Presentert her er en protokoll for mekanisk utmattelsestesting i tilfelle av humane røde blodlegemer ved bruk av en amplitudemodulert elektrodeformasjonstilnærming. Denne generelle tilnærmingen kan brukes til å måle de systematiske endringene i morfologiske og biomekaniske egenskaper hos biologiske celler i en suspensjon fra syklisk deformasjon.
Røde blodlegemer (RBC) er kjent for sin bemerkelsesverdige deformabilitet. De gjennomgår gjentatte ganger betydelig deformasjon når de passerer gjennom mikrosirkulasjonen. Redusert deformabilitet ses i fysiologisk aldrende RBC. Eksisterende teknikker for å måle celledeformabilitet kan ikke lett brukes til å måle tretthet, gradvis nedbrytning i cellemembraner forårsaket av sykliske belastninger. Vi presenterer en protokoll for å evaluere mekanisk nedbrytning i RBC fra sykliske skjærspenninger ved bruk av amplitude shift keying (ASK) modulasjonsbasert elektrodeformasjon i en mikrofluidisk kanal. Kort fortalt er de interdigiterte elektrodene i den mikrofluidiske kanalen begeistret med en lavspent vekselstrøm ved radiofrekvenser ved hjelp av en signalgenerator. RBC i suspensjon reagerer på det elektriske feltet og utviser positiv dielektroforese (DEP), som beveger celler til elektrodekantene. Cellene blir deretter strukket på grunn av de elektriske kreftene som utøves på de to cellehalvdelene, noe som resulterer i uniaxial strekking, kjent som elektrodeformasjon. Nivået av skjærspenning og den resulterende deformasjonen kan enkelt justeres ved å endre amplituden til eksitasjonsbølgen. Dette muliggjør kvantifiseringer av ikke-lineær deformabilitet av RBC som respons på små og store deformasjoner ved høy gjennomstrømning. Modifisering av eksitasjonsbølgen med ASK-strategien induserer syklisk elektrodeformasjon med programmerbare lasthastigheter og frekvenser. Dette gir en praktisk måte for karakterisering av RBC-tretthet. Vår ASK-modulerte elektrodeformasjonstilnærming muliggjør for første gang en direkte måling av RBC-tretthet fra sykliske belastninger. Det kan brukes som et verktøy for generell biomekanisk testing, for analyser av celledeformabilitet og tretthet i andre celletyper og syke tilstander, og kan også kombineres med strategier for å kontrollere mikromiljøet i celler, for eksempel oksygenspenning og biologiske og kjemiske signaler.
Røde blodlegemer (RBC) er de mest deformerbare cellene i menneskekroppen1. Deres deformabilitet er direkte relatert til deres oksygenbærende funksjonalitet. Redusert deformabilitet i RBC har vist seg å korrelere med patogenesen av flere RBC-lidelser2. Deformabilitetsmålinger har ført oss til en bedre forståelse av RBC-relaterte sykdommer3. Den normale levetiden til RBC kan variere fra 70 til 140 dag4. Derfor er det viktig å måle hvordan deformabiliteten avtar sammen med aldringsprosessen, for eksempel utmattingsatferden på grunn av sykliske skjærspenninger3.
Måling av RBC-deformabilitet ved høy gjennomstrømning er utfordrende på grunn av piconewtonskalakreftene (~ 10-12 N) som påføres de enkelte cellene. I løpet av det siste tiåret har mange teknologier blitt utviklet for å måle celledeformabilitet5. Deformasjonsmålinger av RBC på encellenivå kan utføres ved pipetteaspirasjon og optisk pinsett, mens bulkanalyser gjøres ved osmotisk gradient ektacytometri. Ektacytometrianalyser gir en overflod av data, noe som gir mulighet til å diagnostisere blodsykdommer 6,7. Deformabiliteten til RBC kan også analyseres ved hjelp av viskoelastisk teori ved kolloid sonde atomkraftmikroskopi. I denne metoden brukes beregningsanalyse for å estimere den elastiske modulen til RBC, med tanke på både tidsavhengige og stabile responser. Deformabiliteten til individuelle RBC kan måles ved å bruke enkeltcelle mikrokammerarray-metoden. Denne metoden analyserer hver celle gjennom membranen og cytosoliske fluorescerende markører for å gi informasjon om RBC-deformabilitet og fordelingen av cellulære egenskaper i komplekse RBC-populasjoner for å oppdage hematologiske lidelser8.
Fatigue er en nøkkelfaktor i nedbrytningen av egenskapene til konstruerte materialer og biomaterialer. Utmattingstesting muliggjør en kvantitativ analyse av integriteten og levetiden til en konstruksjon utsatt for syklisk belastning. Analyse av tretthet i biologiske celler har lenge vært hemmet av mangelen på en generell, lett anvendelig, høy gjennomstrømning og kvantitativ metode for implementering av syklisk deformasjon i cellemembraner. Dette er mulig ved bruk av elektrisk signalmodulasjon og elektrodeformasjonsteknikker implementert i en mikrofluidisk setting. Amplitude shift-tasteteknikken (ASK) som en digital modulasjon brukes gjennom On-Off keying (OOK) modulasjon i denne artikkelen. Begrepet keying refererer til overføring av digitale signaler over kanalen, som krever et sinusbølgebærersignal for å fungere9. PÅ- og AV-tidene kan settes like. Under ON-keying går RBC-er inn i en deformert tilstand mens de utsettes for en ekstern elektrodeformasjonskraft (Fdep)10 opprettet av det ujevne elektriske feltet. Under OFF-keying er RBC i sin avslappede tilstand. Vi observerer tretthet av RBC, nemlig en progressiv nedbrytning i deres evne til å strekke seg med økende belastningssykluser. Det tretthetsinduserte deformabilitetstapet i RBC kan gi innsikt i den akkumulerte membranskaden under blodsirkulasjonen, slik at vi kan undersøke sammenhengen mellom celleutmattelse og sykdomstilstander ytterligere.
Her gir vi trinnvise prosedyrer for hvordan utmattingstesting av RBC implementeres i en mikrofluidisk enhet via ASK-modulert elektrodeformasjon og systeminnstillingene som mikrofluidisk enhet, mekanisk belastning og mikroskopisk avbildning for karakterisering av gradvis nedbrytning i mekanisk deformerbarhet av RBC.
ASK OOK-modulasjonen av en DEP-kraftinduserende sinusbølge kan brukes til å teste den mekaniske utmattingen av RBC over lang tid. I denne protokollen begrenset vi in vitro utmattelsestesting til 1 time for å forhindre potensielle negative metabolske effekter på celledeformabiliteten. Omfattende utmattingstestforhold kan programmeres ved hjelp av ASK-modulert elektrodeformasjonsteknikk. Parametere som lastefrekvens, amplitude og lasthastighet kan alle programmeres. Lastfrekvensen kan programmeres til varierende verdie…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen er finansiert av NSF / CMMI mekanobiologi av hemoglobinbaserte kunstige oksygenbærere (# 1941655) og NSF / CMMI dynamisk og utmattelsesanalyse av friske og syke røde blodlegemer (# 1635312).
Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
Excel | Microsoft | Graph plotting | |
Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |