Summary
이 연구는 조직 초퍼를 사용하여 환자 유래 교모세포종 3차원 오가노이드를 생성하는 자동화된 방법을 소개합니다. 이 방법은 치료 테스트를 위해 이러한 오가노이드를 얻기 위한 적절하고 효과적인 접근 방식을 제공합니다.
Abstract
교모세포종(Glioblastoma, IDH-wild type), CNS WHO 등급 4(GBM)는 적극적인 치료에도 불구하고 환자의 생존율이 낮은 원발성 뇌종양입니다. 사실적인 ex vivo 모델을 개발하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 환자 유래 3차원 오가노이드(PDO) 모델은 교모세포종의 표현형 및 분자 이질성을 포착하는 동시에 원래 종양의 주요 특성을 보존하는 혁신적인 플랫폼을 제공합니다. 그러나 PDO 생성을 위한 수동 해부는 시간과 비용이 많이 들며 불규칙하고 크기가 고르지 않은 PDO가 많이 발생할 수 있습니다. 이 연구는 자동화된 티슈 쵸퍼를 사용하여 PDO 생산을 위한 혁신적인 방법을 제시합니다. 4명의 교모세포종과 1명의 성상세포종, IDH-돌연변이, CNS WHO 등급 2 환자의 종양 샘플은 조직 초퍼를 사용하여 수동으로 처리되었습니다. 수동 접근 방식에서는 현미경으로 제어하는 메스를 사용하여 종양 물질을 절개하고 조직 초퍼를 세 가지 다른 각도로 사용했습니다. 37°C에서 궤도 셰이커에서 배양한 후 명시야 현미경을 사용하여 형태학적 변화를 평가하고, 6주 후 면역형광으로 증식(Ki67) 및 세포사멸(CC3)을 평가했습니다. 조직 초퍼 방법은 제조 시간의 거의 70%를 단축시켰고 두 번째 주부터 수동으로 처리된 조직에 비해 훨씬 더 높은 PDO 평균 수를 가져왔습니다(2주차: 801 대 601, P = 0.018; 3주차: 1105 대 771, P = 0.032, 4주차: 1195 대 784, P < 0.01). 품질 평가는 두 제조 방법 모두에서 유사한 종양 세포 사멸 및 증식 속도를 보여주었습니다. 따라서 자동 조직 초퍼 방법은 시간 및 PDO 수율 측면에서 보다 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 교모세포종 환자의 약물 또는 면역 요법 스크리닝에 대한 가능성을 가지고 있습니다.
Introduction
저등급 신경교종(LGG)은 교모세포종과 같은 고등급 신경교종에 비해 일반적으로 느리게 성장하고 덜 공격적인 비교적 희귀한 뇌종양 그룹입니다. 성인과 소아 모두에서 발생할 수 있으며 성인에서 약간 더 유병률이 높습니다. 정확한 유병률은 지역과 인구에 따라 다르지만, LGG는 모든 원발성 뇌종양의 약 15%-20%를 차지한다1. LGG의 치료 전략에는 신경학적 기능을 보존하면서 종양 절제를 극대화하는 것을 목표로 하는 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 조합이 포함되는 경우가 많습니다. LGG의 관리는 복잡할 수 있으며, 치료법 선택은 종양 위치 및 분자 특성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다2. LGG의 유전적 및 분자적 토대에 대한 이해의 발전은 더 많은 표적 치료법으로 이어졌으며 지속적인 연구는 치료 접근 방식을 계속 개선하고 있습니다.
한편, 교모세포종(Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4, GBM)은 성인에서 발견되는 가장 흔한 원발성 뇌종양으로, 100,000인년당 3.19-4.17건의 발병률을 보인다3. 교모세포종은 두통, 발작, 국소 신경학적 결손, 성격 변화, 두개내압 상승 등의 증상을 유발합니다. 교모세포종의 표준 치료법은 가능한 경우 종양의 부피를 줄인 후 테모졸로마이드와 방사선 요법을 병용하는 것이다4. 또한, 테모졸로마이드와 로무스틴의 병용은 O6-메틸구아닌-메틸전이효소(MGMT)-프로모터 메틸화 환자의 전체 생존율 중앙값을 향상시킬 수있다 5. 그러나 이러한 최근의 치료적 접근에도 불구하고 교모세포종은 예후가 좋지 않은 난치성 질환으로 남아 있으며, 환자의 전체 생존율 중앙값은 16개월에서 전기장 종양 치료(TTFields)를 추가할 경우 최대 20.9개월입니다 3,6. 교모세포종에서 여러 면역 요법이 연구되었으나 생체 내 효능이 제한적인 것으로 나타났습니다. 더욱이, 임상적 및 전임상적 한계는 치료적 돌파구를 방해한다7. 교모세포종의 inter-8 및 intratumoral9 이질성으로 인해 적절하고 현실적인 ex vivo 모델을 확립하는 것이 어려웠습니다.
기존의 2차원(2D) 환자 세포주는 균질한 세포 집단을 나타내며 고처리량 약물 스크리닝에 적합합니다. 그러나, 환자 유래 및 불멸화된 세포주는 여러 번의 통과 후 성장 조건의 차이와 유전형 및 표현형 특징의 편차로 인해 교모세포종을 적절하게 모방하지 못한다10,11,12.
한편, 3D 오가노이드 모델은 최근 장기 및 다양한 암 유형 13,14,15,16,17,18의 표현형 및 분자 이질성을 복제하는 유망한 시스템으로 부상하고 있습니다. 교모세포종의 맥락에서, 대뇌 오가노이드는 종양과 유사한 특성을 모방하기 위해 유전자 변형되었거나16,17 종양 세포 침윤을 유도하기 위해 GSC 또는 스페로이드와 함께 배양되었다18,19. Matrigel 및 EGF/bFGF로 배양한 환자 유래 교모세포종 오가노이드는 줄기세포 이질성 및 저산소증20과 같은 교모세포종의 특징을 나타내지만, 이 모델이 환자 신생물의 주요 분자 특성을 어느 정도까지 나타낼 수 있는지는 여전히 불확실합니다.
환자 유래 교모세포종 오가노이드(PDO)는 조직학적 특성, 세포 다양성, 유전자 발현 및 돌연변이 프로파일을 포함하여 유사한 부모 종양의 우세한 특징을 유지할 수 있는 유망한 모델입니다. 또한, 이들은 성인 설치류의 뇌에 이식될 때 빠르게 침투하여 약물 검사 및 맞춤형 치료를 위한 현실적인 모델을 제공한다21. 그러나 PDO를 생성하기 위해 종양 조직을 수동으로 절개하는 것은 시간과 비용이 많이 듭니다. 따라서 많은 수의 PDO를 생산할 수 있는 신속한 방법이 시급히 필요하며, 이를 통해 개별화된 약물 검사를 약속하는 다양한 치료 접근법을 종합적으로 평가할 수 있습니다. 이 연구는 자동 조직 초퍼를 사용하여 갓 절개한 종양 조직에서 직접 PDO를 제조하는 새로운 방법을 설명합니다. 또한, 이 방법으로 생성된 PDO는 PDO 수, 형태학적 특징, 세포사멸 및 종양 세포의 증식 측면에서 동일한 환자로부터 수동으로 절개된 PDO와 비교되었습니다.
Protocol
모든 환자는 헬싱키 선언에 따라 뷔르츠부르크 대학의 기관 검토 위원회(#22/20-me)의 승인을 받은 서면 동의서를 제공한 후 독일 뷔르츠부르크 대학병원 신경외과에서 치료를 받았습니다. 교모세포종(GBM) 환자 4명과 성상세포종(astrocytoma) 1명, IDH-돌연변이, 중추신경계 WHO 2등급 환자(저등급 신경교종, LGG)의 종양 조직 물질(표 1)을 수술 후 얻어 다음 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 조직 쵸퍼를 사용하여 PDO 생성을 자동화하는 과정을 쵸퍼(C)라고 하며, 현미경 제어 하에 두 개의 메스로 조직을 수동으로 절단하는 공정을 수동(M)이라고 합니다. 종양 샘플로부터 동일한 크기의 6개의 절편(1-2cm3)을 절개한 후, 각각을 반으로 자르고 두 가지 방법을 사용하여 균질하게 처리하였다. 앞서 언급한 종양 내 이질성으로 인해, 각 접근법에 대해 하나의 6-웰 플레이트가 각 환자로부터 생성되었으며, 각 웰은 원래 종양 내의 다른 부위에서 온 PDO를 나타냅니다. 두 절차 모두 층류 공기 흐름 캐비닛 아래에서 수행되었으며 사용된 모든 기구는 사용 전에 멸균되었습니다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 아가로스 블록 준비(C-접근법 전용, 선택 사항)
- 50mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 비커에 채우고 아가로스 1정( 재료 표 참조)을 넣고 현탁될 때까지 잘 섞습니다.
- 끓지 않도록 혼합물을 전자레인지에 30-40초 동안 가열합니다. 그런 다음 혼합물이 47°C에 도달할 때까지 식힙니다.
- 아가로스 혼합물을 밀봉된 실린더 모양의 주조 주형에 붓고 기포가 형성되지 않도록 합니다. 냉동(-20°C) cl을 사용하여 캐스트를 즉시 식히십시오.amp 또는 30분 동안 드라이아이스 위에 올려 놓습니다.
2. 종양 물질의 처리
- 수술실에서 실험실로 가는 길에 종양 물질을 식히기 위해 얼음 상자를 준비합니다.
- 종양 조직(4-5cm³)을 종양을 덮고 있는 25mL의 Hibernate A( 재료 표 참조)가 들어 있는 멸균 50mL 튜브에 옮기고 튜브를 아이스 박스에 넣습니다.
- 층류 공기 흐름 캐비닛 아래에서 Hibernate A와 함께 종양 물질을 멸균된 유리 페트리 접시로 옮깁니다.
- 괴사 조직을 제거하고 현미경으로 제어하여 메스와 조직 겸자를 사용하여 조심스럽게 혈관을 해부합니다. 출혈로 인한 갈색 색조를 나타내는 출혈성 부위 또는 인접한 생존 가능한 조직에 비해 더 창백하거나 더 하얗게 보이는 조직으로 괴사 조직을 식별합니다. 조직을 쥐어짜거나 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 종양 물질을 대략 1-2cm3 크기의 6 조각으로 자릅니다. 조각을 각각 6mL의 H-GPSA 배지(표 2)(표 2)로 미리 채워진 플라스틱 페트리 접시(n =22)에 분배합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다.
3. 티슈 초퍼 설정
- 제조업체 설명서23에 설명된 대로 칼날을 배치합니다.
- 슬라이스 두께를 0.45-0.50mm로 조정합니다. 블레이드 힘을 중간으로 설정합니다. 테이블 해제 노브를 "시작" 모드로 고정합니다.
4. 종양 조직 조각 처리
- 초퍼를 이용한 종양 조직 처리(C 방법)
- 아가로스 블록을 2cm 길이의 실린더로 자르고 히스토아크릴 접착제를 사용하여 이 실린더 중 하나를 다지기 원형 플라스틱 접시에 붙입니다( 재료 표 참조).
- 메스를 사용하여 아가로스 실린더에 심화를 만든 다음 첫 번째 웰(2.5단계)의 종양 조직을 이 구덩이 안에 맞춥니다.
참고: 종양 물질은 조심스럽게 다루어야 하며 틈새로 압착되거나 밀어 넣지 않아야 합니다. 간격은 종양이 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만 절단 과정에서 종양 물질을 안정적으로 유지할 수 있을 만큼 작아야 합니다. 4.1.1 단계. 및 4.1.2. 선택 사항입니다. - 플라스틱 디스크를 절단 테이블의 장착 디스크에 놓습니다( 재료 표 참조).
- 초퍼를 켜 고 리셋 버튼을 누릅니다. 이제 초퍼가 절단을 시작합니다(첫 번째 라운드). 테이블이 끝에 도달하고 아가로스 조직과 종양 조직이 모두 원하는 직경으로 절단되면 기계가 자동으로 멈춥니다.
- 장착 디스크를 90° 회전한 다음 해제 테이블 손잡이를 시작 모드로 조정합니다.
- 리셋 버튼을 누르고 기계가 조직을 다시 절단하여 직사각형 모양의 조직(두 번째 라운드)을 만들도록 합니다.
- 가공된 재료가 있는 플라스틱 디스크를 제거하고 조직 주걱을 사용하여 종양 조직만 조심스럽게 90° 회전시킵니다.
- 플라스틱 디스크를 절단 테이블에 놓고 해제 테이블 손잡이를 시작 모드로 조정하고 재설정 버튼을 눌러 최종 절단 라운드(세 번째 라운드)를 합니다.
- 초퍼를 끄 고 플라스틱 디스크를 제거합니다. 다지기와 칼날을 청소하십시오.
- 5mL 싱글 채널 피펫을 사용하여 처리된 물질을 배지와 함께 피펫으로 흡입하고 현탁액을 다시 접시로 플러시합니다.
- 이전 단계를 2-3회 반복하여 조직을 적절하게 분리합니다.
- 페트리 접시를 얼음 위에 다시 놓고 각 종양의 다른 5개 접시에 대해 단계(4.1.1-4.1.12)를 반복합니다.
- 종양 조직을 수동으로 처리(M 방법)
- 첫 번째 플라스틱 페트리 접시(단계 2.5)의 종양 조직을 3mL의 H-GPSA 배지(표 2)와 함께 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 현미경으로 수동으로 두 개의 메스를 사용하여 세그먼트를 0.5mm 섹션으로 해부합니다.
- 2mL 피펫을 사용하여 절개된 조직을 플라스틱 페트리 접시에 다시 옮깁니다.
- 다른 5개의 페트리 접시(2.5단계)의 종양 절편에 대해 단계(4.2.1.-4.2.3.)를 반복합니다.
5. 종양 조직 세척
- 각 페트리 접시를 위쪽으로 45°로 기울이고 종양 덩어리가 접시 바닥으로 가라앉을 때까지 30초 동안 기다립니다.
- 1mL 피펫을 사용하여 H-GPSA 배지(표 2) 2.5mL를 조심스럽게 흡입하고 종양 조직을 차지하지 않도록 주의하십시오.
- 각 샘플에 2mL의 RBC 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가합니다. 처리된 종양 조각은 용해 완충액으로 완전히 덮어야 합니다.
- 6개의 접시를 실험실 궤도 진탕기에 10분 동안 저속으로 놓습니다.
- 용해 완충액 2mL를 종양 조직을 차지하지 않도록 조심스럽게 흡입합니다.
- 매번 용해 완충액 대신 2mL의 H-GPSA 배지(표 2)를 사용하여 이전 세척 단계(단계 5.1-5.5)를 두 번 반복합니다.
6. 종양 조직 배양
- 각 접시에서 H-GPSA 배지(표 2)를 흡입하고 4mL의 PDO 배지(표 2)로 교체합니다.
- 각 접시의 조직 덩어리를 초저 부착 6웰 플레이트의 각각의 웰로 옮깁니다( 재료 표 참조).
- 플레이트를 인큐베이터 내부의 오비탈 셰이커에 놓고 37°C, 5%CO2 및 150rpm에서 2-4주 동안 배양합니다.
- 각 웰에서 2mL의 배지를 흡입하고 37°C로 사전 예열된 2mL의 신선한 PDO 배지(표 2)로 교체하여 이틀에 한 번씩 절반 배지 교체를 수행합니다.
- 현미경으로 조직(형태, 성장, 중간 색상)을 관찰하고 성장하는 PDO(>0.7mm) 또는 접착 조직을 절단하여 조직 저산소증을 방지합니다.
- 이렇게하려면 PDO를 초저 부착물에서 멸균 된 유리 페트리 접시로 옮기고 메스를 사용하여 절단하십시오. 또는 접착 PDO를 1mL 피펫으로 흡입하여 분리할 수 있습니다. PDO를 쥐어짜지 않도록 주의하고 부드럽게 다루십시오.
- 이틀에 한 번씩 PDO를 계산하여 PDO 형성을 평가하고 원하는 원형 형태를 철저히 확인합니다(그림 2).
7. PDO 고정 및 임베딩
- 배양 6주 후 24시간 동안 4% 포르말린으로 각 환자의 각 웰에서 두 개의 PDO를 고정합니다.
- 고정된 PDO를 중성 완충액(인산나트륨) 포르말린에 담그고 임베딩할 때까지 담그십시오.
- 추가 처리를 위해 각 PDO를 카세트( 재료 표 참조)에 넣습니다.
- 아래 참고에 언급된 대로 다음 용액에 카세트를 담그고 탈수 과정을 시작합니다.
참고: 50% 에탄올 20분, 70% 에탄올 20분, 80% 에탄올 20분, 96% 에탄올 20분, 100% 에탄올 20분, 100% 에탄올 30분, 100% 에탄올 + 클로로포름(1:1 비율) 30분, 100% 에탄올 + 클로로포름(1:1 비율) 30분, 앱솔루트 클로로포름 30분, 파라핀은 30분, 파라핀은 STP 120을 사용하여 30분. - 탈수된 PDO를 58-60°C의 파라핀 왁스에 내장합니다.
- 내장된 PDO를 2.5μm 두께로 슬라이스하고 염색을 위해 슬라이드에 장착합니다.
8. 면역형광 염색
- 6주 배양 후 PDO를 장착합니다.
- 이어서, 이전에 보고된 바와 같이 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP, 희석: 1:100) 및 증식 마커 Ki67(희석: 1:1000)( 재료 표 참조)에 대해 이중 염색을 수행합니다(22).
- 유사하게, GFAP 및 항-카스파제-3(CC3, 희석: 1:400)에 대해 PDO를 이중 염색하여 세포사멸을 평가합니다( 재료 표 참조).
- 형광 현미경을 사용하여 40x 배율로 PDO의 이미지를 캡처합니다.
- GFAP-, Ki67 및 CC3 양성 세포와 GFAP/Ki67 및 GFAP/CC3 이중 양성 세포에 대한 이미지를 분석합니다.
- 이미지 분석을 위해 오픈 소스 프로그램 Fiji(ImageJ-win 32)를 활용합니다.
9. 평가 및 데이터 분석
- 배양 첫 주에 표준 설정 및 5배 배율로 매일 현미경으로 밝은 시야 사진을 캡처할 수 있습니다.
- 형태학적 변화를 관찰하고 수동 및 자동 처리 접근 방식 모두에서 성숙 과정을 추적합니다.
- 표준 명시야 모드 설정에서 현미경을 사용하여 형태학적 분석을 수행합니다.
- 5명의 환자 모두의 PDO에서 배양 첫 4주 동안 PDO 수와 형태를 평가합니다.
- 각 환자로부터 각 PDO 카운트에 대한 세 개의 판독값을 얻어 평균의 평균과 표준 오차(SEM)를 계산합니다.
- 3명의 환자로부터 PDO의 증식과 세포사멸을 조사합니다.
- 시중에서 판매되는 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 분석합니다( 자료표 참조).
- Students-T 및 Mann-Whitney U 테스트를 적용하여 PDO 수, 증식 및 세포 사멸 측면에서 수동 PDO 생성과 자동 PDO 생성 간의 차이점을 확인합니다.
Representative Results
교모세포종(GBM) 환자 4명과 LGG 환자 1명은 숙련된 신경병리학자(CMM)의 병리학적 확인 후 포함되었습니다. 대부분의 환자는 메틸화되지 않은 MGMT 프로모터를 가지고 있었고, 모든 교모세포종 환자는 IDH1 및 IDH2 야생형이었다(표 1). 평균적으로 제조 공정은 C 접근 방식에서 88.8분(+/- 6.3분), M 접근 방식에서 322분(+/- 17.2분) 동안 지속되었습니다. 전체 성공률은 4주 배양 후 수작업에서 87%, 초퍼 접근법에서 93%였습니다(n=5). 더욱이, C군에서 유래한 PDO는 1주일 이내에 원하는 둥근 모양에 도달하고 시험관 내 실험에 사용할 수 있을 만큼 충분히 성숙한 반면, M군의 PDO는 대부분 날카롭게 가장자리가 있고 정의되지 않은 상태로 남아 있었습니다(그림 2). C 접근법으로 처리된 종양 조직은 배양 첫 주 후 전체 281개의 PDO(환자당 평균 = 56 +/- 43)를 생성한 반면, M 접근법으로 250개의 PDO(환자당 평균 = 50 +/- 41)가 생성되었습니다. 배양 2주 동안, 5명의 환자 모두의 조직은 C 접근법으로 생성되었을 때 더 높은 PDO 수치를 산출했습니다(801; 환자당 평균= 130 +/- 38)과 M 접근법(601; 환자당 평균 = 76 +/- 44; P = 0.018)입니다. 배양 3주차 동안 C 접근법은 모든 환자로부터 전체 1105개의 PDO(환자당 평균 = 221 +/- 32)를 누적한 반면, M 접근법(P =0.032)에서는 771개의 PDO(환자당 평균= 155 +/- 34)를 누적했습니다. 또한, C 접근법을 사용하여 생성했을 때 4주간의 배양 후 총 1195개의 PDO(환자당 평균= 239 +/- 50)가 형성된 반면, M 접근법(P < 0.01)을 사용한 경우 784개(환자당 평균= 157 +/- 36)가 생성되었습니다. 따라서 C 방법은 두 번째 주부터 훨씬 더 높은 PDO 수를 보여주었습니다(그림 3). 또한 PDO 수의 상대적 변동을 평가하여 연속 주 간의 동적 추세를 탐색했습니다. 분석 결과, C 접근법의 첫 번째 주에서 두 번째 주(265%)로 전환하는 동안 PDO 수가 크게 급증했으며, 이는 빠른 진전을 나타냅니다. 그 후, 셋째 주(75%)에는 증가율이 낮아져 일시적인 조정이 반영되었습니다. 대조적으로, M 접근법은 PDO 카운트의 일관되고 꾸준한 증가를 보여주었으며(둘째 주에 92%, 셋째 주에 각각 67%), 이는 넷째 주에 카운트의 놀라운 안정성에 기여했습니다. PDO 수의 이러한 일관된 상승 추세는 관찰 기간 동안 C 접근법의 신뢰성과 복원력을 강조합니다.
2명의 교모세포종 환자와 1명의 LGG 환자가 PDO 내 성상세포 수(GFAP), PDO 세포 증식(Ki67) 및 세포사멸(CC3) 분석을 위해 포함되었습니다. 결정된 성상세포 수는 C 접근법에서 평균 43%, M 접근법에서 45%로 두 처리 방법 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다(그림 4 및 그림 5, 보충 그림 1 및 보충 그림 2). 마찬가지로, PDO 내 증식률은 C(3%)와 M(1%) 접근법 간에 비슷했습니다. 환자 5의 C 접근법으로 생성된 PDO만이 26%의 증식률을 보인 반면, M 접근법은 1%를 보였다(P =0.001; 그림 4C). 전반적으로 낮은 세포사멸 비율은 C 접근법으로 처리된 PDO에서 검출되었으며(3%), 모든 환자에 대한 M 접근법의 2%에 비해 유의한 차이가 없었습니다(그림 5C). 또한, 세포사멸을 겪는 성상세포의 수와 관련하여 두 방법 간에 유의한 차이가 없었습니다(그림 5D).
그림 1: 자동 다지기를 사용한 환자 유래 오가노이드(PDO) 제조 공정과 수동 접근 방식을 비교한 그래픽 개요. 그림은 (A) 샘플 수집, (B) 종양 물질 해부, (C) 세척 및 (D) 배양을 포함하여 관련된 다양한 단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배양 첫 주 동안의 PDO 형태. 자동 초퍼와 수동 방법을 모두 사용한 PDO 해부 후 형성 비교. 스케일 바 = 1000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배양 첫 4주 동안의 PDO 수. x축은 시간(주)(W)을 표시하고, y축은 C(파란색) 및 M(빨간색) 접근 방식(n = 5)의 PDO 수를 표시합니다. 각 데이터 점은 평균 카운트를 나타내며 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: PDO 내 세포 증식률. (A) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 GFAP 양성 세포(녹색), Ki67 양성 세포(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(n = 3)(표 1). 모든 PDO는 초퍼(C) 및 수동(M) 방법을 사용하여 처리되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) GFAP 양성 세포, (C) Ki67 양성 세포 및 (D) Ki67/GFAP 이중 양성 세포의 상대적 수에 관한 두 가지 방법의 비교. 유의하지 않은 결과는 "ns"로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PDO 내 세포사멸 비율. (A) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 GFAP 양성 세포(녹색), CC3 양성 세포(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(n = 3)(표 1). 모든 PDO는 초퍼(C) 및 수동(M) 방법을 사용하여 처리되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) GFAP 양성 세포, (C) CC3 양성 세포 및 (D) CC3/GFAP 이중 양성 세포의 상대적 수에 관한 두 가지 방법의 비교. 유의하지 않은 결과는 "ns"로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 환자의 특성 및 임상 매개변수. GBM = 교모세포종, IDH-야생형, CNS WHO 등급 4; LGG = 저등급 신경교종; KPS = Karnofsky 성과 점수; MGMT = O6-메틸구아닌-DNA 메틸전이효소; IDH1 = 이소시트레이트 탈수소효소 1, IDH2 = 이소시트레이트 탈수소효소 2, ATRX = α-지중해빈혈/정신지체, X-결합 유전자; M = 형태; CC = 셀 수; p = 증식; A = 세포사멸. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 중간 조성물. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax Pencillin 스트렙토마이신 암포테리신 B. PDO = 환자 유래 오가노이드 DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium. NEAA: 비필수 아미노산. 펜 연쇄상 구균 : 페니실린 / 스트렙토 마이신 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 세포 배양 모델을 생성하는 데 사용되는 기법의 개요. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: PDO의 증식 염색의 개별 채널. (A) DAPI(파란색), (B) GFAP 양성 세포(녹색), (C) Ki67 양성 세포(빨간색) 및 (D) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 오버레이 채널. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: PDO의 세포사멸 염색의 개별 채널. (A) DAPI(파란색), (B) GFAP 양성 세포(녹색), (C) CC3 양성 세포(빨간색) 및 (D) 환자 3, 4 및 5의 PDO에서 오버레이 채널. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구는 PDO 생성을 위한 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 교모세포종은 치료하기 어려운 종양으로 남아 있으며, 종종 재발과 높은 질병 부담을 특징으로 한다 3,6. in vitro에서 관찰된 유망한 결과가 I상 시험 중 in vivo 효능을 입증하지 못하는 경우가 많기 때문에 혁신적인 치료 접근법이 시급히 필요합니다. 이러한 불일치의 원인 중 하나는 단층 배양에서 성장한 환자 유래 불멸화 세포주가 부모 종양의 복잡한 세포 간 상호 작용 및 유전적 특성을 반영할 수 있는 능력이 제한되어 있기 때문일 수 있습니다. 교모세포종 8,9의 높은 종양간 및 종양내 이질성을 감안할 때, 개인 맞춤형 표적 치료제가 선호되며 향후 응용 분야에 대한 가능성을 가질 수 있습니다. 2D 부착 세포주와 달리 오가노이드는 부모 조직21의 특성을 유지할 수 있는 능력을 가지고 있지만, 종양과 정상 뇌 사이의 복잡한 세포 간 상호 작용이 가장 중요하며 이 모델에서 간과될 수 있습니다. 그러나 PDO를 수동으로 생성하는 것은 시간이 많이 걸리는 프로세스이며, 절단 중 메스로 압착하여 발생하는 조직 손상은 성공적인 PDO 성장을 방해할 수 있습니다. 따라서 조직 초퍼를 사용하여 자동화된 방법을 최적화하여 시간과 노력을 줄이면서 더 많은 수의 PDO를 생성할 수 있었습니다. 또한, 우리는 전반적인 증식률과 세포사멸 비율이 두 접근법 간에 차이가 없음을 입증했습니다.
C 접근 방식은 간단하고 구현하기 쉬우며 더 많은 수의 PDO를 생성할 수 있습니다(그림 3). 두 번째와 세 번째 절단 사이의 조직 회전은 프로토콜에서 중요한 단계로 확인되었습니다. 이 단계에서 조직은 이미 무결성을 잃고 쉽게 떨어져 나갈 수 있으므로 현미경으로 추가 절단 또는 수동 해부가 필요한 더 큰 조각이 될 수 있습니다. 자동 초퍼 접근법을 사용하면 사전 설정된 절단 크기를 더 정확하게 지정할 수 있지만, 수동 접근법은 PDO 크기를 결정하는 데 정밀도가 부족하여 PDO의 모양과 크기가 고르지 않아 비교 약물 스크리닝에 불리합니다(그림 2). 그럼에도 불구하고 제안된 방법으로는 PDO당 세포 수의 표준화가 달성되지 않아 표준화된 약물 스크리닝 프로토콜에 잠재적으로 단점이 될 수 있습니다. 다양한 오가노이드 생성 기술의 장단점 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
도 37,38,39,40,41,42 및 이들의 응용은 표 3에 요약되어 있다.
교모세포종 조직은 거친 조직(침투 영역)에서 부드러운 조직(괴사 코어)에 이르기까지 일관성이 다양할 수 있으며, 이는 자동 다지기 접근 방식에 문제를 일으킬 수 있습니다. 조직이 너무 질기면 다지기가 눌려 손상될 수 있고 너무 부드러운 조직은 찌그러질 수 있습니다. 선택된 조직은 중간 수준의 견고성을 포함한 독특한 특성을 나타냈으며, 갈색 또는 노란색 변색이 아닌 분홍빛이 도는 회색을 띠는 것이 산발적으로 나타났습니다. 해면질이고 쉽게 부서지기 쉬운 질감을 가진 조직은 아가로스 블록 내에서 우수한 보존성을 보인 반면, 매우 섬세하고 액화된 종양 조직은 샘플링 절차에서 생략되었습니다. 그러나 초퍼 접근 방식을 사용하면 수동 접근 방식에 비해 더 많은 수의 PDO를 성공적으로 생성할 수 있었으며, 이는 조직이 최적이 아닌 일관성을 가지는 경우에도 가능했습니다. 핵심 해결책은 종양 절제술을 시행하는 외과의와 긴밀한 상호 작용을 유지하여 종양의 다른 부위의 조직을 처리하는 것입니다. 최적이 아닌 조직 일관성의 경우 절단 후 현미경으로 조직을 수동으로 재작업하는 것이 도움이 되었습니다. 이질성을 설명하기 위해 종양 조직은 처음에 6개의 분절로 나뉘었고, 이후 C 또는 M 접근법에서 각 분절을 반으로 줄였습니다. 이 6개의 뚜렷한 섹션 내에서 상당한 수준의 이질성이 예상됩니다. 더욱이, 동일한 섹션 또는 우물의 PDO 내에서도, 뚜렷한 하위 집단의 존재는 그럴듯합니다.
개념 증명으로서, 교모세포종(GBM) 환자 2명과 LGG 환자 1명으로부터 증식 및 세포사멸 데이터가 보고되었으며, 두 방법 간에 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. PDO 생성은 악성 뇌종양에 국한되지 않고 LGG에도 적용될 수 있습니다. 이 연구는 LGG가 2D 문화에서 거의 성장을 보이지 않는다는 것을 강조하므로 연구를 위한 정확한 모델 개발이 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 GBM과 LGG에서 PDO를 빠르고 효과적으로 생성하는 이 접근 방식의 다양성을 입증하는 것을 목표로 합니다.
전반적으로, PDO는 향후 악성 뇌종양에서 표적 치료제의 환자 중심의 치료 전 테스트에 활용될 수 있습니다. 종양 진행이 빠르게 진행되고 구제 치료 옵션이 절실히 필요하기 때문에 개별화된 약물 스크리닝을 위한 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 것이 중요합니다. 다음 단계로, PDO 모델은 실제 치료 반응을 더 잘 모방하기 위해 다양한 면역 치료 접근법으로 평가될 수 있습니다. 미래에는 PDO를 활용하여 임상 환경에서 치료법에 대한 추가 탐색 및 평가의 필요성에 대한 정교한 결론을 도출할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 학제간 임상 연구 센터(IZKF, B-450) 뷔르츠부르크, 바이에른 암 연구 센터(BZKF) 및 뷔르츠부르크 대학의 오픈 액세스 출판 기금(Open Access Publishing Fund)의 지원을 받았습니다. 기술 지원을 제공해 주신 뷔르츠부르크 대학병원 신경외과 실험 신경외과 과장인 Dagmar Hemmerich와 Siglinde Kühnel에게 감사드립니다. 그림 1은 www.biorender.com 를 사용하여 만든 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
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