אלקטרודפורמציה מווסתת משרעת להערכת עייפות מכנית של תאים ביולוגיים
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת עייפות מכנית במקרה של תאי דם אדומים אנושיים באמצעות גישת אלקטרודפורמציה מווסתת אמפליטודה. גישה כללית זו יכולה לשמש למדידת השינויים השיטתיים במאפיינים מורפולוגיים וביומכניים של תאים ביולוגיים בתרחיף מעיוות מחזורי.
Abstract
תאי דם אדומים (RBCs) ידועים בעיוות יוצא הדופן שלהם. הם עוברים שוב ושוב עיוות ניכר כאשר עוברים דרך microcirculation. עיוות מופחת נראה אצל RBCs בגיל פיזיולוגי. טכניקות קיימות למדידת עיוות תאים אינן יכולות לשמש בקלות למדידת עייפות, ההתפרקות ההדרגתית בקרומי התאים הנגרמת על ידי עומסים מחזוריים. אנו מציגים פרוטוקול להערכת השפלה מכנית ב-RBCs כתוצאה מלחצים מחזוריים של גזירה באמצעות אלקטרודפורמציה מבוססת אפנון היסט משרעת (ASK) בתעלה מיקרופלואידית. בקצרה, האלקטרודות הבין-ספרתיות בתעלה המיקרופלואידית מעוררות בזרם חילופין במתח נמוך בתדרי רדיו באמצעות מחולל אותות. RBCs בתרחיף מגיבים לשדה החשמלי ומציגים דיאלקטרופורזה חיובית (DEP), המזיזה תאים לקצוות האלקטרודות. לאחר מכן נמתחים התאים בשל הכוחות החשמליים המופעלים על שני חצאי התא, וכתוצאה מכך מתיחה חד-צירית, המכונה אלקטרודפורמציה. ניתן לכוונן בקלות את רמת לחץ הגזירה ואת העיוות הנובע מכך על ידי שינוי המשרעת של גל העירור. זה מאפשר לכמת עיוות לא ליניארי של RBCs בתגובה לעיוותים קטנים וגדולים בתפוקה גבוהה. שינוי גל העירור באמצעות אסטרטגיית ASK גורם לעיוות אלקטרודלי מחזורי עם קצבי עומס ותדרים הניתנים לתכנות. זה מספק דרך נוחה לאפיון עייפות RBC. גישת האלקטרודפורמציה המווסתת ASK שלנו מאפשרת, בפעם הראשונה, מדידה ישירה של עייפות RBC מעומסים מחזוריים. הוא יכול לשמש ככלי לבדיקות ביומכניות כלליות, לניתוח עיוות תאים ועייפות בסוגי תאים אחרים ובמצבים חולים, וניתן גם לשלב אותו עם אסטרטגיות לשליטה במיקרו-סביבה של תאים, כגון מתח חמצן ורמזים ביולוגיים וכימיים.
Introduction
תאי דם אדומים (RBCs) הם התאים המעוותים ביותר בגוף האדם1. העיוות שלהם קשור ישירות לפונקציונליות נשיאת החמצן שלהם. עיוות מופחת ב- RBCs נמצא בקורלציה עם הפתוגנזה של מספר הפרעות RBC2. מדידות עיוותים הובילו אותנו להבנה טובה יותר של מחלות הקשורות ל-RBC3. תוחלת החיים הרגילה של RBCs יכולה לנוע בין 70 ל -140 יום4. לכן, חשוב למדוד כיצד העיוות שלהם פוחת יחד עם תהליך ההזדקנות, למשל, התנהגות העייפות שלהם עקב לחצים מחזוריים גזירה3.
מדידת עיוות RBC בתפוקה גבוהה היא מאתגרת בגלל כוחות סולם פיקוניוטון (~ 10-12 N) המופעלים על תאים בודדים. במהלך העשור האחרון פותחו טכנולוגיות רבות למדידת עיוות התא5. מדידות דפורמציה של RBCs ברמת התא הבודד יכולות להתבצע על ידי שאיפת פיפטה ופינצטה אופטית, בעוד אנליזות בתפזורת נעשות על ידי ektacytometry שיפוע אוסמוטי. ניתוחי Ektacytometry מספקים שפע של נתונים, אשר מספק הזדמנות לאבחן הפרעות דם 6,7. ניתן לנתח את העיוות של RBCs גם באמצעות התאוריה הוויסקו-אלסטית על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי של בדיקה קולואידית. בשיטה זו, ניתוח חישובי מוחל כדי להעריך את המודולוס האלסטי של RBCs, בהתחשב הן בתגובות תלויות זמן והן במצב יציב. ניתן למדוד את העיוות של RBCs בודדים באמצעות שיטת מערך microchamber תא יחיד. שיטה זו מנתחת כל תא דרך הממברנה והסמנים הפלואורסצנטיים הציטוסוליים כדי לספק מידע על עיוות RBC והתפלגות המאפיינים התאיים באוכלוסיות RBC מורכבות כדי לזהות הפרעות המטולוגיות8.
עייפות היא גורם מפתח בפגיעה בתכונות של חומרים מהונדסים וביו-חומרים. בדיקת עייפות מאפשרת ניתוח כמותי של שלמות ותוחלת החיים של מבנה הנתון לעומס מחזורי. ניתוח של עייפות בתאים ביולוגיים כבר זמן רב הקשו על ידי היעדר שיטה כללית, ישימה בקלות, תפוקה גבוהה, כמותית ליישום עיוות מחזורי בקרום התא. זה אפשרי עם ניצול של אפנון אות חשמלי וטכניקות אלקטרודפורמציה מיושם בסביבה microfluidic. טכניקת מפתח היסט המשרעת (ASK) כאפנון דיגיטלי מיושמת באמצעות אפנון On-Off keying (OOK) במאמר זה. הרעיון של מפתח מתייחס להעברת אותות דיגיטליים על פני הערוץ, אשר דורש אות נושא גל סינוס כדי לתפקד9. ניתן להגדיר את זמני ההפעלה והכיבוי באופן שווה. תחת ON-keying, RBCs נכנסים למצב מעוות כשהם נחשפים לכוח אלקטרודפורמציה חיצוני (Fdep)10 שנוצר על ידי השדה החשמלי הלא אחיד. תחת OFF-keying, RBCs נמצאים במצב רגוע שלהם. אנו רואים את העייפות של RBCs, כלומר השפלה פרוגרסיבית ביכולתם למתוח עם הגדלת מחזורי העמסה. אובדן העיוות הנגרם על ידי עייפות ב- RBCs יכול לספק תובנות לגבי הנזק המצטבר לקרום במהלך זרימת הדם, ומאפשר לנו להמשיך לחקור את הקשרים בין עייפות תאים ומצבי מחלה.
כאן אנו מספקים נהלים שלב אחר שלב כיצד בדיקות עייפות של RBCs מיושמות במכשיר מיקרופלואידי באמצעות אלקטרודפורמציה באפנון ASK והגדרות המערכת כגון התקן מיקרופלואידי, העמסה מכנית ודמיון מיקרוסקופי לאפיון ההתפרקות ההדרגתית בעיוות מכני של RBCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן להשתמש באפנון ASK OOK של גל סינוס מעורר כוח DEP כדי לבדוק את העייפות המכנית של RBCs לאורך תקופת זמן ארוכה. בפרוטוקול זה, הגבלנו את בדיקת עייפות החוץ גופית לשעה אחת כדי למנוע את ההשפעות המטבוליות השליליות האפשריות על עיוות התא. ניתן לתכנת תנאי בדיקת עייפות מקיפים באמצעות טכניקת אלקטרודפורמצי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי NSF/CMMI Mechanobiology של נשאי חמצן מלאכותי מבוססי המוגלובין (#1941655) וניתוח דינמי ועייפות של NSF/CMMI של תאי דם אדומים בריאים וחולים (#1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
