Summary
Denne studien introduserer en automatisert metode for å generere pasientavledede glioblastom 3-dimensjonale organoider ved hjelp av en vevshakker. Metoden gir en egnet og effektiv tilnærming for å oppnå slike organoider for terapeutisk testing.
Abstract
Glioblastom, IDH-vill type, CNS WHO grad 4 (GBM) er en primær hjernesvulst assosiert med dårlig pasientoverlevelse til tross for aggressiv behandling. Utvikling av realistiske ex vivo-modeller er fortsatt utfordrende. Pasientavledede 3-dimensjonale organoide (PUD) modeller tilbyr innovative plattformer som fanger den fenotypiske og molekylære heterogeniteten til GBM, samtidig som nøkkelegenskapene til de opprinnelige svulstene bevares. Manuell disseksjon for PUD-generering er imidlertid tidkrevende, kostbart og kan gi flere uregelmessige og ujevne PUD-er. Denne studien presenterer en innovativ metode for PUD-produksjon ved hjelp av et automatisert vevshakker. Tumorprøver fra fire GBM og en astrocytom, IDH-mutert, CNS WHO grad 2 pasienter ble behandlet manuelt samt ved bruk av vevshakkeren. I den manuelle tilnærmingen ble tumormaterialet dissekert ved hjelp av skalpeller under mikroskopisk kontroll, mens vevshakkeren ble brukt i tre forskjellige vinkler. Etter dyrkning på orbitalshaker ved 37 °C ble morfologiske endringer evaluert ved lysfeltmikroskopi, mens proliferasjon (Ki67) og apoptose (CC3) ble vurdert med immunfluorescens etter 6 uker. Vevshakkermetoden reduserte nesten 70 % av produksjonstiden og resulterte i et signifikant høyere gjennomsnittlig antall PUD-er sammenlignet med det manuelt behandlede vevet fra den andre uken og utover (uke 2: 801 vs. 601, P = 0,018; uke 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; og uke 4:1195 vs. 784, P < 0,01). Kvalitetsvurdering viste lignende frekvenser av tumorcelleapoptose og proliferasjon for begge produksjonsmetoder. Derfor tilbyr den automatiserte vevshakkermetoden en mer effektiv tilnærming når det gjelder tid og PUD-utbytte. Denne metoden holder løfte om legemiddel- eller immunterapi-screening av GBM-pasienter.
Introduction
Lavgradige gliomer (LGG) er en gruppe relativt sjeldne hjernesvulster som vanligvis presenterer seg som saktevoksende og mindre aggressive sammenlignet med høyverdige gliomer som glioblastom. De kan forekomme hos både voksne og barn, med litt høyere forekomst hos voksne. Den eksakte forekomsten varierer etter region og befolkning, men LGG står for omtrent 15% -20% av alle primære hjernesvulster1. Behandlingsstrategier for LGGs involverer ofte en kombinasjon av kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, med sikte på å maksimere tumorreseksjon samtidig som nevrologisk funksjon opprettholdes. Håndteringen av LGG kan være kompleks, og valg av behandling kan avhenge av faktorer som tumorlokalisasjon og molekylære egenskaper2. Fremskritt i å forstå den genetiske og molekylære grunnlaget for LGGs har ført til mer målrettede terapier, og pågående forskning fortsetter å avgrense behandlingsmetoder.
Glioblastom, IDH-vill type, CNS WHO grad 4 (GBM), derimot, er den mest utbredte primære hjernesvulsten som er funnet hos voksne, med en forekomst mellom 3,19-4,17 tilfeller per 100 000 personår3. GBM forårsaker symptomer som hodepine, anfall, fokale nevrologiske underskudd, endringer i personlighet og økt intrakranielt trykk. Standard behandling for GBM innebærer debulking av svulsten, hvis mulig, etterfulgt av strålebehandling kombinert med Temozolomide4. Videre kan kombinasjon av Temozolomide og Lomustin øke median total overlevelse hos pasienter med O-6-metylguanin-metyltransferase (MGMT)-promotert metylering5. Til tross for disse nylige terapeutiske tilnærmingene forblir GBM imidlertid en uhelbredelig sykdom med dårlig prognose, preget av pasientens median totale overlevelsesrate på 16 måneder opp til 20,9 måneder når tumorbehandlingsfelt (TTFields) legges til 3,6. Flere immunterapeutiske tilnærminger har blitt undersøkt i GBM, men vist begrenset effekt in vivo. Videre hindrer kliniske og prekliniske begrensninger terapeutiske gjennombrudd7. Etableringen av en egnet og realistisk ex vivo-modell har vært utfordrende på grunn av inter-8 og intratumoral9 heterogenitet av GBM.
Konvensjonelle 2-dimensjonale (2D) pasientcellelinjer representerer homogene cellepopulasjoner og er egnet for legemiddelscreening med høy gjennomstrømning. Imidlertid klarer ikke pasientavledede og immortaliserte cellelinjer å etterligne GBM tilstrekkelig på grunn av forskjeller i vekstbetingelser og avvik i genotypiske og fenotypiske egenskaper etter flere passasjer 10,11,12.
På den annen side har 3D-organoidmodeller nylig dukket opp som lovende systemer som replikerer fenotypisk og molekylær heterogenitet av organ og forskjellige krefttyper 13,14,15,16,17,18. I sammenheng med GBM har cerebrale organoider blitt genetisk modifisert for å simulere tumorlignende egenskaper16,17 eller co-dyrket med GSCs eller sfæroider for å indusere tumorcelleinfiltrasjon18,19. Mens pasientavledede GBM-organoider dyrket med Matrigel og EGF / bFGF viser GBM-kjennetegn som stamcelleheterogenitet og hypoksi20, er det fortsatt usikkert i hvilken grad denne modellen kan representere de viktigste molekylære egenskapene til pasientens neoplasmer.
Pasientavledede GBM-organoider (PUD) er lovende modeller som kan opprettholde de dominerende egenskapene til deres analoge foreldretumorer, inkludert histologiske egenskaper, cellulært mangfold, genuttrykk og mutasjonsprofiler. I tillegg blir de raskt infiltrert ved implantasjon i voksne gnagerhjerner, noe som gir en realistisk modell for narkotikatesting og personlig terapi21. Imidlertid er manuell dissekering av tumorvev for å generere PUD tidkrevende og kostbart. Derfor er det et presserende behov for en rask metode som kan produsere et stort antall PUDer, noe som muliggjør omfattende vurdering av ulike terapeutiske tilnærminger som holder løfte om individualisert narkotikatesting. Denne studien beskriver en ny metode for fremstilling av PUD direkte fra nydissekert tumorvev ved hjelp av automatisk vevshakker. Videre ble PUD generert med denne metoden sammenlignet med manuelt dissekerte PUD fra de samme pasientene når det gjaldt PUD-tall, morfologiske egenskaper, apoptose og proliferasjon av tumorceller.
Protocol
Alle pasientene ble behandlet ved Institutt for nevrokirurgi, Universitetssykehuset Würzburg, Tyskland, etter å ha gitt skriftlig informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonen og som godkjent av Institutional Review Board ved Universitetet i Würzburg (#22/20-me). Tumorvevsmateriale fra fire GBM-pasienter og én astrocytom, IDH-mutert, CNS WHO grad 2-pasienter (lavgradig gliom, LGG) (tab 1) ble innhentet fra kirurgi og behandlet ved hjelp av følgende protokoll. Den automatiserte prosessen med å generere PUDer ved hjelp av en vevshakker blir referert til som helikopter (C) og prosessen med å manuelt kutte vevet med to skalpeller under mikroskopisk kontroll som manuell (M). Seks like store seksjoner (1-2 cm3) ble dissekert fra tumorprøven, deretter ble hver av dem kuttet i to og behandlet homogent ved hjelp av de to metodene. På grunn av den nevnte intratumorale heterogeniteten ble det generert en 6-brønnsplate for hver tilnærming fra hver pasient med hver brønn som representerte PUD fra et annet sted i den opprinnelige svulsten. Begge prosedyrene fant sted under et laminært luftstrømskap, og alle brukte instrumenter ble sterilisert før bruk. Oversikten over tilnærmingen er illustrert i figur 1.
1. Klargjøring av agaroseblokker (kun for C-tilnærmingen, valgfritt)
- Fyll 50 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i et begerglass, tilsett en tablett agarose (se materialfortegnelse), og bland godt til det er suspendert.
- Varm blandingen i mikrobølgeovnen i 30-40 s, mens du unngår å koke. Avkjøl deretter blandingen til den når 47 °C.
- Hell agaroseblandingen i en forseglet sylinderformet støpeform og unngå bobledannelse. Avkjøl umiddelbart avstøpningen med en frossen klemme (-20 °C) eller ved å legge den på tørris i 30 minutter.
2. Behandling av tumormaterialet
- Forbered en boks med is for å holde tumormaterialet avkjølt på vei fra operasjonssalen til laboratoriet.
- Overfør tumorvevet (4-5 cm³) til et sterilt 50 ml rør inneholdende 25 ml dvalemodus A (se materialfortegnelse) som dekker svulsten og plasser røret i isboksen.
- Under et laminært luftstrømskap, overfør tumormaterialet sammen med dvalemodus A til en sterilisert glass petriskål.
- Eliminer det nekrotiske vevet og dissekere blodkarene forsiktig ved hjelp av en skalpell og vevtang under mikroskopisk kontroll. Identifiser nekrotisk vev ved hemorragiske områder som viser en brunaktig nyanse som følge av blødning, eller vev som viser et blekere eller hvitere utseende i forhold til det tilstøtende levedyktige vevet. Vær oppmerksom på ikke å klemme eller forstyrre vevet.
- Klipp tumormaterialet i seks stykker med en omtrentlig størrelse på 1-2 cm3. Fordel bitene på petriskåler av plast (n = 6) ferdigfylt med 3 ml H-GPSA-medium (tabell 2), hver22. Legg petriskålene på is.
3. Sette opp vevhakkeren
- Plasser bladet som beskrevet i produsentens håndbok23.
- Juster skivetykkelsen til 0,45-0,50 mm. Sett bladkraften til middels. Fest utløserknappen for bordet til "start" -modus.
4. Behandling av tumorvevsbitene
- Behandling av tumorvev med helikopter (C-metode)
- Skjær agaroseblokkene i sylindere med 2 cm lengde og lim en av disse sylindrene på helikopterets sirkulære plastfat ved hjelp av histoacryllimet (se materialfortegnelse).
- Lag en fordypning i agarosesylinderen ved hjelp av en skalpell, og pass deretter på tumorvevet fra den første brønnen (trinn 2.5) i denne gropen.
MERK: Tumormaterialet skal håndteres forsiktig og ikke klemmes eller skyves inn i gapet. Gapet skal være stort nok til å passe svulsten lett, men lite nok til å holde tumormaterialet stabilt under skjæreprosessen. Trinn 4.1.1. og 4.1.2. er valgfrie. - Plasser plastskiven på monteringsplaten på skjærebordet (se Materialfortegnelse).
- Slå på hakkeren og trykk på tilbakestillingsknappen . Helikopteret begynner nå å kutte (første runde). Maskinen stopper automatisk etter at bordet når enden og både agarose og tumorvev kuttes i ønsket diameter.
- Drei monteringsplaten 90°, og juster deretter utløserbordknappen til startmodus.
- Trykk på tilbakestillingsknappen og la maskinen kutte vevet igjen og skape rektangulært vev (andre runde).
- Fjern plastskiven med det bearbeidede materialet og roter forsiktig bare tumorvevet med 90 ° ved hjelp av vevspatel.
- Plasser plastskiven på skjærebordet, juster deretter utløserbordknappen til startmodus og trykk på reset-knappen for en siste skjærerunde (tredje runde).
- Slå av hakkeren og fjern plastplaten. Rengjør hakkeren og knivene.
- Bruk en 5 ml enkanals pipette til å aspirere det bearbeidede materialet sammen med mediet inn i pipetten og skyll suspensjonen tilbake i fatet.
- Gjenta forrige trinn 2-3 ganger for å skille vevet riktig.
- Legg petriskålen tilbake på is og gjenta trinn (4.1.1-4.1.12.) med de andre 5 rettene i hver svulst.
- Behandler tumorvev manuelt (M-metoden)
- Overfør tumorvevet fra den første petriskålen av plast (trinn 2.5) sammen med 3 ml H-GPSA-medium (tabell 2) til en petriskål i glass. Dissekere segmentet manuelt under mikroskopet i seksjoner på 0,5 mm ved hjelp av to skalpeller.
- Overfør det dissekerte vevet tilbake til petriskålen av plast ved hjelp av en 2 ml pipette.
- Gjenta trinn (4.2.1.-4.2.3.) for tumorseksjonene i de fem andre petriskålene (trinn 2.5).
5. Vask svulstvevet
- Vipp hver petriskål oppover til 45° og vent i 30 s til svulstbitene synker til bunnen av fatet.
- Aspirer 2,5 ml av H-GPSA-mediet (tabell 2) forsiktig med en 1 ml pipette og vær oppmerksom på at du ikke tar opp tumorvev.
- Legg til 2 ml RBCs lysisbuffer (se materialfortegnelse) til hver prøve. De behandlede tumorbitene må dekkes helt av lysisbuffer.
- Plasser de 6 oppvaskene på en laboratorie orbital ristemaskin på sakte hastighet i 10 minutter.
- Aspirer 2 ml lysisbuffer forsiktig for ikke å ta opp noe tumorvev.
- Gjenta de forrige vasketrinnene (trinn 5.1-5.5) to ganger med 2 ml H-GPSA-medium (tabell 2) i stedet for lysisbuffer hver gang.
6. Dyrking av tumorvevet
- Aspirer H-GPSA-mediet (tabell 2) fra hver tallerken og erstatt det med 4 ml PUD-medium (tabell 2).
- Overfør vevsbitene av hver tallerken til en respektive brønn med en 6-brønnsplate med ultralavt feste (se materialtabell).
- Plasser platen på en orbital shaker inne i en inkubator og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 og 150 o / min i 2-4 uker.
- Utfør et halvt middels skift annenhver dag ved å aspirere 2 ml medium fra hver brønn og erstatte det med 2 ml ferskt PUD-medium (tabell 2) forvarmet til 37 °C.
- Observer vevet under mikroskopet (morfologi, vekst, middels farge) og kutt voksende PUD (>0,7 mm) eller limvev for å forhindre vevshypoksi.
- For å gjøre dette, overfør PUDene fra den ultralave festebrønnen til en sterilisert glassfatfat og bruk en skalpell for kutting. Alternativt kan selvklebende PUD-er løses ved å aspirere dem med en 1 ml pipette. Vær forsiktig så du ikke klemmer PUD-ene og håndterer dem forsiktig.
- Vurder PUD-dannelse ved å telle PUD annenhver dag og se grundig etter ønsket rund morfologi (figur 2).
7. Fiksing og innebygging av PUD-ene
- Fiks to PUD fra hver brønn til hver pasient med 4% formalin i 24 timer etter 6 ukers dyrkning.
- Dypp de faste PUD-ene i nøytralt bufret (natriumfosfat) formalin til innebygging.
- Legg hver PUD i en kassett (se Materialfortegnelse) for videre behandling.
- Start en dehydreringsprosess ved å senke kassetten i følgende løsninger som nevnt i MERKNADEN nedenfor:
MERK: 50% etanol i 20 min, 70% etanol i 20 min, 80% etanol i 20 min, 96% etanol i 20 min, 100% etanol i 20 minutter, 100% etanol i 30 minutter, 100% etanol + kloroform (1: 1-forhold) i 30 minutter, 100% etanol + kloroform (1: 1-forhold) i 30 minutter, Absolutt kloroform i 30 min, Absolutt kloroform i 30 min, Parafin i 30 min, parafin i 30 min ved bruk av STP 120. - Legg de dehydrerte PUD-ene i parafinvoks ved 58-60 °C.
- Skjær de innebygde PUD-ene i 2,5 μm tykkelse og monter dem på lysbilder for farging.
8. Farging av immunfluorescens
- Monter PUD etter 6 ukers dyrking.
- Deretter utføres dobbeltfarging mot glialfibrillært surt protein (GFAP, fortynning: 1:100) og spredningsmarkøren Ki67 (fortynning: 1:1000) (se materialtabell), som tidligere rapportert22.
- Tilsvarende vurdere apoptose ved dobbeltfarging av PUD mot GFAP og anti-caspase-3 (CC3, fortynning: 1:400) (se materialtabell).
- Ta bilder av PUD ved hjelp av et fluorescensmikroskop ved 40x forstørrelse.
- Analysere bildene for GFAP-, Ki67- og CC3-positive celler, samt GFAP/Ki67 og GFAP/CC3 dobbeltpositive celler.
- Bruk åpen kildekode-programmet Fiji (ImageJ-win 32) for bildeanalyse.
9. Evaluering og dataanalyse
- Ta daglige mikroskopiske lyse feltbilder i løpet av den første kulturuken ved standardinnstillinger og 5x forstørrelse.
- Observer de morfologiske endringene og spor modningsprosessen i både manuelle og automatiserte behandlingsmetoder.
- Utfør morfologisk analyse ved hjelp av mikroskopet i standard brightfield-modusinnstillinger.
- Evaluere PUD-nummer og morfologi i løpet av de første 4 ukene med dyrkning i PUD fra alle fem pasientene.
- Få tre avlesninger av hver PUD-telling fra hver pasient for å beregne gjennomsnitt og standardfeil av gjennomsnittet (SEM).
- Undersøke spredning og apoptose i PUD fra tre pasienter.
- Analysere dataene ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig statistisk programvarepakke (se Materialfortegnelse).
- Bruk Students-T- og Mann-Whitney U-tester for å bestemme forskjeller mellom manuell og automatisert PUD-generering når det gjelder PUD-antall, spredning og apoptose.
Representative Results
Fire pasienter med GBM og én med LGG ble inkludert etter patologisk bekreftelse av erfaren nevropatolog (CMM). Flertallet av pasientene hadde en ikke-metylert MGMT-promotor, og alle GBM-pasientene var IDH1 og IDH2 villtype (tabell 1). I gjennomsnitt varte produksjonsprosessen 88,8 min (+/- 6,3 min) i C-tilnærmingen og 322 min (+/- 17,2 min) i M-tilnærmingen. Den totale suksessraten var 87 % i den manuelle og 93 % i helikoptertilnærmingen etter 4 ukers kultur (n = 5). Videre nådde PUD avledet fra C-gruppen ønsket avrundet form innen 1 uke og var modne nok til å brukes i in vitro-eksperimenter , mens PUD i M-gruppen stort sett forble skarpt kantet og udefinert (figur 2). Tumorvevet behandlet med C-tilnærming resulterte i totalt 281 PUD (gjennomsnitt per pasient = 56 +/- 43) etter første dyrkningsuke, mens 250 PUD (gjennomsnitt per pasient= 50 +/- 41) ble utviklet med M-tilnærmingen. I andre dyrkningsuke ga vevet hos alle fem pasientene høyere PUD-tall når de ble generert med C-tilnærming (801; Gjennomsnitt per pasient= 130 +/- 38) sammenlignet med M-tilnærming (601; Gjennomsnitt per pasient = 76 +/- 44; P = 0,018). I løpet av den tredje dyrkningsuken akkumulerte C-tilnærmingen totalt 1105 PUD fra alle pasientene (gjennomsnitt per pasient = 221 +/- 32) sammenlignet med 771 PUD (gjennomsnitt per pasient = 155 +/- 34) i M-tilnærmingen (P = 0,032). Videre ble totalt 1195 PUD (gjennomsnitt per pasient = 239 +/- 50) dannet etter fire ukers kultur når generert med C-tilnærmingen sammenlignet med 784 (gjennomsnitt per pasient = 157 +/- 36) ved bruk av M-tilnærmingen (P < 0,01). C-metoden viste derfor signifikant høyere PUD-tall fra og med andre uke (figur 3). Videre ble de relative svingningene i PUD-tellinger evaluert for å utforske de dynamiske trendene mellom påfølgende uker. Analysen avdekket en imponerende økning i PUD-tellinger under den første overgangen fra første til andre uke i C-tilnærmingen (265%), noe som indikerte rask fremgang. Deretter var det en lavere økning i tellingene i løpet av den tredje uken (75%), noe som gjenspeiler en midlertidig justering. I kontrast viste M-tilnærmingen en konsistent og jevn økning i PUD-tellinger (92% i andre uke, henholdsvis 67% i den tredje uken), noe som bidro til en bemerkelsesverdig stabilitet i tellinger i løpet av den fjerde uken. Denne konsistente oppadgående trenden i PUD-tellinger understreker påliteligheten og robustheten til C-tilnærmingen gjennom hele observasjonsperioden.
To GBM-pasienter og en LGG-pasient ble inkludert for analyse av astrocytttall (GFAP) innen PUD, PUD-celleproliferasjon (Ki67) og apoptose (CC3). Det bestemte astrocyttallet viste ingen signifikante forskjeller mellom de to prosesseringsmetodene med et gjennomsnitt på 43 % i C-tilnærming og 45 % i M-tilnærming (figur 4 og figur 5, tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2). Tilsvarende var spredningsratene i PUD sammenlignbare mellom C (3 %) og M-tilnærmingene (1 %). Kun PUD generert med C-tilnærming fra pasient 5 viste en proliferasjonsrate på 26 % sammenlignet med 1 % med M-tilnærming (P = 0,001; Figur 4C). Generelt lave apoptoserater ble påvist i PUD behandlet med C-tilnærming (3 %) sammenlignet med 2 % fra M-tilnærmingen for alle pasienter, som ikke var signifikant forskjellige (figur 5C). Videre var det ingen signifikant forskjell mellom de to metodene når det gjaldt antall astrocytter som gjennomgikk apoptose (figur 5D).
Figur 1: Grafisk oversikt over produksjonsprosessen for pasientavledede organoider (PUD) ved hjelp av en automatisert chopper versus en manuell tilnærming. Illustrasjonen viser de ulike trinnene som er involvert, inkludert (A) prøveinnsamling, (B) tumormaterialedisseksjon, (C) vasking og (D) inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: PUD-morfologi første kulturuke. Sammenligning av dannelse av PUD etter disseksjon ved bruk av både automatisert helikopter og manuell metode. Skala barer = 1000 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PUD-telling i løpet av de fire første ukene med dyrking. X-aksen viser tiden i uker (W), og y-aksen antall PUDer av C (blå) og M (rød) tilnærming (n = 5). Hvert datapunkt representerer gjennomsnittsantallet, med feilfelt som angir standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Celleproliferasjonsrater innen PUD. (A) Representative immunfluorescensbilder (n = 3) av GFAP-positive celler (grønne), Ki67-positive celler (rød) og DAPI (blå) i PUD fra pasient 3, 4 og 5 (tab 1). Alle PUD-ene ble prosessert med metodene helikopter (C) og manuell (M). Skalastenger = 100 μm. (B) Sammenligning av de to metodene angående det relative antallet GFAP-positive celler, (C) Ki67-positive celler og (D) Ki67/GFAP-dobbelt positive celler. Ikke signifikante resultater er indikert med "ns". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Apoptoserater innen PUD. (A) Representative immunfluorescensbilder (n = 3) av GFAP-positive celler (grønne), CC3-positive celler (rød) og DAPI (blå) i PUD fra pasient 3, 4 og 5 (tab 1). Alle PUD-ene ble prosessert med metodene helikopter (C) og manuell (M). Skalastenger = 100 μm. (B) Sammenligning av de to metodene angående det relative antallet GFAP-positive celler, (C) CC3-positive celler og (D) CC3/GFAP-doble positive celler. Ikke signifikante resultater er indikert med "ns". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Pasientkarakteristika og kliniske parametere. GBM = glioblastom, IDH-vill type, CNS WHO grad 4; LGG = lavgradig gliom; KPS = Karnofsky ytelse score; MGMT = O 6-metylguanin-DNA-metyltransferase; IDH1 = isocitrat dehydrogenase 1, IDH2 = isocitrat dehydrogenase 2, ATRX = α-talassemi/mental retardasjon, X-bundet gen; M = morfologi; CC = celletall; p = spredning; A = apoptose. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Middels komposisjoner. H-GPSA = Dvalemodus A-Glutamax blyant streptomycin amfotericin B. PUD = Pasientavledede organoider DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium. NEAA: ikke-essensielle aminosyrer. Pen streptokokker: Penicillin / Streptomycin Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Oversikt over brukte teknikker for å generere cellekulturmodeller. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfigur 1: Individuelle spredningskanaler for farging av PUD. (A) DAPI (blå), (B) GFAP-positive celler (grønn), (C) Ki67-positive celler (rød) og (D) overlappingskanal i PUD fra pasient 3, 4 og 5. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Individuelle kanaler for apoptosefarging av PUD. (A) DAPI (blå), (B) GFAP-positive celler (grønn), (C) CC3-positive celler (rød) og (D) overlappingskanal i PUD fra pasient 3, 4 og 5. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne studien presenterer en rask og effektiv metode for å generere PUD. GBM er fortsatt en utfordrende svulst å behandle, ofte preget av tilbakefall og høy sykdomsbyrde 3,6. Det er et presserende behov for innovative terapeutiske tilnærminger, da lovende resultater observert in vitro ofte ikke viser effekt in vivo under fase I-studier. En av årsakene til denne uoverensstemmelsen kan være den begrensede evnen til pasientavledede immortaliserte cellelinjer, dyrket i monolagskulturer, for å reflektere de komplekse cellecelleinteraksjonene og genetiske egenskapene til foreldretumoren. Gitt den høye inter- og intratumorale heterogeniteten til GBM 8,9, er personlige målrettede terapier foretrukket og kan holde løfte om fremtidige applikasjoner. I motsetning til 2D-adherente cellelinjer har organoider evnen til å beholde egenskapene til foreldrevevet21, men komplekse celle-celle-interaksjoner mellom svulsten og den normale hjernen er av avgjørende betydning og kan potensielt bli oversett av denne modellen. Manuell generering av PUD er imidlertid en tidkrevende prosess, og vevsskader forårsaket av klemming med skalpeller under skjæring kan hindre vellykket PUD-vekst. Derfor ble en automatisert metode optimalisert ved hjelp av et vevshakker for å generere høyere antall PUDer med redusert tid og krefter. I tillegg viste vi at den generelle sprednings- og apoptosefrekvensen ikke var forskjellig mellom de to tilnærmingene.
C-tilnærmingen er enkel, enkel å implementere og gjør det mulig å generere et større antall PUD-er (figur 3). Rotasjonen av vevet mellom andre og tredje runde med hakking ble identifisert som et kritisk trinn i protokollen. På dette stadiet har vevet allerede mistet sin integritet og kan lett falle fra hverandre, noe som resulterer i større stykker som krever ytterligere kutting eller manuell disseksjon under mikroskopet. Mens den automatiserte helikoptermetoden tillater en forhåndsinnstilt skjærestørrelse med større nøyaktighet, mangler den manuelle tilnærmingen presisjon for å bestemme størrelsen på PUD-er, noe som fører til ujevnt formede og store PUD-er, noe som er en ulempe for sammenlignende legemiddelscreening (figur 2). Likevel, med den foreslåtte metoden, oppnås ikke standardisering av celletall per PUD, noe som potensielt utgjør en ulempe for standardiserte legemiddelscreeningsprotokoller. Fordelene og ulempene ved forskjellige organoidgenereringsteknikker 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 og deres søknader er oppsummert i tabell 3.
GBM-vev kan variere i konsistens, alt fra seig (infiltrasjonssone) til myk (nekrotisk kjerne), noe som kan utgjøre utfordringer for den automatiserte chopper-tilnærmingen. Hvis vevet er for tøft, kan hakkeren klemme og skade det, mens for bløtvev kan bli klemt. Det valgte vevet viste særegne egenskaper, inkludert et mellomliggende nivå av fasthet, sporadisk med en rosa-gråaktig farge i stedet for å manifestere brun eller gul misfarging. Vev med svampaktig og lett smuldrende tekstur viste overlegen konservering i agaroseblokkene, mens svært delikat og flytende tumorvev ble utelatt fra prøvetakingsprosedyren. Helikoptertilnærmingen muliggjorde imidlertid en vellykket generering av et høyere antall PUD-er sammenlignet med den manuelle tilnærmingen, selv med vev med suboptimal konsistens. Nøkkelløsningen er å opprettholde nært samspill med kirurgen som utfører tumorreseksjonen for å behandle vev fra forskjellige områder av svulsten. I tilfeller av suboptimal vevskonsistens var manuell omarbeiding av vevet under mikroskopet et nyttig tillegg etter hakking. For å ta hensyn til heterogenitet ble tumorvevet opprinnelig delt inn i seks segmenter, hver senere halvert for enten C- eller M-tilnærmingen. Innenfor disse seks distinkte seksjonene forventes en betydelig grad av heterogenitet. Videre, selv innenfor PUD fra samme seksjon eller brønn, er tilstedeværelsen av forskjellige delpopulasjoner plausibel.
Som bevis på konsept ble proliferasjons- og apoptosedata rapportert fra to pasienter med GBM og en pasient med LGG, som ikke viser noen signifikante forskjeller mellom de to metodene. Genereringen av PUD er ikke begrenset til svært ondartede hjernesvulster, men kan også brukes på LGG. Denne studien fremhever at LGG sjelden viser vekst i 2D-kultur, noe som gjør utviklingen av en nøyaktig modell for studien svært verdifull. Denne protokollen tar sikte på å demonstrere allsidigheten til denne tilnærmingen når det gjelder å generere PUDer fra GBM så vel som LGG raskt og effektivt.
Samlet sett kan PUD i fremtiden brukes til pasientorientert preterapeutisk testing av målrettede terapier i ondartede hjernesvulster. Å gi en rask og effektiv metode for individualisert legemiddelscreening er avgjørende, da tumorprogresjon skjer raskt, og bergingsbehandlingsalternativer er desperat nødvendig. Som et neste skritt kan PUD-modellen evalueres med ulike immunterapeutiske tilnærminger for bedre å etterligne reelle behandlingsresponser. I fremtiden kan PUD brukes til å trekke sofistikerte konklusjoner om behovet for videre utforskning og evaluering av terapier i en klinisk setting.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Interdisciplinary Center of Clinical Research (IZKF, B-450) Würzburg, Bavarian Center of Cancer Research (BZKF) og publikasjonen støttet av Open Access Publishing Fund ved Universitetet i Würzburg. Vi takker Dagmar Hemmerich og Siglinde Kühnel, begge seksjon for eksperimentell nevrokirurgi, Nevrokirurgisk avdeling, Universitetssykehuset Würzburg, for teknisk støtte. Figur 1 er laget ved hjelp av www.biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
References
- Gatto, L., et al. IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment. Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).
- Buckner, J. C., et al. Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma. N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).
- Grochans, S., et al.
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma). N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Herrlinger, U., et al. Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).
- Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial. Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).
- Desbaillets, N., Hottinger, A. F. Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective. Cancers (Basel). 13 (15), 3721 (2021).
- Gularyan, S. K., et al. Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS). Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
- Timerman, D., Yeung, C. M. Identity confusion of glioma cell lines. Gene. 536 (1), 221-222 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
- Hubert, C. G., et al. A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Nickl, V., et al. Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields). Cancers (Basel). 14 (21), 5177 (2022).
- Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: http://lafayetteinstrument.com (2023).
- Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy. Front Oncol. 10, 604121 (2020).
- Golebiewska, A., et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology. Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).
- Bougnaud, S., et al. Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma. Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Kato, H., Ogawa, T. A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments. J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).
- Teyler, T. J.
- Schulz, E., et al. Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).
- Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors. STAR Protoc. 1 (3), 100192 (2020).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Li, X., et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Zhao, Z., et al.
- Toh, Y. C., et al. A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).
- Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L.
