Electrodeformación de amplitud modulada para evaluar la fatiga mecánica de células biológicas
Summary
Aquí se presenta un protocolo para las pruebas de fatiga mecánica en el caso de glóbulos rojos humanos utilizando un enfoque de electrodeformación de amplitud modulada. Este enfoque general se puede utilizar para medir los cambios sistemáticos en las características morfológicas y biomecánicas de las células biológicas en una suspensión de deformación cíclica.
Abstract
Los glóbulos rojos (RBC) son conocidos por su notable deformabilidad. Sufren repetidamente una deformación considerable al pasar a través de la microcirculación. La deformabilidad reducida se observa en los glóbulos rojos fisiológicamente envejecidos. Las técnicas existentes para medir la deformabilidad celular no se pueden utilizar fácilmente para medir la fatiga, la degradación gradual de las membranas celulares causada por cargas cíclicas. Presentamos un protocolo para evaluar la degradación mecánica en glóbulos rojos a partir de esfuerzos cortantes cíclicos utilizando electrodeformación basada en modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) en un canal microfluídico. Brevemente, los electrodos interdigitados en el canal microfluídico se excitan con una corriente alterna de bajo voltaje a frecuencias de radio utilizando un generador de señales. Los glóbulos rojos en suspensión responden al campo eléctrico y exhiben dielectroforesis positiva (DEP), que mueve las células a los bordes del electrodo. Luego, las celdas se estiran debido a las fuerzas eléctricas ejercidas sobre las dos mitades de la celda, lo que resulta en un estiramiento uniaxial, conocido como electrodeformación. El nivel de esfuerzo cortante y la deformación resultante se pueden ajustar fácilmente cambiando la amplitud de la onda de excitación. Esto permite cuantificar la deformabilidad no lineal de los glóbulos rojos en respuesta a deformaciones pequeñas y grandes con un alto rendimiento. La modificación de la onda de excitación con la estrategia ASK induce electrodeformación cíclica con velocidades y frecuencias de carga programables. Esto proporciona una forma conveniente para la caracterización de la fatiga de los glóbulos rojos. Nuestro enfoque de electrodeformación modulada por ASK permite, por primera vez, una medición directa de la fatiga de los glóbulos rojos a partir de cargas cíclicas. Se puede utilizar como una herramienta para pruebas biomecánicas generales, para análisis de deformabilidad celular y fatiga en otros tipos de células y condiciones enfermas, y también se puede combinar con estrategias para controlar el microambiente de las células, como la tensión de oxígeno y las señales biológicas y químicas.
Introduction
Los glóbulos rojos (RBC) son las células más deformablesdel cuerpo humano. Su deformabilidad está directamente relacionada con su funcionalidad de transporte de oxígeno. Se ha encontrado que la deformabilidad reducida en los glóbulos rojos se correlaciona con la patogénesis de varios trastornos de los glóbulos rojos2. Las mediciones de deformabilidad nos han llevado a una mejor comprensión de las enfermedades relacionadas con los glóbulos rojos3. La vida útil normal de los glóbulos rojos puede variar de 70 a 140 días4. Por lo tanto, es importante medir cómo disminuye su deformabilidad junto con el proceso de envejecimiento, por ejemplo, su comportamiento a fatiga debido a los esfuerzos de cizallamiento cíclico3.
La medición de la deformabilidad de los glóbulos rojos con un alto rendimiento es un desafío debido a las fuerzas de escala de piconewton (~ 10-12 N) que se aplican a las celdas individuales. Durante la última década, se han desarrollado muchas tecnologías para medir la deformabilidad celular5. Las mediciones de deformación de los glóbulos rojos a nivel de una sola célula se pueden realizar mediante aspiración con pipeta y pinzas ópticas, mientras que los análisis a granel se realizan mediante ektacitometría de gradiente osmótico. Los análisis de ektacitometría proporcionan una gran cantidad de datos, lo que brinda la oportunidad de diagnosticar trastornos sanguíneos 6,7. La deformabilidad de los glóbulos rojos también se puede analizar utilizando la teoría viscoelástica mediante microscopía de fuerza atómica de sonda coloidal. En este método, se aplica el análisis computacional para estimar el módulo elástico de los glóbulos rojos, considerando tanto las respuestas dependientes del tiempo como las de estado estacionario. La deformabilidad de los glóbulos rojos individuales se puede medir utilizando el método de matriz de microcámaras de una sola célula. Este método analiza cada célula a través de la membrana y los marcadores fluorescentes citosólicos para proporcionar información sobre la deformabilidad de los glóbulos rojos y la distribución de las características celulares en poblaciones complejas de glóbulos rojos para detectar trastornos hematológicos8.
La fatiga es un factor clave en la degradación de las propiedades de los materiales de ingeniería y los biomateriales. Las pruebas de fatiga permiten un análisis cuantitativo de la integridad y longevidad de una estructura sometida a cargas cíclicas. El análisis de la fatiga en las células biológicas se ha visto obstaculizado durante mucho tiempo por la falta de un método general, fácilmente aplicable, de alto rendimiento y cuantitativo para la implementación de la deformación cíclica en las membranas celulares. Esto es posible con la utilización de técnicas de modulación de señales eléctricas y electrodeformación implementadas en un entorno microfluídico. La técnica de modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) como modulación digital se aplica a través de la modulación de modulación On-Off (OOK) en este artículo. El concepto de modulación se refiere a la transmisión de señales digitales a través del canal, que requiere una señal portadora de onda sinusoidal para funcionar9. Los tiempos de encendido y apagado se pueden igualar. Bajo la codificación ON, los glóbulos rojos entran en un estado deformado mientras se exponen a una fuerza de electrodeformación externa (Fdep)10 creada por el campo eléctrico no uniforme. Bajo el OFF-keying, los glóbulos rojos están en su estado relajado. Observamos la fatiga de los glóbulos rojos, es decir, una degradación progresiva de su capacidad de estiramiento con el aumento de los ciclos de carga. La pérdida de deformabilidad inducida por la fatiga en los glóbulos rojos puede proporcionar información sobre el daño acumulado en la membrana durante la circulación sanguínea, lo que nos permite investigar más a fondo las conexiones entre la fatiga celular y los estados de enfermedad.
Aquí proporcionamos procedimientos paso a paso sobre cómo se implementan las pruebas de fatiga de los glóbulos rojos en un dispositivo microfluídico a través de la electrodeformación modulada por ASK y la configuración del sistema, como el dispositivo microfluídico, la carga mecánica y la obtención de imágenes microscópicas para la caracterización de la degradación gradual en la deformabilidad mecánica de los glóbulos rojos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La modulación ASK OOK de una onda sinusoidal inductora de fuerza DEP se puede utilizar para probar la fatiga mecánica de los glóbulos rojos durante un largo período de tiempo. En este protocolo, limitamos las pruebas de fatiga in vitro a 1 hora para prevenir los posibles efectos metabólicos adversos sobre la deformabilidad celular. Se pueden programar condiciones completas de prueba de fatiga utilizando la técnica de electrodeformación modulada por ASK. Se pueden programar parámetros como la frecuencia de carga, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación ha sido financiada por NSF/CMMI Mecanobiología de Portadores Artificiales de Oxígeno Basados en Hemoglobina (#1941655) y NSF/CMMI Análisis Dinámico y de Fatiga de Glóbulos Rojos Sanos y Enfermos (#1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
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