מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת עייפות מכנית במקרה של תאי דם אדומים אנושיים באמצעות גישת אלקטרודפורמציה מווסתת אמפליטודה. גישה כללית זו יכולה לשמש למדידת השינויים השיטתיים במאפיינים מורפולוגיים וביומכניים של תאים ביולוגיים בתרחיף מעיוות מחזורי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אלקטרודפורמציה מווסתת משרעת להערכת עייפות מכנית של תאים ביולוגיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי דם אדומים (RBCs) ידועים בעיוות יוצא הדופן שלהם. הם עוברים שוב ושוב עיוות ניכר כאשר עוברים דרך microcirculation. עיוות מופחת נראה אצל RBCs בגיל פיזיולוגי. טכניקות קיימות למדידת עיוות תאים אינן יכולות לשמש בקלות למדידת עייפות, ההתפרקות ההדרגתית בקרומי התאים הנגרמת על ידי עומסים מחזוריים. אנו מציגים פרוטוקול להערכת השפלה מכנית ב-RBCs כתוצאה מלחצים מחזוריים של גזירה באמצעות אלקטרודפורמציה מבוססת אפנון היסט משרעת (ASK) בתעלה מיקרופלואידית. בקצרה, האלקטרודות הבין-ספרתיות בתעלה המיקרופלואידית מעוררות בזרם חילופין במתח נמוך בתדרי רדיו באמצעות מחולל אותות. RBCs בתרחיף מגיבים לשדה החשמלי ומציגים דיאלקטרופורזה חיובית (DEP), המזיזה תאים לקצוות האלקטרודות. לאחר מכן נמתחים התאים בשל הכוחות החשמליים המופעלים על שני חצאי התא, וכתוצאה מכך מתיחה חד-צירית, המכונה אלקטרודפורמציה. ניתן לכוונן בקלות את רמת לחץ הגזירה ואת העיוות הנובע מכך על ידי שינוי המשרעת של גל העירור. זה מאפשר לכמת עיוות לא ליניארי של RBCs בתגובה לעיוותים קטנים וגדולים בתפוקה גבוהה. שינוי גל העירור באמצעות אסטרטגיית ASK גורם לעיוות אלקטרודלי מחזורי עם קצבי עומס ותדרים הניתנים לתכנות. זה מספק דרך נוחה לאפיון עייפות RBC. גישת האלקטרודפורמציה המווסתת ASK שלנו מאפשרת, בפעם הראשונה, מדידה ישירה של עייפות RBC מעומסים מחזוריים. הוא יכול לשמש ככלי לבדיקות ביומכניות כלליות, לניתוח עיוות תאים ועייפות בסוגי תאים אחרים ובמצבים חולים, וניתן גם לשלב אותו עם אסטרטגיות לשליטה במיקרו-סביבה של תאים, כגון מתח חמצן ורמזים ביולוגיים וכימיים.
מבוא
תאי דם אדומים (RBCs) הם התאים המעוותים ביותר בגוף האדם1. העיוות שלהם קשור ישירות לפונקציונליות נשיאת החמצן שלהם. עיוות מופחת ב- RBCs נמצא בקורלציה עם הפתוגנזה של מספר הפרעות RBC2. מדידות עיוותים הובילו אותנו להבנה טובה יותר של מחלות הקשורות ל-RBC3. תוחלת החיים הרגילה של RBCs יכולה לנוע בין 70 ל -140 יום4. לכן, חשוב למדוד כיצד העיוות שלהם פוחת יחד עם תהליך ההזדקנות, למשל, התנהגות העייפות שלהם עקב לחצים מחזוריים גזירה3.
מדידת עיוות RBC בתפוקה גבוהה היא מאתגרת בגלל כוחות סולם פיקוניוטון (~ 10-12 N) המופעלים על תאים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דם שלם אנושי לא מזוהה הושג באופן מסחרי. העבודה הכוללת את דגימות הדם בוצעה במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית באוניברסיטת פלורידה אטלנטיק.
1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי
- הדביקו את פרוסת הסיליקון הראשית SU-8 לעיצוב התעלה המיקרופלואידית בחלק הפנימי של צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 14 ס"מ ונקו אותה בגז N2 .
- שקלו 60 גרם בסיס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ו-6 גרם חומר מרפא PDMS בכוס נייר. מערבבים את שני החלקים בעזרת מרית עץ עד לקבלת צבע לבן עכור.
- יוצקים את תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי פלסטיק המכילה את רקיק הסיליקון. הכניסו את צלחת הפטרי למייבש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאשר תרחיף התא הועמס בתעלה המיקרופלואידית, נצפתה התפלגות אחידה יחסית של תאים. עם יציאת האות (למשל, גל סינוס פשוט או שלב On-Keying של ASK) ממחולל הפונקציות, האלקטרודות האינטרדיגיטציה בעלות הסרט הדק יצרו שדה חשמלי לא אחיד של זרם חילופי. התאים המרחפים הגיבו באופן ספונטני לעירור חשמלי זה והפגינו התנהגות DEP חיובית, כלומר נעה לעבר קצוות האלקטרודות עם חוזק שדה גבוה יותר. כתוצאה מכך, התאים היו מיושרים לאורך קצוות האלקטרודות ונמתחו עקב אלקטרודפורמציה. תחת שלב On-Keying, RBCs נמתחים עקב אלקטרודפורמציה; תחת שלב Off-Keying, RBCs רג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתן להשתמש באפנון ASK OOK של גל סינוס מעורר כוח DEP כדי לבדוק את העייפות המכנית של RBCs לאורך תקופת זמן ארוכה. בפרוטוקול זה, הגבלנו את בדיקת עייפות החוץ גופית לשעה אחת כדי למנוע את ההשפעות המטבוליות השליליות האפשריות על עיוות התא. ניתן לתכנת תנאי בדיקת עייפות מקיפים באמצעות טכניקת אלקטרודפורמציה מווסתת ASK. ניתן לתכנת פרמטרים כגון תדירות טעינה, משרעת וקצב טעינה. ניתן לתכנת את תדירות ההעמסה לערכים משתנים כדי לקבוע את תלות העייפות בתדירות ההעמסה וכן הבדלים בין עומס מחזורי לטעינה סטטית13.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי NSF/CMMI Mechanobiology של נשאי חמצן מלאכותי מבוססי המוגלובין (#1941655) וניתוח דינמי ועייפות של NSF/CMMI של תאי דם אדומים בריאים וחולים (#1635312).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סולם איזון | ViBRA | HT-224R | |
| מסנן פס פס | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD מזרקים חד פעמיים עם Luer-Lok™ טיפים, 1 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 14-823-30 | |
| אגרופי ביופסיה עם מערכת בוכנה, 1.5 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 12-460-403 | |
| אגרופי ביופסיה עם מערכת בוכנה, 3 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 12-460-407 | 1.5 מ"מ וקוטר 3 מ"מ |
| מחט קהה, 23 מד | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin סרום אלבומין | RMBIO | BSA-BSH | |
| צנטריפוגה | SCILOGEX | 911015119999 | |
| צינור חרוטי, 50 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 05-539-13 | |
| דקסטרוז | פישר סיינטיפיק | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| מד מוליכות נמוכה EC | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | ||
| מחולל פונקציית | SIGLENT | SDG830 | |
| מצע אלקטרודה זכוכית/ITO | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| מיקרוסקופ הפוך | OLYMPUS | IX81 - | |
| QUINCY LAB (QL) | דגם 30GCE | דגם דיגיטלי | |
| Matlab | MathWorks | גרף מתווה | |
| מיקרו אוסמומטר - דגם 3300 | מכשירים מתקדמים בע"מ | S/N: 03050397P | |
| סרט עטיפת מעבדת פרפילם | פישר סיינטיפיק | 13-374-12 | |
| צלחת פטרי | FALCON | מק"ט=351006 | ICSI/ביופסידיש 50*9 מ"מ |
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| מנקה פלזמה | האריק פלזמה PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | תוכנת CAD | |
| סוכרוז | פישר סיינטיפיק | 50-188-2419 | |
| מייבש ואקום | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| מרית עץ | פישר NC0304136 מדעי | מדכאי לשון עץ NS 6 אינץ' |
מקורות
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
