Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

Skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van muizenspieren zijn een bruikbaar model voor fysiologische experimenten. De meeste artikelen gaan echter over de korte vezels van de flexor digitorum brevis (FDB), die de reikwijdte van de resultaten met betrekking tot vezeltypes beperkt, de hoeveelheid beschikbaar biologisch materiaal beperkt en een duidelijk verband belemmert tussen cellulaire fysiologische verschijnselen en eerdere biochemische en dynamische kennis die in andere spieren is verkregen.

Dit artikel beschrijft hoe intacte vezels kunnen worden verkregen uit zes spieren met verschillende vezeltypeprofielen en lengtes. Met behulp van C57BL/6 volwassen muizen tonen we het protocol voor spierdissectie en vezelisolatie en demonstreren we de geschiktheid van de vezels voor Ca2+ transiënte studies en hun morfometrische karakterisering. De vezeltypesamenstelling van de spieren wordt ook gepresenteerd. Wanneer ze gedissocieerd zijn, worden alle spieren intact, levende vezels die langer dan 24 uur stevig samentrekken. FDB gaf korte (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) en peroneus longus (PL) gaven intermediair (1-3 mm), terwijl extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL) en soleus-spieren lange (3-6 mm) vezels vrijgaven.

Bij opname met de snelle kleurstof Mag-Fluo-4 vertoonden Ca2+ transiënten van PDQA-, PL- en EHL-vezels de snelle, smalle kinetiek die doet denken aan de morfologie type II (MT-II), waarvan bekend is dat deze overeenkomt met type IIX- en IIB-vezels. Dit komt overeen met het feit dat deze spieren meer dan 90% van type II-vezels bevatten in vergelijking met FDB (~80%) en soleus (~65%). Als we verder gaan dan FDB, demonstreren we voor het eerst de dissociatie van verschillende spieren, waardoor vezels ontstaan die een bereik van lengtes tussen 1 en 6 mm overspannen. Deze vezels zijn levensvatbaar en geven snelle Ca2+ transiënten, wat aangeeft dat de MT-II kan worden gegeneraliseerd naar IIX en IIB snelle vezels, ongeacht hun spierbron. Deze resultaten vergroten de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies.

Introduction

De volwassen skeletspier van zoogdieren is een multifunctioneel weefsel. Het reguleert sterk het metabolisme, is de belangrijkste bron van warmteproductie en zijn dynamische eigenschappen geven het een sleutelrol bij de ademhaling, beweging van lichaamssegmenten of verplaatsing van het ene punt naar het andere 1,2,3. Skeletspieren zijn ook relevant voor de pathofysiologie van veel ziekten, waaronder erfelijke en chronische aandoeningen, zoals myopathieën, dystrofieën of sarcopenie, evenals veel niet-spierchronische aandoeningen, zoals cardiometabole ziekten 3,4,5,6,7,8.

De ex vivo studie van de structurele en functionele eigenschappen van rijpe skeletspieren in de context van gezondheid en ziekte is voornamelijk mogelijk geweest door middel van twee experimentele modellen: hele spieren en geïsoleerde vezels. In de 20eeeuw maakten onderzoekers gebruik van de eigenschappen van de hele, intacte extensor digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior en gastrocnemius-spieren van verschillende kleine soorten als cruciale modellen om meer te weten te komen over motoreenheden, vezeltypen en dynamische eigenschappen zoals kracht en kinetiek van samentrekking en ontspanning 9,10,11,12,13,14,15,16. De komst van meer verfijnde celbiologische studies verplaatste het gebied echter in de richting van de studie van enkele spiervezels. Baanbrekend werk maakte vervolgens de isolatie mogelijk van intacte flexor digitorum brevis (FDB) vezels van ratten door enzymatische dissociatie voor latere karakterisering 17,18,19. Hoewel FDB-vezels ook kunnen worden verkregen door handmatige dissectie20, hebben het gemak en de hoge doorvoer van enzymatische dissociatie van muizenspieren, naast hun geschiktheid voor een verscheidenheid aan experimentele benaderingen, ervoor gezorgd dat het laatste model de afgelopen twee decennia op grote schaal is gebruikt.

De korte FDB-vezels zijn geschikt voor elektrofysiologische en andere biofysische studies, biochemische, metabole en farmacologische analyses, elektronen- en fluorescentiemicroscopie-experimenten, transfectie voor celbiologische benaderingen, of als bron van stamcellen in myogenesestudies 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Het gebruik van alleen FDB-vezels in spierexperimenten verkleint echter de reikwijdte van onderzoek naar vezelsoorten en beperkt de hoeveelheid biologisch materiaal die beschikbaar is voor sommige methodologische technieken of voor het verkrijgen van meer informatie van één dier. Deze beperkingen belemmeren een duidelijke correlatie van cellulaire fysiologische verschijnselen met eerdere biochemische en dynamische studies die zijn uitgevoerd in verschillende hele, intacte spieren (bijv. EDL, soleus, peronei).

Door deze beperkingen te overwinnen, slaagden sommige groepen erin om de langere EDL- en soleusspieren 24,33,34,35,36,37,38,39,40 te dissociëren, waardoor de deur werd geopend om de methode verder uit te breiden naar andere relevante spieren. Het gebruik van EDL- en soleusvezels is echter nog steeds schaars, waarschijnlijk vanwege het gebrek aan methodologische details om ze als intacte vezels te krijgen. Hier beschrijven we in detail hoe je vezels van verschillende lengtes en typen kunt isoleren uit zes spieren: drie daarvan zijn al beschreven (FDB, EDL en soleus) en drie daarvan zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus [EHL], peroneus longus [PL] en peroneus digiti quarti [PDQA]). De resultaten van het huidige werk bevestigen dat het model van enzymatisch gedissocieerde vezels geschikt is voor een breed scala aan studies en toekomstige correlaties met eerder gepubliceerde gegevens, waardoor de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies toeneemt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor Ethiek in Dierproeven van de Universiteit van Antioquia (UdeA) (notulen 104 van 21 juni 2016 en 005 van 15 april 2021), volgens wet 84 van 1989 en resolutie 8430 van 1993 uitgevaardigd door de Colombiaanse regering en werden uitgevoerd en gerapporteerd in overeenstemming met het dieronderzoek: Richtlijnen voor het rapporteren van in-vivo-experimenten (ARRIVE)41. Alle hier gepresenteerde resultaten zijn afkomstig van gezonde, 7-13 weken oude, 20-26 g, C57BL/6 mannelijke muizen. Figuur 1 toont de algemene opzet van deze studie en de volgorde van de procedures. Alle details van reagentia, materialen en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Dieren

  1. Huisvest maximaal zes muizen per acryl, transparante, rechthoekige kooi, met strooisel van hout, onder omstandigheden van gecontroleerde temperatuur (21 ± 2 °C) en licht:donker (12:12 uur) cycli.
  2. Geef de dieren gratis toegang tot voedsel en kraanwater in specifieke pathogeenvrije dierfaciliteiten zonder verrijking van de omgeving.

2. Ontleding

  1. Oplossingen, materialen en reagentia
    1. Bereid en filtreer (0,22 μm) de werkoplossingen met de volgende samenstelling (alle concentraties in mM):
      1. Tyrode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissociatie: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Bereid twee dissectiekamers voor; stereoscoop; het bedienen van een schaar; fijne schaar; fijne pincet; en schone, transparante, niet-conische, 1-1,5 cm brede, glazen injectieflacons met een totaal volume van 3-4 ml met doppen. Zorg voor een systeem voor het elektrisch stimuleren van de spieren in de dissectiekamers.
    3. Bereid vuurgepolijste pasteurglazen pipetten voor met verschillende breedtepunten: 5, 4, 3, 2 en 1 mm.
    4. Stel het waterbad in op 37 °C. Weeg aliquots van 3 mg collagenase type 2 af.
  2. Procedure
    1. Offer de muis op met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Cervicale dislocatie wordt aanbevolen omdat het snel en minder stressvol is en blootstelling aan medicijnen vermijdt, die het spierweefsel kunnen aantasten (zoals CO2 of sommige anesthetica). Begin onmiddellijk met dissectie om betere resultaten te verkrijgen.
    2. Plaats de muis op een schuimrubberen ondergrond en plak of speld de voorpoten vast. Knip beide achterpoten over de knieën af met de operatieschaar, breng ze elk over naar een aparte dissectiekamer en voeg koude (10-20 °C) tyrode toe om het weefsel te bedekken.
      OPMERKING: Elke achterpoot geeft zes verschillende spieren in de volgende volgorde: FDB, soleus, EDL, EHL, PL en PDQA. Gedetailleerde anatomische verwijzingen om de zes intacte spieren van pees tot pees te ontleden worden gegeven in figuur 2 en elders42.
    3. Speld de eerste achterpoot op de dissectiekamer in een positie waarin het achterste vlak van de benen zichtbaar is. Verwijder de huid onder vergroting; stel vervolgens de FDB bloot en verwijder deze (Figuur 2). Bewaar het in een gelabelde glazen injectieflacon met 1 ml Tyrode-oplossing.
      OPMERKING: Passende vergroting en voorafgaande training zijn vereist om ongewenste sneden in het spierweefsel te voorkomen.
    4. Leg de soleus bloot, verwijder hem en bewaar hem in een aparte injectieflacon met 1 ml tyrode. Gebruik een fijne schaar om eerst de gastrocnemius te scheiden en vervolgens de soleus te verwijderen, zoals aangegeven in figuur 2.
    5. Leg het voorste vlak van het been bloot, verwijder de huid en identificeer de distale pezen van de tibialis anterior en de EDL-spieren in de enkel. Verwijder het scheenbeen en gooi het weg; snijd vervolgens de distale pezen van de EDL door (Figuur 2). Ga door met dissectie totdat de EDL is verwijderd en plaats deze in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    6. Verwijder de EHL-spier, die net posterieur en mediaal van de EDL ligt. Begin met de dissectie door de pees te identificeren en te volgen tot het 1ecijfer, zoals aangegeven in het overeenkomstige paneel van figuur 2. Bewaar de spier in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    7. Identificeer en volg de meest uitwendige pees van de peronei om deze door te snijden en de PL-spier te verwijderen (Figuur 2). Plaats de spier in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    8. Identificeer en volg de pees tot het 4ecijfer; knip het door en verwijder de PDQA-spier (Figuur 2). Doe het in een aparte glazen injectieflacon met 1 ml tyrode.
    9. Herhaal de procedure met de tweede achterpoot.
    10. Verzamel beide spieren van hetzelfde type in een gelabelde glazen injectieflacon of een kleine petrischaal met tyrode-oplossing.
      OPMERKING: Als het de bedoeling is dat er tijdens een werksessie meer dan twee paar spieren worden ontleed, rekruteer dan twee onderzoekers voor de dissectieprocedure.

3. Het isolatieprotocol van de spiervezel

  1. Vernieuw de Tyrode-oplossing in de dissectiekamers om vuil en muizenvacht te verwijderen. Giet de FDB-spieren in een dissectiekamer, controleer hun integriteit en breng ze over in een nieuwe glazen injectieflacon met 1 ml dissociatieoplossing. Herhaal deze procedure met de EHL-, PL- en PDQA-spieren.
    OPMERKING: Als een spier er hypercontractief, doorgesneden of niet reageert op de elektrische stimulatie, ga dan niet verder met de volgende protocolstap. Optimaliseer in plaats daarvan het dissectieprotocol door de kwaliteit van de oplossingen te verifiëren (pH, contaminatie, osmolariteit) en meer dissectievaardigheden te verwerven (Figuur 1C en aanvullende video S1).
  2. Voer longitudinale of diagonale sneden uit naar de soleus- en EDL-spieren, volgens de oriëntatie van de vezels (Figuur 2). Volg voor de soleus de centrale pees en snijd ~80% van de lengte af. Voor EDL volg je gewoon een of twee pezen en knip je ongeveer dezelfde lengte af als voor soleus. Doe elk paar spieren in glazen injectieflacons met 1 ml dissociatieoplossing.
    OPMERKING: Deze procedure maakt de EDL en soleus kleiner en zorgt ervoor dat het collagenase beter in het weefsel kan komen. Voldoende vergroting (40-50x), evenals een fijne schaar en pincet, zijn verplicht. Controleer altijd de integriteit van het monster door middel van visuele inspectie en elektrische stimulatie voordat u doorgaat naar de volgende stap van het dissociatieprotocol.
  3. Voeg 3 mg collagenase type 2 (met een activiteit van 250-300 E/mg) toe aan elke injectieflacon met 1 ml dissociatieoplossing en een paar spieren. Standaardiseer de exacte hoeveelheid collagenase door rekening te houden met de activiteit van de gebruikte enzymbatch.
  4. Incubeer de spierparen in het waterbad gedurende 65-90 min bij 36,8-37 °C, met zacht schudden.
    NOTITIE: Wees rigoureus met de temperatuurregeling. Standaardiseer de procedure zodat de spieren niet langer dan 100 minuten in collagenase blijven om schade te voorkomen.
  5. Controleer de injectieflacons elke 5 minuten na de 65eminuut van de incubatie onder stereoscoopvergroting. Wanneer de spieren er enigszins gerimpeld, rafelig en los uitzien, schudt u de injectieflacon voorzichtig en controleert u of sommige vezels gemakkelijk beginnen los te laten. Als dit het geval is, was de spieren dan met Tyrode op kamertemperatuur om het collagenase te inactiveren en te verwijderen.
    OPMERKING: Het wassen moet zorgvuldig gebeuren, zonder de spieren met de pipetten aan te raken. Begin met het toevoegen van 0,8 ml tyrode en verwijder vervolgens 0,8 ml van de oplossing. Herhaal deze procedure 4-5x en controleer of de oplossing volledig transparant wordt.
  6. Scheid meer vezels van het grootste deel van de spieren met zeer zachte trituratie in Tyrode met behulp van de set vuurgepolijste pasteurpipetten. Begin met het roeren van de oplossing rond de spier met de breedste pipet (5 mm punt) en trek de spieren vervolgens voorzichtig 3-4x in en uit de pipet. Wanneer de spier vezels begint af te geven en dunner wordt, herhaalt u de procedure met de volgende pipet (punt van 4 mm).
    OPMERKING: Vezels die via deze procedure worden gerenderd, blijven prikkelbaar en trekken langer dan 24 uur stevig samen, zoals geïllustreerd met behulp van PL-, EDL-, EHL- en soleusvezels in Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 en Supplemental Video S5.

4. Experimentele procedures

OPMERKING: Geïsoleerde vezels werden gebruikt voor schattingen van de concentratie van sarcoplasmatische Ca2+ , morfometrische metingen en expressiestudies naar myosine zware keten (MHC).

  1. Meting van de sarcoplasmatische Ca2+ Concentratie tijdens een spiertrekkingen
    1. Monteer een schone, glazen dia op de experimentele badkamer. Smeer het glaasje in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat je ~400 μL van de vezelsuspensie op het glaasje giet. Laat de vezels 10-15 minuten bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Monteer de experimentele kamer op de tafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust voor epifluorescentie (Figuur 3A).
    3. Roep enkele spiertrekkingen op om de levensvatbaarheid van de vezels te verifiëren door rechthoekige stroompulsen (0,8-1,2 ms) toe te passen door de twee platina-elektroden die langs weerszijden van de experimentele kamer zijn geplaatst. Zelfs bij hechting aan laminine is de samentrekking van de vezels nog steeds vooral aan de uitersten zichtbaar.
    4. Laad de vezels met 3,5-4,5 μM van de snelle Ca2+ kleurstof Mag-Fluo-4, AM gedurende 4-5 minuten in Tyrode-oplossing. Was na deze tijd voorzichtig met Tyrode om de extracellulaire kleurstof te verwijderen. Laat de intracellulaire kleurstof ~15-20 minuten onder donkere omstandigheden ontesteren. Houd de temperatuur altijd onder de 22 °C om compartimentering van de kleurstof te voorkomen.
      OPMERKING: Bereid een voorraad Mag-Fluo-4, AM alleen in dimethylsulfoxide (DMSO), zodat de uiteindelijke concentratie DMSO in de ladende tyrode-oplossing minder dan 0,5% bedraagt.
    5. Verlicht de vezel met een witte lichtgevende diode (LED) en een filterset met de volgende golflengten voor excitatie/dichroïsch/emissie: 450-490/510/515 nm (Figuur 3A).
      OPMERKING: Alternatieve bronnen van excitatie zijn kwik- en xenonfluorescentielampen. Gebruik de laagst mogelijke intensiteit en grootte van de excitatievlek om fotobleken van de kleurstof en schade aan de cel te voorkomen.
    6. Roep de Ca2+- respons van de vezel op (sarcoplasmatische Ca2+ -transiënten) door rechthoekige stroompulsen (0,8-1,2 ms) toe te passen door de twee platina-elektroden die langs weerszijden van de experimentele kamer zijn geplaatst bij 20-22 °C.
    7. Verzamel en bewaar de lichtsignalen met een 40x langeafstandsobjectief met olie-onderdompeling dat geschikt is voor fluorescentie en een fotomultiplicatorbuis (PMT) die is aangesloten op een digitizer (Figuur 3A en aanvullende video S6). Zorg voor een schaal in de acquisitiesoftware van 0-200 willekeurige eenheden (AE) en stel de rustfluorescentie (F-rest) van het experiment in op 10 AU op die schaal door de grootte van de excitatievlek en de versterking van de PMT te moduleren. Zodra de procedure is gestandaardiseerd, houdt u de versterking ongewijzigd van het ene experiment naar het andere en stelt u de schaal alleen in door kleine aanpassingen in de spotgrootte.
      OPMERKING: Als er bewegingsartefacten ontstaan, gebruik dan 20-30 μM N-benzyl-p-tolueensulfonamide (BTS) in de Tyrode-oplossing.
    8. Analyseer en kalibreer de signalen als volgt:
      1. Laagdoorlaatfilter het hele spoor bij 1 kHz.
      2. Bereken de F-rust in 1 s van het spoor, stel de F-rest in op 0 en meet de piek van de sarcoplasmatischeCa 2+ transiënten 'amplitude (F-piek). Geef de amplitude weer zoals in vergelijking (1):
        Equation 1(1)
      3. Bereken de piekconcentratie Ca2+ ([Ca2+], μM) met behulp van vergelijking (2)26 en de volgende parameters: in situ dissociatieconstante (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maximale fluorescentie (Fmax) van 150,9 AE, minimale fluorescentie (Fmin) van 0,14 AE, Mag-Fluo-4 concentratie [D]T van 229,1 μM26. DeF-piek werd al bereikt in stap 4.1.8.2.
        Equation 2(2)
      4. Meet de stijgtijd van 10% tot 90% van de amplitude (RT, ms), de duur op de helft van het maximum (HW, ms) en de vervaltijd van 90% tot 10% van de amplitude (DT, ms). Schat vervolgens de vervalkinetiek volgens een fit met de biexponentiële functie (vergelijking 3):
        Equation 3(3)
      5. Sla de waarden op van de tijdconstanten van verval τ1 en τ2 (ms) en amplitudes A1 en A226.
  2. Morfometrische metingen
    1. Monteer een schone, glazen dia op de experimentele badkamer. Smeer het glaasje in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat je ~400 μL van de vezelsuspensie op het glaasje giet. Laat de vezels 10-15 minuten bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Roep enkele spiertrekkingen op om de levensvatbaarheid van de vezels te verifiëren door rechthoekige stroompulsen (0,8-1,2 ms) toe te passen door de twee platina-elektroden die langs weerszijden van de experimentele kamer zijn geplaatst. Zelfs bij hechting aan laminine is de samentrekking van de vezels nog steeds vooral aan de uitersten zichtbaar.
    3. Verkrijg beelden van de levende vezels met behulp van 10x en 20x objectieven en een camera van ten minste 5 megapixels gemonteerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Sla de afbeeldingen op in . TIFF-formaat voor offline analyses.
      OPMERKING: Een set van ~2-6 afbeeldingen kan nodig zijn om een lange vezel volledig vast te leggen.
    4. Stel een microscoopmicrometerkalibratieliniaal voor onder dezelfde vergroting. Sla de afbeeldingen op in . TIFF-formaat voor offline analyses.
    5. Meet de lengtes en diameters van de vezels met behulp van de kalibratietool van gratis software voor beeldanalyses als volgt:
      1. Leg een verband tussen pixels en de bekende afstand (μm) in de afbeeldingen met behulp van de kalibratieliniaal van de microscoopmicrometer met behulp van het gereedschap Analyseren/Schaal instellen, zoals weergegeven in aanvullende afbeelding S1.
      2. Meet eenmaal de lengte van de ene punt naar de andere van de vezel en de diameters op 2-6 verschillende plaatsen langs de vezel (1-2 metingen per afbeelding, afhankelijk van de lengte), zoals in aanvullende figuur S1.
      3. Rapporteer de waarde van de lengte (μm of mm) en het gemiddelde van alle diameters (μm) gemeten per vezel.
  3. Myosine zware keten expressie studies
    OPMERKING: Voor details over de bepaling van MHC door immunofluorescentie43 en natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)33,44,45,46 in hele spieren, zie Aanvullend dossier 1. Het protocol voor vezeltypering door immunofluorescentiebepaling van MHC in de suspensie van FDB-geïsoleerde vezels is als volgt:
    1. Smeer elk van de vijf schone, glazen objectglaasjes in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat u ~300 μL van de vezelsuspensie op elk glaasje giet. Laat de vezels 4 uur bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Zet de bereidingen vast met in de vriezer gekoelde aceton gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
    3. 3x voorzichtig wassen met PBS.
    4. Permeabiliseer de celmembranen met PBS aangevuld met 0,7% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    5. 3x voorzichtig wassen met PBS aangevuld met 0,2% runderserumalbumine (BSA) en 0,04% Triton X-100, en vervolgens 30 minuten op kamertemperatuur opsmeren met PBS met 2% BSA, 2% geitenserum en 0,4% Triton X-100.
    6. 3x voorzichtig wassen met PBS aangevuld met 0,2% BSA en 0,04% Triton X-100 en als volgt incuberen met de primaire antilichamen:
      1. Verdun elk anti-MHC primair antilichaam in een aparte injectieflacon in PBS met 1% BSA en 0,04% Triton X-100: anti-I (1:1,500), anti-II (1:600), anti-IIA (gebruik volledige geconditioneerde media van het hybridoom) en anti-IIB (1:500).
      2. Incubeer elk objectglaasje met één antilichaam en het resterende objectglaasje met PBS als controle gedurende 12-16 uur bij 4 °C.
        OPMERKING: In dit protocol bleven vezels van het type IIX niet gelabeld in alle monsters.
    7. Was 3x voorzichtig met PBS en incubeer alle objectglaasjes met het secundaire antilichaam (1:800) gekoppeld aan een fluorescerend groen molecuul gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
    8. Kleuring van kernen met 1 μg/ml Hoechst gedurende 15 min.
    9. Was 3x voorzichtig met PBS, voeg voorzichtig 20-40 μL montagemedium toe en plaats een dekglaasje.
      OPMERKING: Zachte oplossingsuitwisselingen en wassen zorgen ervoor dat tientallen vezels aan het glaasje blijven vastzitten, waardoor het experiment statistisch verantwoord is.
    10. Visualiseer elk glaasje met behulp van een 10x objectief dat geschikt is voor fluorescentie en een filterset met de volgende golflengten voor excitatie/dichroïsch/emissie: 450-490/510/515 nm en tel alle positieve en negatieve vezels. U kunt ook fluorescentiebeelden maken met dezelfde technische omstandigheden en een camera van ten minste 5 megapixels gemonteerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop en deze opslaan in . TIFF-formaat voor offline analyses.
    11. Noteer de positieve en negatieve vezels van elk objectglaasje in een database en bereken de percentages positieve I-, IIA-, IIB- en totale II-vezels op basis van het totale aantal vezels dat aanwezig is in het overeenkomstige objectglaasje. Bereken het percentage IIX-vezels door de som van IIA+IIB af te trekken van het percentage van het totale aantal II-vezels. Schat het percentage hybride I/IIA-vezels door de som van I+II af te trekken van een waarde van 100%. Trek ten slotte het percentage hybride cellen af van het totaal van I en II om de zuivere type I- en II-vezels te hebben.
      OPMERKING: In MHC-samenstellingsstudies worden vezeltypes aangeduid met een hoofdletter, terwijl isovormen worden aangeduid met een kleine letter46.
  4. Hematoxyline- en eosinekleuring
    1. Smeer een schoon, glazen objectglaasje in met 2-3 μL laminine en laat het 30 seconden drogen voordat u ~300 μL van de vezelsuspensie op het glaasje giet. Laat de vezels 4 uur bij kamertemperatuur aan het laminaat hechten.
    2. Fixeer de bereiding met Carnoy's oplossing (60% absolute ethanol, 30% chloroform, 10% azijnzuur) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Incubeer met hematoxyline gedurende 90 s.
    4. 3x voorzichtig wassen met kraanwater.
    5. Incubeer met 1% eosine Y bereid in 70% ethanol gedurende 30 s.
    6. 3x voorzichtig wassen met kraanwater.
    7. Dompel 3x onder in absolute ethanol.
    8. Incubeer gedurende 60 s in xylol.
    9. Voeg 20-40 μL montagemedium toe en visualiseer met een conventionele microscoop. Maak foto's met de gewenste vergroting met een kleurencamera van minimaal 5 megapixels.

5. Statistische analyses en grafieken

OPMERKING: De experimentele eenheid is een spiervezel.

  1. Druk de resultaten uit als gemiddelde ± standaarddeviatie en bereken betrouwbaarheidsintervallen van 95% (BI95%) voor sommige analyses.
  2. Om lengte, diameter en de kinetiek van Ca2+- transiënten tussen groepen te vergelijken, voert u variantieanalyse (ANOVA) en post-hoctests uit met de correctie van Bonferroni.
  3. Beoordeel normaliteit en variantiegelijkheid met behulp van respectievelijk de Shapiro-Wilk- en Levene-tests.
  4. Beschouw de verschillen als significant wanneer p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sarcoplasmatische Ca2+ concentratie tijdens een spiertrekkingen
Om de haalbaarheid van fysiologische experimenten in de set van gedissocieerde vezels aan te tonen en om onze eerdere bevindingen over excitatie-contractiekoppeling (ECC) en vezeltypes uit te breiden, werden Ca2+ transiënten verworven in vezels van alle spieren. Ten eerste vertoonden FDB (n = 5) en EDL (n = 7) eenCa 2+-kinetiek die bekend staat als morfologietype II (MT-II). Dit zijn snelle, stekelige signalen, waarvan de RT ~1 ms duurt; de vervalfase kan worden uitgerust met een bi-exponentiële functie waarbij de eerste component (A1) groter is dan 30% van de totale amplitude, en de piek [Ca2+] ligt tussen 15 en 30 μM33,47 (Figuur 3B). Hun resultaten zijn gepoold (n = 12) in de eerste kolom van tabel 1, terwijl de resultaten van de Ca2+-transiënten van de soleus (n = 6) worden weergegeven in de tweede kolom van tabel 1. De signalen van de soleus werden geclassificeerd als morfologietype I (MT-I, figuur 3B) -breder, met een RT van meer dan 1,2 ms, eenA1 van minder dan 30% en een piek [Ca2+] tussen 7 en 13 μM33,47. Deze twee kolommen werden beschouwd als referenties voor het vergelijken van de Ca2+ transiënten van de nieuwe spieren. Aangezien alle vezels van PDQA (n = 4), PL (n = 6) en EHL (n = 4) de MT-II deelden (Figuur 3B), worden hun gegevens samengevoegd (n = 14) in de derde kolom van tabel 1. Deze signalen vertoonden een gemiddelde RT van ~1 ms, een A1 van ~45%, een piek [Ca2+] van meer dan 15 μM, en zijn zeer goed te vergelijken met de resultaten in de eerste kolom, maar verschillen duidelijk van die in de tweede kolom, zoals bevestigd door de statistische analyse (tabel 1). Het snelste signaal van het hele monster kwam van een EHL-vezel, met een ΔF/F van 0,66, [Ca2+] van 16,99 μM, RT van 0,85 ms, HW van 2,42 ms en DT van 10,56 ms.T1 enT2 waren respectievelijk 1,63 en 7,21 ms, terwijl A1 en A2 waarden 56,60% en 43,40% waren. Het langzaamste signaal kwam van een soleusvezel, met een ΔF/F van 0,41, [Ca2+] van 9,76 μM, RT van 1,56 ms, HW van 9,43 ms en DT van 31,88 ms. τ1 en τ2 waren respectievelijk 2,81 en 96,42 ms, terwijl A1 en A2 waarden 19,55% en 80,45% waren. 

Een batterij van korte, gemiddelde en lange vezels
De waarneming van duidelijke verschillen tussen de vezels volgens hun spierbron maakte een volledigere morfometrische karakterisering mogelijk. De histogrammen van figuur 4 laten opvallende variaties zien in de lengtes van de vezels over alle spieren. Dit wordt benadrukt bij het vergelijken van de kortste vezel van FDB (227,06 μm) met de langste van soleus (5,69 mm). De gemiddelde lengtewaarden zijn samengevat in tabel 2. Er waren significante statistische verschillen tussen de groepen (p < 0,01). Deze resultaten maken het mogelijk om FDB-vezels te classificeren als kort (<1 mm); PDQA en PL als tussenproduct (1 tot 3 mm); en EDL, EHL en soleus zo lang (>3 mm) (aanvullende afbeelding S2).

Omgekeerd werden kleine verschillen waargenomen in de gemiddelde diameters van de vezels van alle spieren (tabel 2) en de verdeling van de waarden (figuur 4). Toch waren er significante statistische verschillen tussen groepen (p < 0,01). Bij gedetailleerde evaluatie waren er verschillen tussen FDB en elkaars spier en tussen FDB (FDB 38,40 ± 9,40 μm, n = 370) en de pool van tussenliggende en lange vezels (45,07 ± 9,99 μm, n = 422, p < 0,05). De dunste cel van het hele monster mat 18,42 μm (FDB) en de dikste bereikte 82,79 μm (PDQA).

Vezelsoorten die worden gebruikt in fysiologische experimenten
Ten eerste werden vezeltypes die in elke hele spier aanwezig waren, bepaald door immunofluorescentie. Met uitzondering van de soleus vertoonden de spieren een overwicht van meer dan 76% van de type II-vezels (aanvullende figuur S3, tabel 3 en tabel 4). EHL, PL en PDQA zijn bijzonder snelle spieren, met meer dan 90% snelle vezels en tot 58,8% van de type IIB-vezels, zoals gevonden in PDQA. EHL en PDQA waren vrijwel verstoken van type I-vezels. Hybride I/IIA-vezels waren in lage percentages in alle spieren aanwezig. Zoals verwacht waren type I- en IIA-vezels goed voor meer dan 82% van de totale vezels van de soleus. Deze spier is bijna verstoken van de snelste IIB-vezels. Volgens het profiel van vezelsoorten is de soleus de langzaamste en de PDQA de snelste spier van de zes geanalyseerde spieren.

Daarna, en omdat het relevanter is voor fysiologische experimenten met één vezel, werd de vraag beantwoord welke soorten vezels voorkomen in de celsuspensie die is afgeleid van de gedissocieerde FDB. Het bleek dat het profiel van vezels in de celsuspensie de samenstelling van de vezels weerspiegelt die aanwezig zijn in de cryosecties: drie van de vier gedissocieerde vezels waren type II (Figuur 5 en Tabel 3).

Ten slotte werd de samenstelling van de spieren bevestigd door hun MHC-isovormen te scheiden via SDS-PAGE. De resultaten kwamen overeen met het algemene patroon dat werd waargenomen in de immunofluorescentietesten. De soleus was verrijkt in MHC IIa en I, terwijl de EDL, EHL en peronei waren verrijkt in MHC IIx en IIb, maar verstoken waren van I (aanvullende figuur S4).

Figure 1
Figuur 1: Opzet van het onderzoek. (A) Apparatuur en oplossingen die moeten worden opgesteld voordat met de dissectieprocedure wordt begonnen. 1. Stereoscoop nummer één. 2. Van onder naar boven: een set van vijf vuurgepolijste pipetten, dissectie-instrumenten en collagenaseflesjes in een draagbare koeler (gele behuizing). 3. Filterhuis, dissectiekamer, geëtiketteerde glazen flesjes met dop, rek met gefilterde oplossingen. 4. Dissectie gereedschappen. 5. Stereoscoop met dissectiekamer nummers twee gekoppeld aan een camera en een elektrische stimulator. (B) De dissectieprocedure van de set van zes achterpootspieren van muizen, zoals verder uitgelegd in figuur 2. (C) Na dissectie moeten spiercontractie en integriteit worden geverifieerd voordat wordt doorgegaan naar de volgende protocolstap. De linkerspier in het linkerpaneel vertoont een golvende, hypercontractieve, niet-reagerende PL-spier (blauwe pijl), die niet mag worden gebruikt om gedissocieerde vezels te verkrijgen. In plaats daarvan moet het dissectieprotocol worden geoptimaliseerd en opnieuw worden gestart. De goed ontlede PL-tegenhanger (rechterspier in het linkerpaneel) vertoont een langwerpig uiterlijk en trekt zichtbaar samen (Supplemental Video S1). Het paneel rechts toont twee EDL (blauwe pijl) en twee FDB-spieren binnen de collagenase-oplossing met het juiste, rechte uiterlijk. (D) Zodra de spieren zijn gedissocieerd, giet u de geïsoleerde vezels in de experimentele kamer en controleert u hun samentrekking en integriteit. Op het linkerpaneel levende (blauwe pijl) en dode PL-vezels. Op het rechterpaneel, levende (blauwe pijl) en dode EDL-vezels. (E-G) Er werden drie reeksen experimenten uitgevoerd met de geïsoleerde vezels: (E) Sarcoplasmatische Ca2+ concentratiemetingen tijdens een spiertrekkingen (resultaten in figuur 3). (F) Morfometrische analyses (resultaten weergegeven in figuur 4). In dit voorbeeld ziet u een PL-vezel. (G) Immunofluorescentie voor myosine-expressiestudies met zware ketens (resultaten geïllustreerd in figuur 5). In dit voorbeeld ziet u een geïsoleerde FDB-vezel. Schaalbalken = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Anatomische referenties en algemene procedure voor het ontleden van de set van zes achterpootspieren van de muis. Rijen, van boven naar beneden, presenteren de spieren volgens de beste volgorde van dissectie: FDB, soleus, EDL, EHL, PL en PDQA. Kolommen, van links naar rechts, presenteren de mijlpalen tijdens de dissectie. De eerste kolom toont de spieren of hun distale pezen blootgelegd zodat de dissectie kan beginnen. Blauwe pijlen wijzen bijvoorbeeld naar de FDB en soleus in situ en naar de distale pezen van de EDL. De volgende twee kolommen illustreren de dissectie zelf en de spieren die bloot komen te liggen nadat de distale pees(en) is/zijn doorgesneden, zoals bijvoorbeeld aangegeven met de blauwe pijl in de EDL-rij. Het wordt aanbevolen om de tak van de FDB die naar het vijfde cijfer is gericht, te verwijderen. De meest rechtse kolom toont de spieren zodra ze volledig zijn verwijderd, met de proximale pezen gericht op het bovenste deel van de afbeeldingen. Blauwe, discontinue lijnen (uiterst rechtse kolom) illustreren de longitudinale of diagonale sneden die in de soleus- en EDL-spieren moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het collagenase in hun massa terechtkomt. Schaalverdelingen = 5 mm. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Ca2+ transiënten geregistreerd in vezels verkregen uit een set van zes achterpootspieren van muizen. (A) Opstelling gebruikt voor het verkrijgen van Ca2+ transiënten onder gedimde verlichting. Linkerpaneel: 1. PMT aangesloten op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (2). 3. Camera gekoppeld aan de microscoop. 4. Elektrische stimulator gekoppeld aan de experimentele kamer. 5. Het micromanipulatiesysteem kan worden gebruikt wanneer elektrofysiologie en injectietests zijn gepland om de verwerving van Ca2+- transiënten aan te vullen. Middenpaneel: de experimentele kamer (insert) met de geladen cellen wordt op de tafel van de microscoop gemonteerd en verlicht met blauw licht (450-490 nm, blauwe pijl) om de kleurstof te exciteren. In deze opstelling worden de items 1 tot en met 5 over een antivibratietafel en in een kooi van Faraday geplaatst. Rechterpaneel: Zodra de kwaliteit van de contractie en het laden van de kleurstof is geverifieerd met de camera (6), wordt het uitgestraalde licht naar de PMT geleid, start de elektrische stimulatie en wordt het signaal naar de digitizer (7) en naar de acquisitiesoftware (8) gestuurd om de Ca2+ transiënt op te nemen. De geïntegreerde functie van deze elementen tijdens een live experiment is te zien in Supplemental Video S6. (B) Representatieve, gekalibreerde Ca2+ transiënten van FDB, PDQA, PL, EDL, EHL en soleusvezels van de muis. De vergelijkbare, snelle, smalle signalen van FDB, PDQA, PL, EDL en EHL bevestigen dat ze MT-II hebben waarvan al bekend is dat het afkomstig is van IIX- en IIB-vezels, die het meest voorkomen in deze spieren. Daarentegen is de soleus transiënt langzamer en kleiner, typisch voor MT-I, oorspronkelijk beschreven in I- en IIA-vezels. De rode curve over de EDL- en soleus-signalen laat zien dat de vervalfase van MT-I en MT-II kan worden uitgerust met een bi-exponentiële vervalfunctie. Kalibratiebalken zijn van toepassing op alle panelen. Verticale balk = 2,5 μM van [Ca2+], horizontale balk = 10 ms. De kleurentoets aan de onderkant helpt bij het identificeren van de spieren. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; PMT = fotomultiplicatorbuis; MT-I = morfologie type I; MT-II = morfologie type II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Morfometrische metingen van de korte, tussenliggende en lange vezels verkregen door enzymatische dissociatie van de set van zes achterpootspieren van muizen. Intacte, gezonde, representatieve vezels van elke spier zijn afgebeeld in de meest linkse kolompanelen. Afbeeldingen werden alleen bewerkt om achtergrondruis te verminderen en het contrast te verbeteren, zonder directe manipulatie van de spiervezels. Schaalbalken = 100 μm (alle panelen). Het meetprotocol, evenals het uiterlijk en de kwaliteit van de volledige lange vezels, kunnen verder worden bekeken in aanvullende figuur S1. De middelste kolom toont de lengteverdelingen, gerangschikt van de spier die de kortste vezels (FDB) heeft weergegeven, tot degene met de langste vezels (soleus). Er is een continuüm van lengtes zodat er enige overlap is tussen spieren, met een totale lengte van ~5,5 mm. Diameterverdelingen worden weergegeven in de meest rechtse kolompanelen. De meeste vezels liggen tussen de 30 en 60 μm, met kleine verschillen tussen spieren. Test-hertestanalyses (n = 78 vezels, overeenkomend met 9,85% van de totale steekproef van n = 792) van de morfometrische metingen toonden een zeer hoge reproduceerbaarheid (gemiddelde variatiecoëfficiënt van 1,77% - betrouwbaarheidsinterval 95%, CI95%, 1,26-2,27% - gemiddelde correlatiecoëfficiënt van 0,99 (CI95% 0,98-0,99)), wat de goede betrouwbaarheid van de resultaten benadrukt. Gaussiaanse verdelingscurven werden toegevoegd met gelicentieerde software voor grafieken. Aanvullende figuur S2 toont staafdiagrammen van de gemiddelde waarden van lengte en diameter en de samenvoegingen van lengte- en diameterverdelingen van alle spieren voor een gemakkelijkere vergelijking. Kleurtoets aan de onderkant helpt bij het identificeren van de spieren. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL, = extensor hallucis longus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Immunofluorescentietesten voor vezeltypes in de celsuspensie in gedissocieerde FDB-spieren. Afbeeldingen van verschillende velden tonen intacte, gedissocieerde FDB-vezels die aan de onderkant van de objectglaasjes zijn gehecht. (A) Een antimyosine II-positieve vezel (groene fluorescentie, diagonale lichtblauwe pijl) contrasteert duidelijk met een negatieve vezel (lichtblauwe pijlpunt), wat het discriminatievermogen van de test aantoont. De aanwezigheid van beide vezels in het beeld kan worden bevestigd door de etikettering van de kernen (blauwe fluorescentie). (B) Een ander veld toont een andere antimyosine II-positieve vezel. (C) De correcte identificatie van de zware myosineketen in de A-banden (groene fluorescentie) door de antilichamen werd bevestigd met behulp van confocale microscopie. De meest beruchte transversale zwarte strepen komen overeen met de I-banden, verrijkt met actine, en worden dus naar verwachting niet herkend door de antilichamen. (D) Hematoxyline labelt paars de typische perifere, overvloedige kernen, en eosine labelt het sarcoplasma van de vezel en toont een intacte, volwassen cel. Schaalbalken = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Afkorting: FDB = flexor digitorum brevis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vezels FDB en EDL Soleus PDQA, PL en EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0,68±0,15 0,46±0,06*,† 0,66±0,12 <0,01
[ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 Overige <0,01
RT (ms) 0,95±0,10 1,26±0,20*,† 0,95±0,09 <0,01
Helling stijgen (F/ms) 5,97±1,41 3.12±0.79*,† 5,83±0,97 <0,01
HW (ms) 3,59±0,85 8.17±3.00*,† 3,19±0,54 <0,01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0,01
Verval helling (F/ms) -0,24±0,07 -0,10±0,03*,† -0,35±0,08* <0,01
T1 (MS) 1,86±0,37 2,07±0,66† 1,57±0,18 <0,05
T2 (MS) 11.50±3.93 Nee 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0,01
Een1 (%) 48.14±7.27 Overige 25,94±8,98*,† 44.59±8.29 Overige <0,01
Een2 (%) 51.86±7.27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0,01
Morfologie MT-II MT-I MT-II

Tabel 1: De kinetiek van Ca2+ transiënten in enzymatisch gedissocieerde vezels verkregen uit een set van zes achterpootspieren van muizen. De waarden zijn gemiddelden ± standaarddeviatie. p-waarden komen overeen met de variantieanalysetest. *Aanzienlijk verschillend van de FDB- en EDL-groepen. †Significant verschillend van de PDQA-, PL- en EHL-groepen. Afkortingen: F = fluorescentie; [Ca2+] = cytosolische piekconcentratie Ca2+ ; RT = rijstijd; HW = duur op maximaal de helft; DT = vervaltijd; τ1 en τ2 = tijdconstanten van verval; A1 en A2 = amplitudes van verval; FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MT-I = morfologie type I; MT-II = morfologie type II.

Vezels FDB PDQA PL EDL (EDL) EHL Soleus p
n 370 142 80 70 87 43
Lengte (mm) 0,42±0,05* 2,20±0,26** 2,69±0,26† 3,51±0,53†† 3,83±0,44‡ 4,62±0,64 <0,01
Doorsnede (μm) 38.40±9.40* 46,39±9,50 45.98±11.18 44.43±7.62 Overige 41.96±9.16 46.36±12.85 <0,01

Tabel 2: Morfometrische metingen van de korte, tussenliggende en lange vezels verkregen door enzymatische dissociatie van de set van zes achterpootspieren van muizen. De waarden zijn gemiddelden ± standaarddeviatie. p-waarden komen overeen met de variantieanalysetest. *Statistisch verschillend van PDQA, PL, EDL, EHL en soleus. **Aanzienlijk anders dan PL, EDL, EHL en soleus. †Aanzienlijk anders dan EDL, EHL en soleus. ††Aanzienlijk anders dan EHL en soleus. ‡Aanzienlijk anders dan soleus. Aanzienlijk anders dan EHL. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Spieren/Vezels N n Totaal type I + I/IIA (%) Totaal type II (%)
FDB 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76,54±2,51

Tabel 3: Vezeltypes in cryosecties en in de celsuspensie in gedissocieerde FDB-spieren van muizen. De waarden zijn gemiddelden ± standaarddeviatie. N verwijst naar het aantal dieren, terwijl n verwijst naar het totale aantal vezels dat in de experimenten is geanalyseerd. FDB-rij presenteert gegevens van de hele spier zoals bepaald in cryosecties, terwijl *FDB-rij overeenkomt met geïsoleerde vezels in de celsuspensie na dissociatie van de spier. De kolom "Totaal type II" geeft zuivere vezels van het type IIA, IIX en IIB weer. Afkorting: FDB = flexor digitorum brevis.

Spier N n Type I (%) Type I/IIA (%) Soort IIA (%) Type IIX (%) Type IIB (%) Totaal type II (%)
PDQA 4 597 0,00±0,00 10.15±2.62 19.33±6.19 uur 11.68±7.57 58.84±7.63 89,85±2,62 Overige
PL 4 576 3,44±3,94 2.04±2.48 23.01±7.03 35,85±5,66 35.66±9.36 Overige 94,52±3,90
EDL (EDL) 4 826 0,00±0,00 10.44±8.33 uur 5.67±5.07 24.75±10.93 Overige 59.15±11.36 89,56±8,33
EHL 5 618 0,24±0,76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
Soleus 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 Nee 1,12±1,93 66.08±5.59 Overige

Tabel 4: Vezeltypes in cryosecties van de spieren die tussenliggende en lange vezels van muis geven. De waarden zijn gemiddelden ± standaarddeviatie. N verwijst naar het aantal dieren, terwijl n verwijst naar het totale aantal vezels dat in de experimenten is geanalyseerd. Alle rijen presenteren gegevens van de hele spier zoals bepaald in cryosecties. Type I-, IIA-, IIX- en IIB-kolommen weerspiegelen zuivere vezels, terwijl de I/IIA-kolom verwijst naar hybride vezels. De kolom "Totaal type II" is de som van de kolommen type IIA, IIX en IIB. Afkortingen: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus.

Aanvullend bestand 1: Myosine zware keten expressie studies in hele spieren. De protocollen bevatten details voor de bepaling van myosine zware keten isovormen door immunofluorescentie in cryosecties en door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese in homogenaten van de hele spieren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Details van de morfologie van de vezels verkregen door enzymatische dissociatie van de set van zes achterpootspieren van de muis. (A) De kalibratieliniaal van de microscoopmicrometer die open is om de schaal in de beeldanalysesoftware in te stellen, wordt aan de linkerkant weergegeven. Het rechterpaneel laat zien hoe de diameter herhaaldelijk werd gemeten, zoals aangegeven door de blauwe lijnen loodrecht op de lange as van de vezel (blauwe pijlen), terwijl de lengte eenmaal van punt tot punt werd gemeten, zoals geïllustreerd door de blauwe lijn langs de hoofdas van de vezel. (B) Verschillende afbeeldingen werden samengesteld met kleine bewerkingen om het lange en gezonde uiterlijk van PDQA-, PL-, EDL-, EHL- en soleusvezels (kleine blauwe, groene, gele, oranje en roze inzetstukken) te demonstreren. De geassembleerde afbeeldingen werden verder bewerkt om de vezels een beter uiterlijk te geven (grote, zwart-witafbeeldingen). (C) DIC-beelden van FDB-, PDQA-, PL- en soleusvezels die de normale onregelmatigheid van hun punt en hun bekende transversale strepen benadrukken. Het DIC-uiterlijk van de resterende EDL- en EHL-vezels is te zien in Supplemental Video S3 en Supplemental Video S4. Schaalbalken = 100 μm. De kleurentoets aan de onderkant helpt bij het identificeren van de spieren. Afkortingen: FDB, flexor digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, extensor digitorum longus; EHL, extensor hallucis longus; DIC = Differentieel interferentiecontrast. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Staafplots en samengevoegde lengte- en diameterverdelingen van de vezels verkregen door enzymatische dissociatie van de set van zes achterpootspieren van muizen. (A) Staafdiagrammen (gemiddelde ± standaarddeviaties) en (B) samengevoegde histogrammen bevestigen het verschil tussen de lengtes, maar de gelijkenis van de diameters in alle groepen. *Aanzienlijk anders dan PDQA, PL, EDL, EHL en soleus. **Aanzienlijk anders dan PL, EDL, EHL en soleus. †Aanzienlijk anders dan EDL, EHL en soleus. ††Aanzienlijk anders dan EHL en soleus. ‡Aanzienlijk anders dan soleus. Aanzienlijk anders dan EHL. De kleurentoets aan de onderkant helpt bij het identificeren van de spieren. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Immunofluorescentiestudies voor vezeltypesamenstelling van de set van zes achterpootspieren van muizen. Representatieve antilichaam-gelabelde cryosecties die voor de analyses worden gebruikt, tonen de goede kwaliteit en intactheid van de monsters aan. Er is een duidelijk overwicht van vezeltype II in alle spieren, behalve in de soleus waarin de hoeveelheid vezeltype I aanzienlijk is. Schaalbalken = 100 μm. De kleurentoets aan de onderkant helpt bij het identificeren van de spieren. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Elektroforetische scheiding van MHC-isovormen in de set van zes achterpootspieren van muizen. (A) Twee representatieve complete gels die op verschillende dagen met verschillende monsters worden uitgevoerd, tonen de kwaliteit, reinheid en reproduceerbaarheid van de scheidings- en migratieafstand van de MHC-isovormen aan wanneer ze worden gekleurd met Coomassie blue. Hoewel deze twee afbeeldingen licht zijn bewerkt om het contrast en de helderheid voor de lezer te verbeteren, werden de analyses uitgevoerd in onbewerkte gels. (B) Voorbeelden van de analyses van de banden voor elk van de zes spieren. Nadat een ROI is geselecteerd in de banen van de gel, wordt een plotprofiel gegenereerd en wordt een Gaussiaanse pasvorm gebruikt om het aandeel MHC-isovormen in de set van zes spieren te schatten. De gevonden MHC-samenstelling was: FDB: I 9,0 ± 5,0%, IIa + IIx 91,0 ± 5,0% (n = 3); PDQA: IIa + IIx 25,9 ± 2,4%, IIb 74,1 ± 2,4% (n = 3); PL: IIa + IIx 24,9 ± 2,2%, IIb 75,1 ± 2,2% (n = 3); EDL: IIa + IIx 22,0 ± 2,3%, IIb 78,0 ± 2,3% (n = 4); EHL: IIa + IIx 27,5 ± 1,0%, IIb 72,5 ± 1,0% (n = 3); soleus: I 35,8 ± 2,5%, IIa (+IIx + IIb indien aanwezig) 64,2 ± 2,5% (n = 4). De kleurentoets aan de onderkant helpt bij het identificeren van de spieren. De grijze rechthoek onder de meest rechtse gel in A verwijst naar de molecuulgewichtmarkering die de migratie van de IIa naar ~ 200 KDa aangeeft. Afkortingen: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = extensor digitorum longus; EHL = extensor hallucis longus; MHC = myosine zware keten; ROI = regio van belang. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S1: De beschadigde, golvende, peroneus longus (PL, links) trekt niet samen bij stimulatie, terwijl de intacte PL (rechts) goed samentrekt, zelfs als deze verder van de elektroden verwijderd is. 0,8x vergroting. Het stimulatieprotocol geeft rechthoekige stroompulsen van 1,2 ms, 0,7 Hz en 50 V af via twee elektroden. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S2: Samentrekkende peroneus longus-vezel. 20x vergroting. Differentiële interferentiecontrastmodus. Het stimulatieprotocol geeft rechthoekige stroompulsen van 1,2 ms, 0,5 Hz en 50 V af via twee platina-elektroden. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S3: Samentrekkende extensor digitorum longus-vezel. 20x vergroting. Differentiële interferentiecontrastmodus. Het stimulatieprotocol geeft rechthoekige stroompulsen van 1,2 ms, 0,5 Hz en 50 V af via twee platina-elektroden. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S4: Samentrekkende extensor hallucis longus-vezel. 20x vergroting. Differentiële interferentiecontrastmodus. Het stimulatieprotocol geeft rechthoekige stroompulsen van 1,2 ms, 0,5 Hz en 50 V af via twee platina-elektroden. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S5. Samentrekkende soleusvezel. 20x vergroting. Differentiële interferentiecontrastmodus. Het stimulatieprotocol geeft rechthoekige stroompulsen van 1,2 ms, 0,5 Hz en 50 V af via twee platina-elektroden. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S6: Live-opname van een Ca2+ transiënt van een extensor digitorum longus vezel geladen met Mag-Fluo-4, AM zoals beschreven in stap 4.1.4. Het stimulatieprotocol geeft rechthoekige stroompulsen van 1,2 ms, 0,5 Hz en 50 V af via twee platina-elektroden. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Als aanvulling op de modellen die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de biologie van volwassen skeletspieren, demonstreren we hier de succesvolle enzymatische dissociatie van een reeks muisspieren met korte, tussenliggende en lange vezels. Deze vezels maken het mogelijk om de generaliseerbaarheid van de MT-II-kinetiek van de Ca2+ -transiënten in skeletspieren aan te tonen. Verder werden de vezeltypen in de intacte, hele spieren geclassificeerd. Aangezien de FDB de meest gebruikte spier is voor fysiologische experimenten, werden de soorten vezels die aanwezig zijn in de celsuspensie na dissociatie beoordeeld.

Een batterij van korte, tussenliggende en lange intacte vezels voor spierbiologische studies
De dissectietechniek, de duur van de enzymatische behandeling, het type enzym dat wordt gebruikt en de trituratieprocedure zijn cruciale stappen binnen het protocol om intacte enzymatisch gedissocieerde vezels te verkrijgen. De dissectie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om de tijd onder hypoxie te verkorten en onnodig strekken te voorkomen. Dit laatste punt is met name relevant voor de soleus, die niet mag worden verwijderd door het gastrocnemius-soleus-complex op te trekken. Bovendien beschadigen een uitgebreide enzymatische behandeling (~3 uur)20,48 en slechte trituratieprocedures (bijv. harde, lage ervaring van de onderzoeker) de cellen, zoals empirisch bevestigd in verschillende laboratoria. Collagenase type 2 wordt aanbevolen boven andere collagenasesoorten. De vorming van belletjes tijdens de trituratie moet worden vermeden en de spieren of de vezels mogen alleen worden gemanipuleerd met glazen pipetten in plaats van plastic pipetpunten. Het gebruik van glazen flacons heeft tijdens de hele procedure de voorkeur boven plastic, conische flacons, omdat de eerste meer zichtbaarheid geven, naar boven op de stereoscoop kunnen worden geplaatst voor een observatie van bovenaf van de spier in de oplossingen, meer ruimte bieden voor de trituratie van de spieren die langer en omvangrijker zijn dan de FDB, en bestand zijn tegen krassen veroorzaakt door de glazen pasteurpipetten. Aangezien leeftijd, gewicht en metabole conditie (bijv. gezonde versus vetrijke obesitas) de efficiëntie van de methode beïnvloeden, kunnen verschillende parameters moeten worden geoptimaliseerd bij het werken met dieren buiten het bereik dat in dit manuscript wordt gebruikt. Belangrijk is dat een milde blootstelling van een spier aan bepaalde enzymen, zoals die hier worden gebruikt, en een correcte dissociatieprocedure geen functionele invloed hebben op de vezels, zoals blijkt uit bewijs dat gedurende tientallen jaren door meerdere groepen is verzameld, waarvan sommige een paar jaar geleden werden samengevat49. Dit wordt verder ondersteund door het feit dat de piek [Ca2+] gemeten met snelle Ca2+ kleurstoffen tijdens een spiertrekking, verkregen in handmatig ontlede bundels en enzymatisch gedissocieerde vezels van muizen, als vergelijkbaar kan worden beschouwd (besproken in 47).

Hoewel er andere modellen zijn voor spierbiologische studies, zoals C2C12-myotubes, normale en gemuteerde menselijke myoblastcellijnen, of pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide vezels 31,39,50,51,52,53, zijn ze onvolwassen en worden ze hier niet besproken. Gepermeabiliseerde of gevilde vezels zijn ook informatieve, goed gekarakteriseerde modellen54,55, maar ze zijn niet intact. Het model van handmatig geïsoleerde vezels biedt verschillende voordelen, zoals elders beschreven20, maar heeft een laag rendement en vereist een hoge opleiding. Deze feiten benadrukken dat het model dat hier van belang is - vezels verkregen door enzymatische dissociatie - de mogelijkheid biedt om intacte, overvloedige, rijpe skeletspiervezels van verschillende typen te verkrijgen. Een beperking van het model is echter dat het ontbreken van pezen de directe beoordeling van contractiele eigenschappen in de geïsoleerde vezels beperkt.

Aangezien de lengte van de vezels niet hetzelfde is als de lengte van de spieren14,42 en dat de vezels de experimenteereenheid zijn, is het relevanter om de lengte van de vezels te classificeren, niet van de spieren. Gezien onze resultaten en hun mogelijke experimentele implicaties, kunnen de FDB-vezels worden geclassificeerd als kort (<1 mm); PDQA en PL als tussenproduct (1 tot 3 mm); en EDL, EHL en soleus zo lang (>3 mm). Korte vezels zijn het gemakkelijkst en het meest overvloedig verkregen (~400-500 vezels per muis) en zijn geschikt voor fluorescentiemicroscopie-experimenten waarbij de hechting van de vezel aan de onderste kamer essentieel is, of wanneer bewegingsartefacten moeten worden vermeden (bijv. Ca2+ transiënten). Lange vezels zijn het moeilijkst te verkrijgen, hebben de laagste weergave en zijn beter voor eiwitexpressie met behulp van scheidingstechnieken of eencellige moleculair-biologische studies. Intermediaire vezels kunnen in een goede hoeveelheid (~50 vezels per muis) worden verkregen na matige training en zijn geschikt voor veel experimentele benaderingen, zoals bijvoorbeeld blijkt uit de experimenten van Ca2+ transiënten. Erkennend dat FDB, EDL en soleus eerder zijn gebruikt, is dit het eerste werk om met succes vezels uit de PDQA-, PL- en EHL-spieren te isoleren, waardoor de beschikbaarheid van modellen voor volwassen skeletspierstudies wordt vergroot. Bovendien zorgt het verkrijgen van vezels uit verschillende spieren ervoor dat er meer informatie uit hetzelfde dier wordt verkregen, waardoor de experimentele variabiliteit wordt verminderd, de statistische kracht en de biologische deugdelijkheid van de conclusies toenemen en het aantal dieren dat in experimenten wordt gebruikt, wordt verminderd.

Generaliseerbaarheid van de kinetiek van Ca2+ transiënten
Bij het analyseren van de kinetiek van de Ca2+ transiënten in volwassen skeletspiervezels van zoogdieren, hebben we eerder aangetoond dat vezels type I en IIA de zogenaamde morfologie type I (MT-I) delen, terwijl vezels IIX en IIB de MT-II morfologie delen. Doorgaans hebben MT-II-signalen een RT van minder dan 1,2 ms, DT van minder dan 25 ms, A1 hoger dan 30%, [Ca2+] meer dan 15 μM, en zijn ze gemakkelijk te vinden in FDB- en EDL-vezels33,47. Na vergelijking van de resultaten van de nieuwe Ca2+ transiënten van PDQA, PL en EHL met die hier gevonden en die eerder gepubliceerd voor FDB en EDL, is het eenvoudig om te concluderen dat ze ook allemaal MT-II zijn. Een andere interessante observatie is dat het vergroten van de beschikbaarheid van nieuwe spieren verrijkt in vezels type IIX en IIB als modellen om gedissocieerde vezels te verkrijgen, het mogelijk maakt om te bevestigen dat de kinetiek van de Ca2+ transiënten gegeneraliseerd kan zijn - type IIX- en IIB-vezels hebben de MT-II, ongeacht hun bron (d.w.z. flexoren (FDB), extensoren (EDL en EHL), of peronei (PDQA en PL)). Dit versterkt het idee van een gevestigd gencellulair programma of profiel van de ECC-machinerie, dat vrij gelijkaardig is binnen alle vezels van hetzelfde type, en dat verschillen in de moleculaire machinerie (d.w.z. isovormen en eiwithoeveelheid) die ten grondslag liggen aan de generatie van Ca2+ transiënten de verschillen in morfologieën die tussen vezels worden gerapporteerd verklaren33. Ten slotte is een praktische implicatie dat door het opnemen met Mag-Fluo-4 van de Ca2+ transiënt van een vezel, het mogelijk is om het type ervan betrouwbaar te kennen.

MHC-expressie in spieren en geïsoleerde vezels: implicaties voor soorten vezels die worden gebruikt in fysiologische experimenten
Het kennen van het type vezel verhoogt de betrouwbaarheid van spieronderzoek. Bijvoorbeeld, bij knock-out muizen van een eiwit dat differentieel tot expressie wordt gebracht volgens vezeltypes, kan het gebruik van vezels van de FDB zonder enige typering tot misleidende resultaten leiden. Onze gegevens bevestigen dat de FDB een gemengde spier is met een overwicht van type IIX-vezels, in overeenstemming met eerdere artikelen 25,31,56. Wat nog belangrijker is, er was een hoge concordantie tussen het aandeel vezeltypes dat in de hele spier aanwezig was en dat verkregen na dissociatie. Aangezien deze informatie nieuw is en meestal niet wordt besproken in artikelen met FDB-vezels, kan worden gespeculeerd dat, toevallig, veel resultaten die zijn behaald met gedissocieerde FDB-vezels echt gemengde informatie kunnen weerspiegelen van ~20-25% afkomstig van vezels type I en 75-80% van type II. Toekomstige studies met behulp van FDB-spieren zouden gegevens en de bijbehorende discussie moeten presenteren, met betrekking tot vezeltypes.

Aangezien soleus sterk verrijkt is met oxidatieve type I-, IIA- en I/IIA-vezels 57,58,59, zijn dit de vezels die in de suspensie worden aangetroffen na dissociatie 33. EDL, een andere bekende spier, is bijna verstoken van type I-vezels57,58,59, waardoor alleen snelle vezels na dissociatie worden weergegeven33. Volgens dezelfde logica en volgens de typeringsresultaten die verrijking van type II-vezels in de drie nieuwe spieren laten zien, verder ondersteund door het feit dat de weinige type I-vezels die worden aangetroffen in peronei-spieren van muizen centraal60 zijn en naar verwachting niet zullen worden bereikt tijdens een milde dissociatie, veronderstellen we dat de waarschijnlijkheid van het gebruik van een snelle IIX- of IIB-vezel in een experiment met gedissocieerde vezels van PDQA, PL of EHL kan oplopen tot 80-90%. Dit lijkt waar te zijn volgens de gegevens van de Ca2+ transiënten waarin geen MT-I-signalen werden gevonden. Gezien hun grootte bieden deze vezels het voordeel dat ze geschikt zijn om te typen na het voltooien van een functioneel experiment. Verder helpt de specificiteit van BTS voor MHC II om onderscheid te maken tussen vezeltypes en bewegingsartefacten te verwijderen. Ten slotte, hoewel deze vezeltyperingsmethode arbeidsintensiever was dan onlangs beschreven geoptimaliseerde61,62, had dit geen invloed op de resultaten van het huidige werk.

Conclusies
De gepresenteerde methodologische details kunnen het gebruik van een verscheidenheid aan enzymatisch gedissocieerde spiervezels in de studie van spierbiologie bevorderen. De veelzijdigheid van het model wordt ondersteund door de mogelijkheid om vezels binnen een groot bereik van lengtes en typen te krijgen en hun gebruik in verschillende experimentele toepassingen. Naast FDB, EDL en soleus waarvan de dissociatie jaren geleden werd gemeld, hebben we de haalbaarheid aangetoond van het verkrijgen van tussenliggende en lange vezels uit andere spieren zoals PDQA, PL en EHL. Gezien het gemak waarmee de dissectie kan worden uitgevoerd en het aantal vezels dat kan worden verkregen, evenals de homogeniteit en grootte van de vezels, stellen we PL voor als een routinematig, geschikt model voor volwassen skeletspierstudies. Dit wordt ondersteund door onze bevindingen dat de kinetiek van de Ca2+ transiënten in skeletspieren kan worden gegeneraliseerd, ongeacht hun bron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Acknowledgments

De auteurs spreken hun dank uit aan professor Robinson Ramírez van UdeA voor hulp met dieren en enkele foto's en aan Carolina Palacios voor technische ondersteuning. Johan Pineda van Kaika heeft ons geholpen met het instellen van de kleuren- en fluorescentiecamera's. Shyuan Ngo, van de Universiteit van Queensland, was zo vriendelijk het manuscript te proeflezen. Deze studie werd gefinancierd door de CODI-UdeA (2020-34909 vanaf 22 februari 2021 en 2021-40170 vanaf 31 maart 2022, SIU), en Planning Office-UdeA (E01708-K en ES03180101), Medellín, Colombia, aan JCC. Financiers namen niet deel aan het verzamelen en analyseren van gegevens, het schrijven of indienen van manuscripten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260 (2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14 (2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939 (2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898 (2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976 (2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118 (2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199 (2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807 (2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074 (2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961 (2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669 (2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796 (2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654 (2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126 (2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075 (2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Tags

Biologie skeletspieren spiervezels vezeltypes Ca2+ excitatie-contractiekoppeling immunofluorescentie myosine zware keten
Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter