de comparar los resultados de los nuevos transitorios de Ca2+ de PDQA, PL y EHL con los que se encuentran aquí y los publicados previamente para FDB y EDL, es sencillo concluir que todos ellos también son MT-II. Otra observación interesante es que el aumento de la disponibilidad de nuevos músculos enriquecidos en fibras tipo IIX y IIB como modelos para obtener fibras disociadas permite confirmar que la cinética de los transitorios de Ca2+ puede generalizarse: las fibras tipo IIX y IIB tienen el MT-II independientemente de su fuente (es decir, flexores (FDB), extensores (EDL y EHL), o peronei (PDQA y PL)). Esto refuerza la idea de un programa celular génico establecido o perfil de la maquinaria de la ECC, que es bastante similar dentro de todas las fibras del mismo tipo, y que las diferencias en la maquinaria molecular (es decir, isoformas y cantidad de proteínas) que subyacen a la generación de transitorios de Ca2+ explican las diferencias en las morfologías reportadas entre las fibras33. Por último, una implicación práctica es que al registrar con Mag-Fluo-4 el transitorio de Ca2+ de una fibra, es posible conocer de forma fiable su tipo.

Expresión de MHC en músculos y fibras aisladas: implicaciones para los tipos de fibras utilizadas en experimentos fisiológicos
Conocer el tipo de fibra aumenta la fiabilidad de la investigación muscular. Por ejemplo, en ratones knockout de cualquier proteína expresada diferencialmente según los tipos de fibra, el uso de fibras de la FDB sin ninguna tipificación puede dar lugar a resultados engañosos. Nuestros datos confirman que el FDB es un músculo mixto con predominio de fibras tipo IIX, de acuerdo con trabajos previos 25,31,56. Más importante aún, hubo una alta concordancia entre la proporción de tipos de fibra presentes en todo el músculo y la obtenida después de la disociación. Dado que esta información es novedosa y no suele discutirse en los artículos que utilizan fibras FDB, se puede especular que, por casualidad, muchos de los resultados obtenidos en fibras FDB disociadas pueden reflejar realmente información mixta de ~20-25% procedente de fibras de tipo I y 75-80% de tipo II. Los estudios futuros que utilicen músculo FDB deben presentar datos y su correspondiente discusión, en relación con los tipos de fibra.

Dado que el sóleo está altamente enriquecido en fibras oxidativas de tipo I, IIA e I/IIA 57,58,59, estas son las fibras que se encuentran en la suspensión después de la disociación33. El EDL, otro músculo bien conocido, está casi desprovisto de fibras de tipoI 57,58,59, por lo que solo produce fibras rápidas después de la disociación33. Siguiendo la misma lógica y de acuerdo con los resultados de tipificación que muestran el enriquecimiento de las fibras de tipo II en los tres nuevos músculos, respaldados además por el hecho de que las pocas fibras de tipo I que se encuentran en los músculos peroneos del ratón soncentrales 60 y no se espera que se alcancen durante una disociación leve, planteamos la hipótesis de que la probabilidad de emplear una fibra IIX o IIB rápida en un experimento con fibras disociadas de PDQA, PL o EHL puede ser tan alto como 80-90%. Esto parece ser cierto de acuerdo con los datos de los transitorios de Ca2+ en los que no se encontraron señales MT-I. Dado su tamaño, estas fibras ofrecen la ventaja de ser adecuadas para tipificar después de terminar un experimento funcional. Además, la especificidad de BTS para MHC II ayuda a discriminar entre los tipos de fibra al tiempo que elimina los artefactos de movimiento. Finalmente, si bien este método de tipificación de fibras fue más laborioso que los optimizados recientemente descritos61,62, no afectó los resultados del presente trabajo.

Conclusiones
Los detalles metodológicos presentados pueden fomentar el uso de una variedad de fibras musculares disociadas enzimáticamente en el estudio de la biología muscular. La versatilidad del modelo está respaldada por la posibilidad de obtener fibras dentro de una amplia gama de longitudes y tipos y su uso en varias aplicaciones experimentales. Además de FDB, EDL y sóleo cuya disociación fue reportada hace años, demostramos la factibilidad de obtener fibras intermedias y largas de otros músculos como PDQA, PL y EHL. Dada la facilidad con la que se puede realizar la disección y el número de fibras que se pueden obtener, así como la homogeneidad y tamaño de las fibras, proponemos la PL como un modelo rutinario y adecuado para estudios de músculo esquelético maduro. Esto está respaldado por nuestros hallazgos de que la cinética de los transitorios de Ca2+ en el músculo esquelético se puede generalizar independientemente de su origen.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores expresan su agradecimiento al profesor Robinson Ramírez de la UdeA por su ayuda con los animales y algunas fotos y a Carolina Palacios por su apoyo técnico. Johan Pineda de Kaika nos ayudó a configurar las cámaras de color y fluorescencia. Shyuan Ngo, de la Universidad de Queensland, tuvo la amabilidad de revisar el manuscrito. Este estudio fue financiado por el CODI-UdeA (2020-34909 del 22 de febrero de 2021 y 2021-40170 del 31 de marzo de 2022, SIU), y la Oficina de Planeación-UdeA (E01708-K y ES03180101), Medellín, Colombia, a JCC. Los financiadores no participaron en la recopilación y el análisis de datos, ni en la redacción ni en la presentación de manuscritos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

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Biología Número 202 músculo esquelético fibras musculares tipos de fibras Ca2+ acoplamiento excitación-contracción inmunofluorescencia cadena pesada de miosina
Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos
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Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

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